新型争论贪噬菌Variovorax paradoxus S110的细胞色素P450酶的异源表达及催化特性分析

细胞色素P450单加氧酶(Cytochrome P450 monooxygenases)是一种广谱催化剂,可以催化多种类型反应而参与生物体外源物质代谢与天然产物的合成。为丰富P450作为合成生物学的酶元件库,并探索新型催化反应,利用生物信息学手段从争论贪噬菌Variovorax paradoxus S110中挖掘出一种新型电子自供体细胞色素P45(VpMO)单加氧酶,属于CYP116B家族,它可以在大肠杆菌Escherichia coli异源可溶表达。酶学性质研究表明P450_(VpMO)最适pH和最适温度分别为8.0和45℃,并且在温度低于35℃时具有良好的稳定性,K_m值为0.458 mmol/L,k_(cat)为2.438 min~(-1);重要的是重组P450_(VpMO)可以催化一系列包含污染物的含甲氧基底物进行脱甲基反应,其中对4-甲氧基苯乙酮的脱甲基反应转化率高达91%。相比于其他CYP116B家族的P450酶,P450_(VpMO)表现出较强的酶活性,这为后期进一步研究P450_(VpMO)提供了基础。     

茶树菇非特异性过氧化酶的研究进展

惰性碳氢键(C—H)的选择性单加氧反应是有机合成的主要挑战之一,目前主要采用化学法和酶法催化,化学催化法往往反应条件苛刻,而酶催化法相对温和。来自茶树菇(Agrocybe aegerita)的非特异性过氧化酶(AaeUPO)是一类以H₂O₂为共底物的单加氧酶,可催化脂肪族和芳香族化合物的羟基化、环氧化及脱烷基等反应,因其具有电子传递过程简单、催化活性高、底物谱广等优点,是催化单加氧反应的高效生物催化剂。近年来,AaeUPO在分子改造、底物谱扩展和级联催化系统的应用等领域取得了一定进展,显示出较好的工业应用潜力。本文综述了AaeUPO的晶体结构及其在蛋白质工程方面的研究进展,重点探讨了AaeUPO催化的反应类型、底物范围以及级联催化系统构建中所面临的问题和挑战。     

生物分子机器——甲烷单加氧酶的研究进展

甲烷氧化菌中的甲烷单加氧酶能够在生理条件下选择性地以甲烷和氧气为底物生成甲醇,麻省理工学院的Lippard教授称它为"神奇的生物分子机器"。本文重点对生物分子机器甲烷单加氧酶的结构、编码基因及调控机制、催化反应机理等进行了综述,此外也简要介绍了甲烷单加氧酶的产生菌甲烷氧化菌的研究历史及分类。生物分子机器甲烷单加氧酶可催化甲烷氧化成甲醇,不仅为甲醇的生产提供了一种新颖的生产方法,而且对生物分子机器的设计也有借鉴意义。     

甲烷单加氧酶的催化性能和活性中心结构

甲烷单加氧酶是甲烷利用细菌代谢甲烷过程中的重要酶系,它能够催化烷烃羟基化和烯烃环氧化反应;还能催化降解氯代烃类,可用于环境中氯代烃类化合物污染的治理,是具有广泛应用前景的生物催化剂．甲烷单加氧酶是含有μ－氧桥双核铁催化活性中心的蛋白,它的研究对分子氧的活化、化学催化剂的设计具有重要意义．文章介绍了甲烷单加氧酶催化性能和机理的最新研究进展．     

细胞色素P450在植物三萜和甾醇骨架修饰中的功能研究进展

植物三萜类化合物在植物生长发育、抵御逆境胁迫与病虫害、生物间相互作用以及传递信息等方面发挥重要作用,植物甾醇具有重要的药用价值.细胞色素P450单加氧酶(CYP450)是参与植物代谢的最大酶家族,在三萜及甾醇骨架结构多样化及功能化修饰中具有关键作用.到目前为止,研究发现约有80个CYP450参与植物三萜代谢,包括亚家族CYP51H, CYP71A, D, CYP72A, CYP81Q, CYP87D, CYP88D, L, CYP93E, CYP705A, CYP708A和CYP716A, C, E, S, U, Y,它们参与包括特定病原体的化学防御功能和药理活性的三萜及其皂苷类化合物的代谢.亚家族CYP51G, CYP85A, CYP90B-D, CYP710A, CYP724B和CYP734A与甾醇和类固醇激素的生物合成有关.本文针对CYP450基因在三萜及甾醇化合物形成过程中不同位点的修饰功能进行概述,重点探讨了陆地植物CYP450基因11个家族的进化及在双子叶、单子叶植物中五环三萜物质合成过程中的功能.以期为充分利用具有重要价值的抗肿瘤、抗艾滋病的三萜物质的合成生物学的研究及其代谢调控提供进一步的理论依据.     

