利用CRISPR/Cas9技术构建大鼠L2细胞α-ENaC基因敲除稳定细胞株

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建大鼠L2细胞α-ENaC基因敲除的细胞株,研究α-ENaC基因对细胞增殖的影响。构建敲除α-ENaC基因的CRISPR/Cas9表达载体和筛选报告载体,通过转染和嘌呤霉素筛选获得单克隆细胞株,Western Blot、测序确定突变的细胞株,CCK-8检测突变细胞株的增殖活力。成功构建靶向α-ENaC基因第一外显子的CRISPR/Cas9表达载体和筛选报告载体,嘌呤霉素筛选后,挑选8个单细胞克隆中有两个单细胞克隆α-ENaC蛋白表达下降,一个单细胞克隆α-ENaC蛋白不再表达,测序结果显示3个单细胞克隆分别为2个单等位基因突变和1个双等位基因突变,且未发现脱靶现象。突变细胞株的增殖活力降低,其中双等位基因突变细胞株增殖活力降低更为显著。因此,利用CRISPR/Cas9结合SSA-RPG报告载体成功获得了α-ENaC基因敲除的L2细胞株,α-ENaC与细胞增殖有关。     

CRISPR/Cas9慢病毒系统敲除胰岛β细胞PKA C-α的研究

利用CRISPR/cas9系统建立稳定敲除PKA C-α基因的INS-1细胞株,研究PKA C-α在胰岛β细胞中的功能。设计2个长25 bp且分别靶向PKA C-α基因的exon 5和exon 7的sgRNA,将其克隆至LentiCRISPRv2-sgRNA质粒并转染至293T细胞中制备sgRNA-Cas9慢病毒,慢病毒感染INS-1细胞,嘌呤霉素筛选出阳性细胞并采用有限稀释法筛选单克隆细胞,Western blotting印记法检测单克隆细胞中PKA C-α蛋白的表达水平,测序确认单克隆细胞中PKA C-α基因的突变位点。WB实验证实靶向Exon 5的sgRNA可成功敲除PKA C-α基因,得到稳定敲除PKA C-α基因的细胞株,测序结果表明该细胞株的PKA C-α基因发生1 bp碱基插入突变,并且敲除PKA C-α基因的INS-1细胞胰岛素分泌能力下降。本实验利用CRISPR/Cas9系统成功敲除INS-1细胞中的PKA C-α基因,为研究PKA C-α在胰岛β细胞中的功能奠定了基础。     

利用CRISPR/Cas9n double nick系统构建人DNAH2基因敲除的U2OS细胞株

基于CRISPR/Cas9n double nick技术构建人DNAH2(Homo sapiens dynein,axonemal,heavy chain 2)基因敲除的U2OS稳定细胞株,旨在研究DNAH2基因的生物学功能。首先设计并合成A、B两个sg RNA(Single guide RNA)以及各自的互补链,退火连接形成DNAH2 sg RNA-A、B双链,再分别与带有BbsⅠ粘性末端的p X462线性载体相连,形成p X462-DNAH2-A、p X462-DNAH2-B重组真核表达质粒。质粒共转染至U2OS细胞后,加入嘌呤霉素,以有限稀释法获得阳性单克隆细胞株,再以蛋白印迹实验检测DNAH2蛋白的表达,最后通过PCR-基因测序技术分析突变特点。结果显示A、B sg RNA双链成功插入p X462载体,U2OS-DNAH2-KO单克隆细胞株中DNAH2蛋白不表达,DNAH2基因发生移码突变,从而证实利用CRISPR/Cas9n double nick系统成功构建人DNAH2基因敲除的U2OS稳定细胞株,为研究DNAH2基因提供有利工具。     

