锌富集对蛹虫草菌丝体内虫草素、腺苷含量的影响

为了解蛹虫草菌丝体对锌的富集特性,研究锌富集对蛹虫草菌丝体内虫草素、腺苷含量的影响,通过在液体培养基中添加不同质量浓度的锌离子(0~35 g/L),探讨其对蛹虫草菌丝生物量、菌丝体内锌积累量,以及锌的富集对菌丝体内虫草素、腺苷含量产生的影响。结果表明:在0~35 g/L锌离子的梯度范围内,蛹虫草菌丝生物量与锌质量浓度呈显著负相关,锌质量浓度35 g/L为蛹虫草菌丝生长极限浓度。锌质量浓度40.0 g/L及以上菌丝生长受到完全抑制。菌丝体内锌的积累量随锌质量浓度的增加而显著升高,锌质量浓度为35.0 g/L时锌积累量可达到193.87 mg/g(干重)。蛹虫草菌丝体内腺苷的含量随锌质量浓度的增加而降低,在锌质量浓度为5 g/L时降幅显著,腺苷含量仅为对照组的17.24%,之后腺苷含量变化趋势趋于水平。腺苷含量的降低可能是因为锌的富集干扰了蛹虫草菌丝体内初生代谢的正常进行。虫草素的含量随锌质量浓度的增加而显著降低,可能是由于其直接前体腺苷含量的降低,或是Zn离子的加入,使得某些被刺激的酶和基因通过转录因子影响了虫草素的合成。     

液体培养蛹虫草虫草素和腺苷的代谢量

为提高虫草素和腺苷的代谢量,用高效液相色谱法作检测手段,以二者含量为检测指标,对液体培养的氮源种类、氮源水平、碳源水平、动态变化、培养体系的虫草素及腺苷含量和总量进行研究,结果表明:不仅蚕蛹粉,豆粕和豆粉也是很好的氮源;培养液以3%氮源、4%碳源为佳;振荡培养8d,培养液中虫草素总量是菌丝体中虫草素总量的6倍多;振荡培养7~9d,可使每瓶培养物的虫草素和腺苷总量达到10mg以上。     

虫草制品中腺苷和虫草素含量的RP-HPLC分析

采用超声提取,反相高效液相色谱方法分析了各种虫草制品中的腺苷和虫草素的含量,以含0．05mol／L 的磷酸二氢钾：甲醇（85／15,V／V）作为流动相。检测波长为260nm。进样量为10μL,40℃条件下检测。在5mg／L到250mg／L的浓度范围内呈线性相关。研究显示利用蒸馏水在60℃超声提取20min,腺苷和虫草素的回收率在85％-95％之间。     

蛹虫草中虫草素、虫草多糖综合提取工艺研究

以蛹虫草为材料．采用超声波水提法、超声波醇提法、水热回流法和醇热回流法4种提取方法选择虫草素和虫草多糖的最优提取办法．并用正交试验方法考察水热回流法中提取温度、提取次数、提取时间、料液比4个因素对虫草素、虫草多精综合提取效率的影响．以确定从蛹虫草中综合提取虫草素、虫草多糖最佳工艺。结果表明．水热回流法是提取虫草多糖和虫草素的最优提取方法．其最佳工艺条件为：用10倍量的水于80℃热回流提取3次．每次90min。     

蛹虫草中虫草素的提取及纯化工艺研究

目的:优化从蛹虫草中提取、纯化虫草素的方法并鉴定其纯度.方法和结果:通过3种提取方法的比较,确定了以恒温水浴法作为虫草素规模化提取方法,最佳提取条件为45℃、80％乙醇;同时,确定了ML-7大孔树脂纯化虫草素的工艺,采用该工艺虫草素纯度可达到92％以上,并对纯化虫草素和标准品进行了比较鉴定.结论:该方法提取、纯化的虫草素纯度高,适于虫草素的规模化生产.     

