Real-time TaqMan RT-PCR快速检测犬瘟热病毒方法的研究

按照犬瘟热(CDV)N基因序列,设计合成了特异性引物和探针,经各反应条件的优化,建立了Real-time荧光定量RT-PCR技术,对细胞培养物、肝脏、肺脏、脑、脾脏、淋巴结以及鼻腔拭子等组织病料中的CDV进行了特异性检测和敏感性试验。同时,利用建立的Real-time荧光定量RT-PCR方法与常规RT-PCR以及韩国BIOINDIST生产的BIT RAPID CDV检测试剂盒对57份临床样品进行了检测。结果:用20pmol/mL的引物浓度各1uL和20pmol/mL的探针浓度0．3uL,获得的荧光信号最强,曲线平滑。敏感性高,可检测到1．24×10—3ng/uL的病毒RNA;特异性强,与NDV、AIV、NiPV等RNA病毒不发生交叉反应。试验重复性的变异系数(CV)分别为2．3%、2．5%和4．2%;与常规RT-PCR和BIOINDIST生产的BIT RAPID CDV检测试剂盒相比较,该方法具有快速、特异、敏感、可定量,并可同时检测大量样品等优点。     

荧光定量RT-PCR技术快速检测SARS病毒核酸

建立以特异性荧光探针为特点的TaqMan荧光定量RT-PCR方法用于检测严重急性呼吸道综合症病毒(severe acute respiratory syndrome -associate coronavirus,SARS-CoV)核酸.筛选针对SARS病毒基因保守区域设计的引物与TaqMan探针,并对荧光定量RT-PCR反应体系与反应条件进行优化,验证本方法的特异性、敏感度与重复性. 实验结果表明本方法对SARS病毒核酸的检测具有高度特异性,与甲1型、甲3型、乙型流感病毒、禽流感病毒H5N1、麻疹及其他呼吸道病毒均无交叉反应;检测灵敏度达0.1TCID50;从病毒核酸提取至检测完成仅需3h左右,且操作简便,重复性好.本研究建立的TaqMan荧光定量RT-PCR方法特异、敏感、快速,适合于临床实验室进行SARS病毒的早期快速检测.     

呼吸道合胞病毒TaqMan探针实时定量RT-PCR检测方法的建立及应用

目的:建立呼吸道合胞病毒(RSV)核酸特异、快速、敏感的TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,并对临床样本进行检测。方法:比对编码RSV非编码蛋白的基因序列,选取其保守片段设计引物和探针,建立实时荧光定量RT-PCR检测方法,并与传统RT-PCR方法进行比较,分别对两者的灵敏性、特异性、重复性及临床样本检验的适用性进行评价。结果:所建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法可用于RSV的特异性检测。相对于传统RT-PCR方法100拷贝/反应的检测灵敏度,实时荧光定量RT-PCR的检测灵敏度达到10拷贝/反应,检测范围为1010~101拷贝/反应,且具有良好的特异性和重复性。从169份临床呼吸道标本中检出RSV阳性40例,高于普通PCR方法(31/169)。结论:建立了RSV的TaqMan探针实时定量PCR检测方法,并可用于临床鼻咽拭子样本的检测,在临床上具有较好的应用前景。     

李痘病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的:建立李痘病毒(PPV)特异、灵敏、快速的实时荧光定量RT-PCR检测方法,用于核果类种苗的健康评测及李痘病毒疫情监测。方法:根据PPV-D株系和PPV-M株系的外被蛋白(CP)基因保守序列,设计特异性引物和TaqMan探针,扩增全长CP基因片段,并将其克隆到pMD18-T载体上,构建质粒标准品,建立PPV的实时荧光定量RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行评估。结果:此荧光定量RT-PCR方法对PPV检测呈现高灵敏度和高特异性,与马铃薯Y病毒和马铃薯X病毒无交叉反应,最低检出限可达1.6×102拷贝/μL,标准曲线的相关系数为0.999 18。结论:建立了李痘病毒的荧光定量RT-PCR检测方法,可望应用于检验检疫部门对李痘病毒的快速检测。     