应用CRISPR/Cas9系统构建MTHFD1基因敲除的HEK-293细胞系

目的:利用成簇的、规律间隔的短回文重复序列/Cas9核酸酶(CRISPR/Cas9)基因编辑技术构建亚甲基四氢叶酸脱氢酶1(methylenetetrahydrofolate dehydrogenase 1, MTHFD1))基因敲除人胚肾(HEK-293)稳定细胞系。方法:利用在线软件筛选出评分最高的3条针对MTHFD1基因的单向导RNA (sg RNA),然后合成sg RNA序列并将其插入到含有GFP标签的质粒中;重组质粒转染HEK-293细胞后通过流式细胞仪分选出已被转入sg RNA的单细胞,通过测序确认单克隆细胞系中MTHFD1的DNA序列突变状态;最后应用实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(real-time quantitative Polymerase Chain Reaction, RT-q PCR)和蛋白质印迹(Western blot)方法检测单克隆细胞中MTHFD1的m RNA和蛋白表达水平。结果:重组载体中含有正确的sg RNA序列;测序结果显示该细胞系中MTHFD1基因发生了单个碱基插入突变和6个碱基的缺失突变;RT-qPCR结果显示单克隆细胞系中MTHFD1在m RNA水平显著降低;Western blot检测成功构建MTHFD1蛋白缺失的HEK-293细胞。结论:本研究利用CRISPR/Cas9技术成功构建的MTHFD1敲除HEK-293细胞系。     

敲除L-periaxin基因的大鼠RSC96细胞系的建立

轴周蛋白(Periaxin)是外周神经系统非致密性髓鞘中特异表达的蛋白,编码Periaxin的基因经由选择性剪接产生两种蛋白异构体L-periaxin和S-periaxin,对髓鞘形成的初始化有重要作用。至今在Periaxin基因上已发现有18种不同的位点突变导致外周脱髓鞘神经疾病腓骨肌萎缩症4F亚型(CMT4F)的发生。利用转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)靶向基因敲除技术对大鼠RSC96细胞的periaxin基因进行敲除,根据TALENs设计原则,确定L-periaxin基因的敲除靶点在其编码NLS结构域部分,设计相应的TALEN左臂与右臂的识别序列,构建含上述识别序列的L-periaxin基因敲除载体TALEN-L和TALEN-R,并将其转入RSC96细胞,经嘌呤霉素药物筛选,获得L-periaxin基因敲除细胞株,经测序确认大鼠RSC96细胞中的基因组中L-periaxin基因区段已被敲除,成功构建了L-periaxin基因敲除细胞模型。计算L-periaxin基因敲除载体的突变率为21.6%。Western blotting实验证明,在RSC96细胞中只能检测到S-periaxin蛋白的表达。通过流式细胞术及MTT实验检测基因敲除细胞的细胞周期和生长速度,发现敲除L-periaxin基因的细胞生长速度缓慢,G1期细胞增多,S期细胞减少。     

利用CRISPR/Cas9技术建立敲除JAK2基因K562细胞系

目的:利用CRISPR/Cas9技术对K562细胞系JAK2基因进行编辑,构建JAK2基因敲除的K562细胞系。方法:使用CRISPR在线设计工具,针对JAK2基因设计sgRNA,构建Cas9-sgRNA共表达质粒。使用第二代慢病毒包装系统包装慢病毒并感染K562细胞,提取细胞基因组DNA,Sanger测序和TA克隆检测基因编辑活性。无限稀释法将编辑阳性的细胞接种于96孔板并扩培得到单克隆细胞株,提取基因组DNA,Sanger测序和TA克隆分析敲除JAK2单克隆细胞的基因型。结果:成功构建靶向敲除JAK2基因的lentiCRISPRv2-sgRNA3-1质粒。优化方案得到低细胞毒性高转染效率的感染K562细胞慢病毒量。CRISPR/Cas9系统成功在JAK2基因sgRNA3-1识别位点发挥基因组编辑活性,获得纯合敲除JAK2基因细胞株K562-JAK2~(-/-)(两个等位分别发生移码突变,预期编码没有功能的JAK2蛋白)。结论:CRIAPR/Cas9系统通过慢病毒感染方式获得JAK2基因纯合敲除的K562细胞株,该细胞模型可用于研究在慢性髓系白血病中JAK2基因的作用,为构建K562敲除其他基因细胞系提供实验依据,为探究造血分化机制的研究奠定实验基础。     

CRISPR/Cas9编辑绒山羊FGF5基因细胞株的建立

拟利用CRISPR/Cas9技术建立编辑FGF5基因的绒山羊细胞株。在FGF5基因的第一外显子设计靶点并合成gRNA靶点引物,构建2个编辑FGF5基因的Cas/gRNA真核表达质粒载体。电穿孔法转染绒山羊成纤维细胞后T7核酸内切酶（T7E1）检测载体活性,选择活性最高的载体转染细胞,单细胞接种并扩繁,提取基因组DNA,PCR及测序鉴定。经测序分析共获得20个FGF5基因敲除细胞株（包括FGF5^+/-和FGF5^-/-）,总突变率为14.81%。双敲除突变细胞株可作为供体细胞进行重构胚构建,为创造高产绒性状的FGF5基因编辑绒山羊奠定基础。     