微生物次生代谢产物生物合成中的拜耳-维立格单加氧酶

拜耳-维立格单加氧酶是一类可以催化酮生成酯以及硫等杂原子氧化的黄素依赖的单加氧酶,在合成化学和生物催化等工业领域有重要的应用前景。本文总结了微生物次生代谢产物生物合成途径中涉及的拜耳-维立格反应,讨论了其反应的特点和催化这些反应的拜耳-维立格单加氧酶的氨基酸序列特征,为拜耳-维立格单加氧酶的蛋白质工程改造提供参考。     

Baeyer-Villiger单加氧酶非保守Hinge影响酶的催化活性和立体选择性

Baeyer-Villiger单加氧酶是一种重要的生物催化剂,可用于合成一系列有价值的酯和内酯化合物。通过序列比对和晶体结构分析推测连接NADPH结构域和FAD结构域的一段非保守Hinge可能在酶对底物识别和催化氧化过程中扮演着重要角色。在以环己酮单加氧酶为模型的研究中发现,对该Hinge结构进行同源序列替换得到的突变体几乎完全丧失了催化活性,证明了其整体水平的重要性。丙氨酸扫描突变揭示其中一些位点对酶的功能有显著影响:K153位点的改变使酶的活性下降,立体选择性却更优化;L143位点的改变对酶的活性影响较小,却降低了立体选择性;L144位点的改变则同时大幅度削弱酶的活性和立体选择性。将同样的方法运用在苯丙酮单加氧酶中,我们得到了相似的结论,证明这些位点的重要功能在Baeyer-Villiger单加氧酶家族中有一定的普遍性。这一研究增进了对Baeyer-Villiger单加氧酶的结构与功能关系的认识,有助于底物结合口袋的精确描述和Baeyer-Villiger单加氧酶催化图景的进一步细化,对未来相关的理性设计和定向改造研究提供了借鉴。     

AA10家族裂解多糖单加氧酶的模块化组成及底物选择性的研究进展

AA10家族裂解多糖单加氧酶(lytic polysaccharide monooxygenases, LPMOs)主要分布于细菌中,因其具有催化纤维素和几丁质等结晶多糖氧化降解的特性,在工业生物质转化过程中具有极强的应用潜力,从而受到广泛关注。然而,AA10家族不同LPMOs作用的底物种类及氧化位点和氧化产物也不尽相同,LPMOs的结构与组成对其底物选择性的影响机制有待进一步探究。因此,本文综述了AA10家族LPMOs的模块化结构组成及其催化机制,梳理了AA10家族LPMOs的底物谱,系统总结了AA10家族LPMOs的结构、关键作用残基及多模块组合对底物选择性影响的最新进展,并展望了LPMOs在生物质转化和生物燃料工业中广阔的应用前景。     

P450酶系中高效电子传递链的构建及应用

细胞色素P450作为单加氧酶的主要成员,能够在多种化合物中引入氧分子,催化包括羟化在内的多种反应。在级联的氧化还原反应中,需特定的电子传递链将氧原子中的电子传递至P450单加氧酶的亚铁红素结构中,并最终催化底物氧化,而电子传递体系的低效性往往成为整个反应的限速步骤。本文在介绍P450单加氧酶电子传递链基本结构的基础上,着重阐述对于细胞色素P450酶系中电子传递链未知或者内源性电子传递效率较低的情况下,利用DNA重组技术构建高效的电子传递链从而提高P450单加氧酶的催化效率相关研究进展,主要从细菌及真核细胞线粒体电子传递链(ClassⅠ)及真核生物细胞色素C还原酶CPR(ClassⅡ),天然融合电子传递链及人工融合蛋白电子传递链的构建及其应用展开。     