高速逆流色谱分离制备蛹虫草中虫草素和N6-(2-羟乙基)-腺苷

采用高速逆流色谱（HSCCC）技术从蛹虫草子实体粗提物中分离制备高纯度虫草素和N⁶-(2-羟乙基)-腺苷。利用高效液相色谱（HPLC）测定目标产物在溶剂体系中的分配系数,优化HSCCC分离虫草素和N⁶-(2-羟乙基)-腺苷的溶剂体系,确定了以乙酸乙酯-正丁醇-1.5%氨水（1:4:5,V/V/V）为HSCCC的两相溶剂体系,并运用此溶剂体系,上相为固定相,下相为流动相,主机转速850r/min,流动相流速为1.5mL/min,检测波长为254nm条件下进行分离制备,在250min内从200mg蛹虫草子实体粗提物中一步分离得到10.8mg纯度99%的虫草素和6.1mg 纯度98%的N⁶-(2-羟乙基)-腺苷。该方法简便、快速,为虫草素和N⁶-(2-羟乙基)-腺苷的大量制备建立了基础。     

蛹虫草子实体中海藻糖含量的测定

为分析食用菌中海藻糖的含量,以蛹虫草子实体为材料,比较了提取溶剂、提取方式及提取时间等条件对海藻糖提取效果的影响,确定海藻糖分析的前处理方法为：1g子实体粉中加入100mL 90%乙醇热回流提取1h。采用高效液相色谱法测定海藻糖,优化后的色谱条件为：SUGAR SP0810柱（300mm×8mm）,超纯水洗脱,流速0.5mL/min,柱温70℃,示差折光检测器检测,进样量10μL。方法学考察结果表明,该方法准确度高,稳定性、精密度、重现性好,对海藻糖标准品的检测特异性良好,适用于蛹虫草子实体中海藻糖含量的     

蛹虫草子实体中甘露醇含量的测定

建立了HPLC法测定蛹虫草子实体中甘露醇含量的方法。通过比较提取溶剂、提取方式及提取时间等条件对甘露醇提取效果的影响,确定甘露醇分析的前处理方法为:1g子实体粉中加入150 mL 90%乙醇热回流提取1h。采用SUGAR SP0810柱(300 mm×8 mm)为分析柱,超纯水为流动相,流速1.0 mL/min,柱温70℃,示差折光检测器检测,进样量10μL。甘露醇在0.04-9.9 mg/mL范围内线性关系良好,回归方程为y=103860x+2183.9(r=0.9999),平均回收率为104.27%,RSD=2.19%(n=9)。本方法准确度高,稳定性、精密度、重现性好,适用于蛹虫草子实体中甘露醇含量的分析。     

微波法从蛹虫草中提取虫草多糖的技术研究

以蛹虫草(Cordycepsmilitaris)为原料,采用微波法对其虫草多糖的提取工艺进行了探讨。通过对其微波功率、提取时间和料水质量比进行正交优化,得到一个最佳提取工艺条件为:微波功率700 W、提取时间2.0 min、料水质量比1:60。通过正交优化的多糖得率为3.78%,比常规热水浸提法高出0.79个百分点。故此,利用微波法从蛹虫草中提取虫草多糖具有得率高、能耗小、操作简单等优点。     

大孔树脂分离纯化蛹虫草深层发酵液中虫草素的工艺研究

通过比较10种不同大孔树脂吸附蛹虫草深层发酵液中虫草素的性能,筛选出合适的大孔树脂H103,并对大孔树脂H103的吸附和解吸条件进行了考察。实验结果表明,上样吸附前调节pH值为9,上样浓度为0．2mg·mL^-1,吸附流速为2BV·h^-1时,大孔树脂H103对蛹虫草深层发酵液中的虫草素有良好的吸附性能;解吸时先用去离子水洗去部分杂质,再用40％的乙醇对虫草素进行洗脱,可以得到较好的效果。     

不同培养条件和前体对蛹虫草液体发酵产虫草素的影响

蛹虫草能产生虫草素等多种活性物质。为考察不同液体发酵方式及添加前体物质对虫草素积累的影响,选用蛹虫草08Y1菌株,通过光照振荡、光照静置、黑暗振荡、黑暗静置四种培养条件和添加前体物质（腺嘌呤1g/L+甘氨酸16g/L）,发酵16d后检测虫草素和腺嘌呤含量。结果表明：08Y1菌株在黑暗振荡培养条件下,虫草素积累达1,015.0mg/L,腺嘌呤利用率达98.5%,说明黑暗振荡培养并添加前体物质是提高虫草素产量的有效方法。     