利用CRISPR/Cas9系统构建稳定敲除anxa6基因的Caco-2细胞株

【目的】利用CRISPR/Cas9系统构建稳定敲除anxa6基因的Caco-2细胞株,为研究大肠杆菌O157:H7效应蛋白Esp F与宿主膜联蛋白A6 (ANXA6)相互作用及其致病机制奠定基础。【方法】根据CRISPR/Cas9靶向原理设计并合成3个特异性识别anxa6基因的向导RNA (single guide RNA,sgRNA),基于Lenti CRISPRv2载体构建Lenti CRISPRv2-sg RNA重组质粒,转入293T细胞中,制备sgRNA-Cas9慢病毒,将慢病毒感染Caco-2细胞,经嘌呤霉素筛选阳性细胞,有限稀释法分离培养单克隆细胞,提取单克隆细胞基因组DNA,并对敲除位点附近的DNA片段进行PCR扩增,测序并进行脱靶效应评估;免疫印记法检测ANXA6蛋白表达情况,细胞计数试剂盒8 (cell counting kit 8,CCK8)试剂盒检测细胞增殖能力,免疫荧光法检测细胞紧密连接分布情况。【结果】Western blotting及序列测序表明anxa6基因敲除单克隆细胞构建成功;脱靶效应评估结果显示预测的10个脱靶位点均无脱靶现象;基因敲除对细胞增殖能力...     

利用CRISPR/Cas9技术构建KMT2D基因敲除的人胚胎干细胞系

[目的]通过CRISPR/Cas9技术构建KMT2D SET结构域双等位基因敲除的人胚胎干细胞HN4细胞系。[方法]通过CRISPR在线设计工具在SET结构域两侧各设计多条sgRNA,利用T7EI选出效率最高的sgRNA,构建到pX330载体中,特异性扩增同源臂,分别构建到双抗性载体中作为Donor。将sgRNA与Donor共同电转至HN4细胞中,经过Puro和Hygro抗性筛选后,挑取单克隆,利用PCR,测序以及q-PCR鉴定等方法鉴定细胞的基因型。[结果]成功构建了靶向KMT2D SET Domain两端的sgRNA的表达质粒,并选择出切割效率最高的sgRNA。PCR鉴定结果显示,有8株细胞可同时扩增出Puro和Hygro两个目的片段,且无野生型条带。通过测序和序列比对确认KMT2D SET已被敲除,双等位基因分别被Puro和Hygro替换。q-PCR结果显示,mRNA层面上,SET Domain已经不表达,而其他位点则不受影响。[结论]成功构建pX330-sgRNA质粒,并验证其具有活性。成功构建了靶向KMT2D SET Domain的分别含有Puro和Hygro不同抗性的Donor。成功建立了稳定的KMT2D基因敲除的人胚胎干细胞系。     

利用基于CRISPR-Cas9 的基因编辑技术对miR-29a在GT1-7 细胞中进 行基因敲除

目的:本文利用CRISPR-Cas9技术在GT1-7细胞中对miR-29a基因进行基因编辑,用于构建miR-29a基因敲除GT1-7细胞模型。方法:通过构建Cas9稳转的GT1-7细胞株并转染sgRNA质粒用于在靶向miR-29a基因区域引发突变。然后构建EGFP与sgRNA共表达质粒并转染Cas9稳转GT1-7细胞,利用流式细胞仪富集表达绿色荧光蛋白的阳性细胞和分选阳性单克隆细胞。最后利用实时荧光定量PCR(realtimefluorescencequantitativePCR)对富集细胞和单克隆细胞进行miR-29a表达量检测。结果:T7E1检测结果显示CRISPR-Cas9系统有效地在miR-29a基因区域引发了突变。荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,富集后阳性细胞miR-29a的表达量整体下降了50%左右(P0.05)。此外,通过流式筛选获得了一个纯合miR-29a基因敲除细胞克隆,与对照组相比,其miR-29a的表达量下降了75%左右(P0.05)。结论:本文建立了一种有效编辑GT1-7细胞基因的方法,并采用该方法构建了miR-29a稳定敲除细胞模型。     