老黄酶OYE家族的蛋白质工程的研究进展

老黄酶OYE家族酶是一类广泛分布的能够催化烯烃化合物不对称还原的酶类,其能够用于多种手性化合物的制备。分析了OYE家族酶的系统分类及催化反应类型,针对目前该类酶在应用过程中出现的稳定性差、活性低及底物特异性强等问题,综述了蛋白质工程方法对该类酶进行改造的研究进展,为深入研究该家族酶的催化机制及进一步改造提供参考,同时为进一步拓展OYE酶的工业化应用奠定基础。     

6-羟基-3-琥珀酰吡啶单加氧酶HspB的结构研究

在蛋白晶体结构难以获得的情况下,通过设计突变体来获取6-羟基-3-琥珀酰吡啶单加氧酶Hsp B的结构信息。首先获取Hsp B蛋白的同源序列并进行比对,之后对Hsp B蛋白进行同源建模和从头建模,并与底物2,5-二羟基吡啶(HSP)进行对接模拟;通过分子模拟、序列比对和参考同源蛋白晶体三种方式,设计并构建Hsp B酶的25个突变体;通过突变体的表达纯化和酶动力学常数测定来研究Hsp B的结构性质。根据实验结果,推测FAD的正确结合在稳定Hsp B蛋白结构中具有重要的作用,同时推测底物HSP和辅酶NADH处于同一活性中心并与不同位点相互作用。吡啶衍生物是极具工业价值的化合物,生物催化法是合成吡啶衍生物的有效途径,而吡啶衍生物的生物催化研究较少,通过考察突变体的性质,推测了Hsp B的部分结构信息,为此类吡啶单加氧酶的工业改造和应用奠定了基础。     

几丁质脱乙酰酶的研究进展

几丁质是自然界中含量仅次于纤维素的第二大多糖,壳聚糖作为几丁质脱除乙酰基的衍生物,由于其较好的溶解性得到了广泛的应用。本综述通过搜集比对不同来源的多种脱乙酰酶蛋白序列,运用生物信息学方法对其催化活性中心结构域进行深入挖掘分析,阐明了多种脱乙酰酶的生物来源、催化机制和反应条件等方面的异同点。结果表明,目前研究的脱乙酰酶多来源于真菌和昆虫,大多属于CE4家族,具有NodB等催化活性中心,比较容易与聚合度3的乙酰化低聚糖反应,不易催化难溶性多糖,且该类酶多在pH 8.0左右、40-70℃的环境下酶活达到最大,不同二价金属离子对不同酶的影响不同。最后,提出了从海洋宏基因组文库中快速特异地筛选新酶、分析酶解机理并进行分子改造等研究的新方向,旨为今后该领域科研人员研发高效、高特异性的脱乙酰酶提供了新思路。     

老黄酶OYE家族的蛋白质工程的研究进展 *

老黄酶OYE家族酶是一类广泛分布的能够催化烯烃化合物不对称还原的酶类,其能够用于多种手性化合物的制备.分析了OYE家族酶的系统分类及催化反应类型,针对目前该类酶在应用过程中出现的稳定性差,活性低及底物特异性强等问题,综述了蛋白质工程方法对该类酶进行改造的研究进展,为深入研究该家族酶的催化机制及进一步改造提供参考,同时为进一步拓展OYE酶的工业化应用奠定基础.     

APOBEC家族:介导天然抗病毒免疫的新型宿主细胞因子

天然免疫在机体抵御病毒感染的过程中发挥着重要的功能。近年来,一些介导天然免疫的新型宿主细胞因子陆续被发现,其中APOBEC家族(apolipoprotein B mRNA editingenzyme-catalytic polypeptide family,载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽家族)作为一种具有独特抗病毒机制的蛋白质分子     