基于蛹虫草转录物组学的虫草素生物合成相关基因的表达和功能分析

蛹虫草Cordyceps militaris是我国著名的中药,而虫草素是蛹虫草重要的生物活性成分之一。通过转录物组分析野生型C.militaris、虫草素高产菌株C.militaris GYS60和低产菌株C.militaris GYS80虫草素生物合成相关基因的表达和功能变化。利用Illumina NovaSeq 6000测序获得3株菌株的转录物组数据,以鉴定差异表达基因。与C.militaris相比,在GYS60和GYS80中,分别有145和470个上调基因及96和594个下调基因;GYS60与GYS80相比,GYS60有306个上调基因和207个下调基因。这些基因经过GO和KEGG分析,与C.militaris相比,GYS60和GYS80分别有10和8个与嘌呤途径相关的基因差异表达;与GYS80相比,GYS60有12个基因差异表达。定量聚合酶链式反应验证8个关键酶的基因表达与转录物组分析一致。在GYS60中,参与虫草素生物合成的嘌呤核苷酸代谢中的氧化还原酶(CCM＿07507,cmORE)、3′,5′-环AMP磷酸二酯酶(CCM＿02777,cmAPE)、转移酶(CCM＿0472...     

UPLC-MS/MS同时测定白及中6个指标成分的含量

建立UPLC-MS/MS同时测定白及药材中的α-异丁基苹果酸(B6)、4-(葡萄糖氧基)-肉桂酸葡萄糖氧基苄酯(B12)、1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯(B14)、1-[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸(B17)、二氢菲1(B19)和1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯-2-[4-O-肉桂酰基-6-O-乙酰基]葡萄糖苷(B23)含量的分析方法,采用Acquity UPLC BEH C18柱(2.1 mm×50 mm,1.7μm);流动相0.1%甲酸乙腈溶液(A)-0.1%甲酸水溶液(B)为流动相,梯度洗脱,采用电喷雾离子源(ESI),多反应离子监测(MRM)模式进行正负离子同步监测。各指标成分之间分离度良好,在选定的浓度范围内线性关系良好(r≥0.9974),平均加样回收率为98.07%~103.19%,RSD3.04%为,重复性、精密度和稳定性良好。此方法操作简便,快速,灵敏度高,可用于白及药材中主要活性成分的含量测定,并为白及药材的质量控制提供了新方法。     

维生素B_1、B_6和生长激素2,4‐D对蛹虫草液体发酵虫草素产量的影响

分别研究了不同添加浓度的维生素B1、B6和2,4‐D(2,4‐二氯苯氧乙酸)3种微量物质对蛹虫草Cordyceps militaris液体发酵中虫草素产量的影响。结果表明在设置的几个添加浓度梯度中维生素B1、B6和2,4‐D均能提高虫草的产量,其中维生素B1和B6的最佳添加浓度均为0.83g/L,2,4‐D的最佳添加浓度为0.015mg/mL。此外,高温灭菌对维生素B1、B6和2,4‐D对蛹虫草发酵液中虫草素产量有影响:高温灭菌可使部分维生素B1分解,高温灭菌前添加维生素B1比灭菌后添加更有利于虫草素产量的增加,虫草素的产量提高了19.9%,表明维生素B1的分解产物具有更好的促进虫草素合成的作用。     

大孔吸附树脂AB-8和十八烷基硅胶色谱分离纯化蛹虫草发酵液中虫草素工艺研究

主要研究了从蛹虫草发酵液中提取虫草素的工艺,确定了大孔吸附树脂AB-8及十八烷基键合硅胶反相层析柱对蛹虫草发酵液中虫草素的分离条件;吸附最佳工艺条件为上样液p H6,上样浓度0.4mg/m L,上样量5BV,吸附流速1.0BV/h;解吸最佳工艺条件包括解吸液20%乙醇,解吸体积15BV,解吸流速4BV/h。得到的解吸液进一步以十八烷基键合硅胶分离,条件为上样液p H6,梯度洗脱,流动相为p H6的水和p H6的乙醇。洗脱液通过结晶和重结晶得到精制虫草素。三步得到的虫草素纯度分别达到40%、90%和99%以上。     

一种测定蛹虫草中虫草酸含量的酶标仪微量反应方法

研究和建立一种基于酶标仪-96孔板高通量测定虫草酸含量的检测方法,并对该方法进行性能评价。以酶标仪为检测仪器,在96孔板内按照设定反应条件微量加入样品和试剂进行显色反应,利用酶标仪测定吸光度值并计算虫草酸含量。通过检测精密度、重复性、回收率,并与分光光度计法进行比较,综合评价该方法的准确度、精确度。结果表明,测定数据具有较高的精密度(样品CM1的RSD值0.829%;样品CM2的RSD值1.772%)、重复性(标准样品B40的RSD值2.061%;样品CM2的RSD值1.599%)、回收率(平均回收率99.24%,RSD值3.666%),测定结果与分光光度法检测结果无显著差异(P>0.05)。结果表明,酶标仪微量法测定准确、重复性好,并可大大减少样品和试剂的用量,该方法方便、快捷、高效,可以替代分光光度法用于虫草酸含量的测定。     