转录因子ZnF-706在鳞翅目昆虫中的进化格局及在家蚕中的功能

【目的】探讨家蚕Bombyx mori的潜在驯化基因——转录因子ZnF-706在鳞翅目(Lepidoptera)昆虫进化过程及家蚕驯化过程中的分子进化格局;并基于CRISPR/Cas9家蚕基因组编辑平台,探讨ZnF-706基因在家蚕中的功能。【方法】首先分析了家蚕ZnF-706序列特征,并利用已发表芯片数据调研该基因在家蚕幼虫组织中的表达格局;利用Phylogenetic Analysis byMaximum Likelihood (PAML)分支检验方法,分析该基因在鳞翅目不同类群中的分子进化格局。基于已发表的家蚕-野桑蚕Bombyx mandarina群体基因组多态性数据,对ZnF-706进行基因区域人工选择信号分析;对ZnF-706基因上游2 kb的调控区域进行单核苷酸多态性位点频率检测,发掘在家蚕群体中固定下来的突变位点;针对突变位点所在区域进行转录因子结合活性预测。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除ZnF-706基因,获得纯和突变体;以野生型家蚕为对照,检测突变体的茧重及蛹重变化。【结果】家蚕ZnF-706的编码蛋白具有典型的锌指蛋白结构域。ZnF-706在家蚕5龄第3天幼虫各组织中广泛表达,尤其表皮、脂肪体和生殖腺中有很高的表达量;该基因在鳞翅目、蚕蛾总科(Bombycoidea)及天蚕Antherea yamamai 3个分支中均呈现快速进化信号,在家蚕中有强烈的人工选择信号。该基因所在基因组区域的家蚕-野桑蚕种群分歧度参数Fst明显升高,家蚕群体中的群体多样性π明显降低,表明它位于一个选择扫荡区域内;该基因在家蚕-野桑蚕中的9个SNP位点存在于上游调控区,并位于转录因子结合活性区域内。该基因的纯合家蚕突变体ΔZn F-706生存力减弱,并且茧重以及蛹重与野生型家蚕相比都显著降低。但与黑腹果蝇Drosophila melanogaster中不同的是,家蚕中该基因的突变并不致死。【结论】ZnF-706可能在鳞翅目尤其是泌丝昆虫中进化,并在家蚕驯化过程中受到选择压力,提示其对于特征性状茧丝的变异可能发挥作用。该基因可能通过对丝蛋白基因的直接调控,或通过影响家蚕的生长发育而间接地影响茧丝性状。本研究不仅为探究家养动物人工选择机制提供了来自昆虫类材料的独有证据,也为后续深入开展家蚕重要经济性状的转录调控研究提供线索。     

hnRNPA1基因在家蚕翅原基组织中的表达与定位分析

核不均一蛋白A1(hnRNPA1)是一个重要的RNA结合蛋白。本研究旨在获得家蚕hnRNPA1基因的cDNA,并对其在家蚕翅原基组织进行表达和定位分析。以家蚕幼虫期翅原基mRNA为模板通过反转录克隆家蚕BmhnRNPA1基因的全长cDNA,并对其进行生物信息学分析。构建pET32a-BmhnRNPA1蛋白表达载体,表达且纯化得到BmhnRNPA1重组蛋白,并制备该蛋白多克隆抗体,通过实时荧光定量RT-PCR、Western blot和免疫组化方法检测BmhnRNPA1在家蚕幼虫和蛹翅原基组织中的表达与定位。克隆得到了家蚕hnRNPA1基因的全长cDNA片段,其开放阅读框(ORF)序列为951 bp,编码316个氨基酸,预测分子量为34.98 kDa,等电点为5.15。编码蛋白在第18～90个氨基酸和109～181个氨基酸处为保守的RRM结构域。系统进化分析显示,家蚕hnRNPA1与小菜蛾hnRNPA1的亲缘关系最近。QRT-PCR结果显示,BmhnRNPA1在家蚕幼虫和蛹期的翅原基组织中均有表达,且在蛹期第3天的表达量达到峰值。Western blot进一步证实了实验结果。免疫组化分析结果显示,该蛋白存在于翅原基组织中,并定位于细胞核内。家蚕BmhRNPA1具有两个RNA结合结构域,属于hnRNPs家族,定位于细胞核内,表明其可能参与mRNA的选择性剪接作用。本研究结果为进一步探索该基因的功能提供了基础。     