基于量化计算和分子动力学模拟深入探究细胞色素酶P_(450)4Z1催化月桂酸的区域选择性

细胞色素酶P_(450)4(CYP4)家族是人类第二大CYP家族,除CYP4F8、CYP4F12、CYP4X1和CYP4Z1外,大多数CYP4酶都是ω-羟化酶。CYP4Z1是CYP4家族的一个新成员,是目前研究甚少的"孤儿"酶之一,它的过表达会促进乳腺癌中的肿瘤血管生成和生长,并与某些高恶性肿瘤及愈后不良相关,是癌症治疗的潜在药物靶标。月桂酸在各种癌症的治疗和术后康复的调节中发挥重要作用。据报道,月桂酸的链内羟基化由细胞色素CYP4Z1催化,但其催化机制尚不清楚。在这项研究中,使用了量化计算、同源建模、分子对接、分子动力学模拟、自由能分析和主成分分析等方法,深入研究月桂酸羟基化的代谢特征。基于血红素和月桂酸模型的量化计算表明,潜在的羟基化位点的夺氢能垒范围为56.2至85.1 kJ/mol,其中ω-4位点的能垒最低。分子对接的结果表明,活性位点附近的Ser383、Ser113在稳定月桂酸的过程中发挥重要作用。分子动力学模拟结果表明,血红素平面与π-π相互作用形成的共同相互作用,促使ω-4位点更靠近活性氧,这与研究观察结果是一致的。当参与形成π-π相互作用的Phe313突变为Ala313时,对催化选择性的影响消失。自由能分析表明,CYP4Z1活性位点周围的芳香族氨基酸对催化选择性发挥决定性作用。本文探究细胞色素酶P_(450)4Z1主要催化月桂酸的ω-4位点,决定该区域选择性的因素是芳香族氨基酸的π-π相互作用。     

纤维素酶家族及其催化结构域分子改造的新进展

纤维素酶的分子改造是其催化性能改进及催化效率提升的重要手段。近年来,组学技术与结构测定技术的迅速发展,人们已建立了包括糖苷水解酶(Glycoside hydrolase,GH)在内的碳水化合物活性酶组分数据库。通过对同一蛋白家族进行序列比对、分子进化分析与祖先基因重构,以结构模建分析为指导的纤维素酶分子改造,可以明显缩小序列或结构的搜索空间,加快酶分子改造的速度,增大理性设计成功的概率;同时针对催化中心活性架构的分析可以进一步阐明纤维素酶的催化机理与酶分子持续性降解机制。文中主要对纤维素酶家族及其催化结构域的分子改造取得的最新进展作了综述。在后基因组时代基于蛋白质家族中的海量数据分析,以其保守结构信息为指导的理性设计,将会成为纤维素酶分子改造的重要方向,从而推动生物质转化工艺的快速发展。     

含硒酶与非酶作用机制

在微生物、植物和动物体内,硒的功能形式多种多样,但其作用机制可归纳为酶与非酶两个方面,含硒酶的作用主要有：谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）家族催化超氧化物还原,防止细胞膜的氧化损伤;脱磺酶（ID）家族调节甲状腺激素代谢,硫氧还蛋白还原酶（TDR）家族催化硫氧还蛋白（Trx）还原,TDR／Trx系统为细胞的生长和分化所必需,硒的非酶化学保护作用体现在：可诱导一些蛋白激酶的富半胱氨酸结构域发生氧化还原修饰,增强免疫功能等作用,硒在植物中的作用机制具有许多特殊性。     

CYP1B1酶抑制剂的最新研究进展

细胞色素P450(CYP)1B1是CYP1家族的一个亚型,参与多环芳香烃等前致癌物的代谢活化,并在17-β-雌二醇诱导的乳腺癌发生与发展过程中起到了关键性作用。该酶在肿瘤组织中的特异性高表达及在肿瘤细胞耐药中的作用,也已被大量研究证实。该酶的特异性分布及在肿瘤发生与发展中的重要地位,使得它成为抗肿瘤药物研究中的新靶点。其抑制剂研究,在肿瘤预防及克服肿瘤耐药方面具有重要意义。本文综述了近二十年来发现的CYP1B1酶的强选择性抑制剂,同时分析了它们的构效关系,对发现具有肿瘤预防及逆转肿瘤耐药作用的酶抑制剂提供了理论依据。     

丝状真菌溶解性多糖单加氧酶的研究进展

溶解性多糖单加氧酶(lytic polysaccharide monooxygenases, LPMOs)是近些年才发现的一种蛋白,能够催化多糖葡萄糖苷键的氧化裂解,显著促进丝状真菌纤维素酶系对木质纤维素的降解作用。本综述对溶解性多糖单加氧酶发现过程、晶体结构、反应机制、活性位点和区域选择性、与纤维素酶的协同作用等方面分别进行了阐述,并对溶解性多糖单加氧酶对于木质纤维素降解方面的应用进行了论述。     

工业酶蛋白研究的重要进展

作为生物催化剂的核心,工业酶的研究在近年来取得了许多重要的进展,特别是具有重要意义的新酶发现、酶家族研究、酶的分子改造等领域出现了许多突破性的进展。