HPLC同时测定药用白菊花中绿原酸、木犀草素、芹菜素和金合欢素

采用高效液相色谱法(HPLC)建立同时测定药用白菊花中绿原酸、木犀草素、芹菜素和金合欢素含量的方法,样品采用离子液体分散液相微萃法提取。采用Phenomenex C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm);流动相:甲醇-0.2%冰醋酸溶液(65∶35);检测波长350 nm;柱温35℃;流速0.8 mL/min。绿原酸、木犀草素、芹菜素和金合欢素的质量浓度与峰面积分别在0.0005~100(r=0.9999)、0.00095~190(r=0.9999)、0.0008~160(r=0.9997)、0.00061~122μg/mL(r=0.9996)呈良好的线性关系;回收率分别为90.52%~100.44%、90.88%~98.58%、94.40%~98.82%、93.68%~100.54%。该方法快速,简便,重复性好,适合于同时测定药用白菊花中绿原酸、木犀草素、芹菜素和金合欢素的含量。     

冬虫夏草菌和蛹虫草菌的研究现状、问题及展望

冬虫夏草菌和蛹虫草菌是两种最著名的虫草菌。从分类学地位、分布、生活史及有性生殖类型、寄主范围、遗传多样性、分子遗传学和基因组学、生态学、人工栽培及产品开发等方面对冬虫夏草菌和蛹虫草菌的研究现状进行总结,指出了研究中存在的一些问题,并对研究前景进行展望。     

基于CRISPR/Cas9的蛹虫草无抗性标记转化技术的构建

传统的真菌遗传改造方法需要抗性标记,但目前可使用的抗性标记基因非常有限,导致蛹虫草遗传改造面临着抗性基因数量不足的问题,且尚未能实现多个目的基因的连续敲入或敲除,因此在蛹虫草中建立高效的无抗性标记转化技术显得尤为重要。本研究利用CRISPR/Cas9技术对蛹虫草的Cmura5基因进行编辑,通过内源5S-1、5S-2和U6启动子对gRNA进行转录,结果表明使用U6启动子对Cmura5基因的编辑效率达到了100%。在尿嘧啶缺陷型菌株Cmura5^-中,回补野生型Cmura5基因可实现正向选择,即野生型菌株可以在基础培养基上生长。利用设计的同源臂对Cmura5基因进行回收,可以实现反向选择,即野生型在含有5-氟乳清酸培养基中生长受到抑制。以尿嘧啶缺陷型Cmura5^-为出发菌株,利用无抗性标记转化技术,导入一个重组质粒效率为75%;连续导入2个重组质粒效率为80%;连续导入3个重组质粒效率为100%;连续导入4个重组质粒效率为50%,平均转化效率为75.7%,每一轮的标记回收率均在100%,实现了4个外源基因在蛹虫草中同时表达。     

基于液相色谱-串联质谱技术（LC-MS/MS）检测癫痫小鼠毛发中内源性大麻素（2-AG、AEA）的含量

摘要 目的：基于液相色谱-串联质谱技术（LC-MS/MS）对癫痫小鼠毛发中内源性大麻素（2-AG、AEA）进行含量检测。方法：匹鲁卡品腹腔注射方法建立小鼠癫痫模型,采用LC-MS/MS检测毛发中2-AG、AEA的含量,对比分析不同癫痫发作分级小鼠2-AG、AEA含量差异。结果：标准品溶液中AEA、2-AG的保留时间分别为14.3 min,18.1 min,毛发样品中AEA、2-AG的保留时间分别为14.0 min,17.7 min。毛发样品中AEA的检测限、定量限、回收率为0.7 pg/mg、2.1 pg/mg和97.9%,毛发样品中2-AG的检测限、定量限、回收率为3.2 pg/mg、10.9 pg/mg和99.3%,且二者的日内、日间变异系数均低于15%。癫痫发作1级、2级、3级、4级、5级这五个分级癫痫小鼠的AEA含量和2-AG含量依次升高,不同癫痫发作分级小鼠毛发样品中AEA含量和2-AG含量比较（P均<0.05）。结论：LC-MS/MS测定癫痫小鼠毛发中2-AG、AEA的表达量,具有灵敏度更高,样品使用量更少等优点,可大规模样本研究。