常见SPF级小鼠和大鼠肠道菌群多样性研究

目的研究常见SPF级小鼠和大鼠的肠道菌群多样性。方法分别采集广东地区三家实验动物生产单位的C57BL/6、ICR、BALB/c小鼠和Wistar、SD大鼠的盲肠内容物样品,用细菌16S rDNA通用引物扩增V4-V5区域,采用Illumina Miseq 2×300 bp测序平台进行测序,使用生物信息学方法进行微生物群落分析、Alpha多样性分析与Beta多样性分析。结果对序列去杂优化后OTU聚类分析,稀释性曲线说明本次测序的数据量合理;实验小鼠和大鼠肠道菌群共分成八个门,其中拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)占据主要地位,属水平上主要是拟杆菌属(Bacteroides)、Hungatella、副杆状菌属(Parabacteroides)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)等;样品间差异性分析显示相同设施来源动物的菌群组成相似性较高;Alpha分析结果显示来源于同种设施的动物物种丰富度相近;Beta分析显示相同设施动物的肠道菌群差异较小,但品系对肠道菌群差异性有所影响。结论不同来源设施的饲养环境是动物肠道菌群多样性的主要影响因素,不同品系对肠道菌群多样性有一定影响。     

基于非线性热扩散效应的亚衍射极限光声二次谐波显微成像技术

本文提出了一种基于非线性热扩散效应的光声二次谐波显微SH-PAM成像技术,用于实现亚衍射极限光声成像。生物组织受到强度调制的高斯激光束辐射时,组织吸收光子形成高斯分布的温度场,由于热扩散系数非线性热效应引起的非线性光声PA效应,从而产生光声二次谐波信号。模拟和试验结果均表明,重建后的光声二次谐波成像的横向分辨率超过了传统光学成像分辨率。本文通过仿体样品验证了该方法的可行性,并且对人表层皮肤细胞进行了成像,以证明其对生物样品的成像能力。该方法扩展了传统光声成像的范围,为超分辨成像开辟了新的可能性,为生物医学成像和材料检测提供了新的方法。     

人工饲料饲养的叉角厉蝽对昆虫的捕食能力评价

叉角厉蝽Eocanthecona furcellate(Wolff)是广泛分布于热带亚热带地区的一种重要捕食性天敌昆虫。为评估人工饲料饲养的叉角厉蝽的捕食能力,在实验室采用捕食功能反应的方法,以黄粉虫作为中介猎物饲养的叉角厉蝽为对照,评价了人工饲料饲养的叉角厉蝽3龄若虫、5龄若虫以及雌成虫对黄粉虫Tenebriomolitor(L.)幼虫及斜纹夜蛾Spodoptera litura(Fabricius)3龄幼虫、5龄幼虫的捕食效能。结果表明,两种饲料饲养的不同虫态叉角厉蝽的捕食量均随着猎物密度的增加而上升,当猎物密度增加到一定水平,捕食量趋于稳定,其捕食功能反应均符合HollingII模型。人工饲料组饲养的各虫态叉角厉蝽与对照组的对黄粉虫幼虫的捕食量没有明显差异;在饱和猎物密度条件下,人工饲料饲养的叉角厉蝽3龄若虫、5龄若虫以及雌成虫对斜纹夜蛾3龄幼虫的日最大捕食量分别为7.20、9.20、14.60头,对斜纹夜蛾5龄幼虫的日最大捕食量分别4.20、5.80、6.20头,均略低于对照组,但从取食猎物数量上来看,仍保持较强的捕食能力。     

基于有限元仿真定量探究贵金属纳米探针自组装诱导的非线性光声效应增强机制

构建高转化效率的功能纳米探针是推动光声分子成像发展的关键。随着光声分子成像技术的发展,具有非线性增强光声转换效率的自组装纳米探针逐渐成为研究热点,然而有关其非线性增强的定量研究尚未见报道。本文以纳米金球为例,利用有限元仿真定量探究金属纳米探针自组装诱导的非线性光热及光声效应,揭示自组装纳米探针光声效应增强规律,为构建具备高转换效率的光声自组装纳米探针奠定了理论基础。     

星天牛寄主选择研究

为了明确华南地区星天牛主要寄主植物种类,本文筛选了21种有代表性的植物,对星天牛进行了室内、室外寄主选择试验。结果表明,星天牛在不同植物上的取食量和刻槽数量差异极显著,偏好在砂糖橘、苦楝、金桔和柠檬上取食,在砂糖橘、柠檬、金桔和小叶紫薇上刻槽产卵,取食对象和刻槽产卵对象不一致。研究证实,星天牛能在华南地区砂糖橘、玫瑰和柠檬三种植物上完成生活史,是星天牛的寄主植物。     

艾叶精油对玉米螟赤眼蜂的影响及两者对米蛾的联合作用

玉米螟赤眼蜂是生物防治中一种重要的天敌昆虫,为探明艾叶精油对玉米螟赤眼蜂的影响及两者对米蛾的联合防治效果,本文研究了艾叶精油熏蒸、触杀、驱避活性对玉米螟赤眼蜂的影响及艾叶精油和玉米螟赤眼蜂对米蛾的联合作用。结果表明,艾叶精油熏蒸和触杀处理对玉米螟赤眼蜂卵具有明显影响,寄生在米蛾卵上的玉米螟赤眼蜂卵经0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6μg/cm3艾叶精油熏蒸处理72h后玉米螟赤眼蜂的羽化率分别为56.67%、49.33%、44.00%、33.33%、26.00%和14.67%;寄生在米蛾卵上的玉米螟赤眼蜂卵经100、200、300、400、500、600mg/L艾叶精油触杀处理72h后玉米螟赤眼蜂的羽化率分别为54.00%、45.33%、38.00%、28.67%、18.00%和6.00%,均与对照组表现出显著性差异。艾叶精油驱避活性对玉米螟赤眼蜂成蜂也有明显的影响,300mg/L艾叶精油对玉米螟赤眼蜂的驱避率79.05%,随着时间间隔和距离间隔的增加,这种影响作用降低;联合应用艾叶精油与玉米螟赤眼蜂时先释放玉米螟赤眼蜂,24h后再滴加艾叶精油的防治效果最佳,米蛾的死亡率可高达96%。     

福建漳江口红树林沉积物重金属汞(Hg)的分布特征

对福建漳江口红树林沉积物中重金属汞(Hg)含量的时空分布进行了研究。结果表明漳江口红树林湿地汞含量为0.0815 mg•kg–1—0.3431 mg•kg–1。在潮间带水平分布上, 从光滩到高潮位汞含量显著上升(P<0.05), 相对光滩, 红树林沉积物更易富集汞, 其中高潮位红树林底泥中汞含量最高。在垂直方向上, 大多数的汞富集在表层及亚表层, 随着深度的加深, 汞含量呈现下降趋势。汞在红树林湿地沉积物中的积累主要与有机碳(TOC), 含水率, 盐度相关。从计算的单一污染指数(Pi)来看, 漳江口地区汞污染等级为Ⅲ级以下, 大多数采样点属于自由污染或轻度污染。就该地区汞污染的时空变化趋势以及和其他红树林区汞污染状况的对比来看, 漳江口地区存在一定程度的汞污染威胁加剧的现象, 值得引起注意。     

miR-305-3p和miR-71-5p通过调控谷胱甘肽代谢途径参与斜纹夜蛾应对植物次生物质

昆虫和植物在长期进化过程中形成相互作用的关系。其中植物次生物质是植物防御昆虫的主要机制,而昆虫则以解毒酶来应对。为了发现可用于害虫防治的miRNA,通过对农业害虫斜纹夜蛾Spodoptera litura进食芥菜Brassica juncea后中肠的测序分析,获得了一系列差异表达的miRNA。通过生物信息学分析,发现斜纹夜蛾miR-305-3p靶向了谷胱甘肽代谢中的谷氨酸半胱氨酸连接酶的催化亚基(Slgclc),这是一个谷胱甘肽从头合成的限速酶;而miR-71-5p靶向调控gclc和解毒酶表达的转录因子SlNrf2。用芥菜的次生物质吲哚-3-甲醇处理斜纹夜蛾Spli-221细胞株后,实时荧光定量PCR证明Slgclc和SlNrf2表达上调,miR-305-3p和miR-71-5p表达下调。分别在斜纹夜蛾Spli-221细胞中超表达miR-305-3p及miR-71-5p mimics,Slgclc或SlNrf2转录水平下调,并且miR-71-5p mimic处理抑制了SlNrf2下游基因Slgclc和解毒酶谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)的表达。结果表明:miR-305-3p和miR-71-5p响应植物次生物质而分别促进Slgclc和SlNrf2表达。然而双荧光素酶实验显示miR-305-3p并不与Slgclc直接结合,miR-71-5p也不与SlNrf2直接结合,推测miR-305-3p和miR-71-5p可能间接调控Slgclc和SlNrf2的表达。研究结果表明,斜纹夜蛾miR-305-3p和miR-71-5p通过调控解毒酶GSTs表达及其底物谷胱甘肽的生成,而参与昆虫抵抗植物次生物质。