TaqMan荧光定量RT-PCR检测水稻RAcl基因mRNA方法的建立

构建包含RAcl基因cDNA片段的质粒,作为水稻肌动蛋白基因RAcl之mRNA定量检测的标准品,建立检测方法,为水稻其他基因的定量建立内参。从水稻叶总RNA中逆转录扩增总cDNA,PCR扩增RAcl基因中设计的目的片段,将纯化的目的片段与pMD19-T Simple载体进行连接,转化宿主菌JM-109,提取重组质粒DNA,PCR鉴定并测序分析。纯化质粒并检测260nm吸光值,确定重组质粒原液的拷贝浓度并以此制备荧光定量PCR梯度浓度标准品,进行实时荧光定量PCR实验。建立了RAcl基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法,特异性好,检测灵敏度达102拷贝,线性范围为102—1护拷贝,阈值循环数（Ct）与PCR体系中起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系（r=1．000）,扩增效率高（E=98．2％）。建立了基因RAcl实时定量PCR的质粒标准品。     

戊型肝炎病毒荧光定量RT-PCR快速检测技术的建立和初步应用

利用DNAMAN软件对GenBank登录的戊型肝炎病毒四个主要基因型代表株的序列进行分析, 选择其高度保守的ORF2区域设计合成引物和探针, 并用包含有扩增区域的核苷酸片段进行体外转录制备标准品cRNA。在对荧光定量RT-PCR的反应条件优化的基础上, 建立了适用于戊型肝炎病毒主要基因型检测的荧光定量RT-PCR检测技术。该检测技术可以有效检测I型和IV型戊型肝炎阳性病料, 而对猪的其它几种疫病阳性病料则为阴性结果, 证实本技术的特异性强、可靠性好。对阳性标准品的检测结果表明, 所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR灵敏度可达2.0×101拷贝/反应, 相比于巢式RT-PCR方法, 其灵敏度高10~100倍以上。在对54份临床样品的检测中, 进一步证实了该方法快速、灵敏且重复性好, 可满足戊型肝炎病毒早期快速诊断的需要。     

戊型肝炎病毒荧光定量RT-PCR快速检测技术的建立和初步应用

利用DNAMAN软件对GenBank登录的戊型肝炎病毒四个主要基因型代表株的序列进行分析, 选择其高度保守的ORF2区域设计合成引物和探针, 并用包含有扩增区域的核苷酸片段进行体外转录制备标准品cRNA。在对荧光定量RT-PCR的反应条件优化的基础上, 建立了适用于戊型肝炎病毒主要基因型检测的荧光定量RT-PCR检测技术。该检测技术可以有效检测I型和IV型戊型肝炎阳性病料, 而对猪的其它几种疫病阳性病料则为阴性结果, 证实本技术的特异性强、可靠性好。对阳性标准品的检测结果表明, 所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR灵敏度可达2.0×101拷贝/反应, 相比于巢式RT-PCR方法, 其灵敏度高10~100倍以上。在对54份临床样品的检测中, 进一步证实了该方法快速、灵敏且重复性好, 可满足戊型肝炎病毒早期快速诊断的需要。     

TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测甲型肝炎减毒活疫苗病毒含量的研究

目的：建立一种快速定量检测甲型肝炎减毒活疫苗病毒含量的实时荧光定量RT-PCR方法。方法对Gen-Bank中登陆的甲型肝炎减毒活疫苗株（ L-A-1）和其他甲型肝炎病毒基因组全序列比较分析,根据其高度保守的5′端非编码区设计针对甲型肝炎减毒活疫苗株特异性引物与探针,对荧光定量RT-PCR反应条件进行优化,检测该方法的特异性和灵敏性,并对甲型肝炎减毒活疫苗病毒含量进行定量检测。结果该方法对甲型肝炎减毒活疫苗株高度特异,扩增片段为207 bp,不与其他肠道病毒发生非特异性反应。在104 CCID50/管～10-1 CCID50/管之间有良好的扩增曲线,检测的灵敏度可达0．1CCID50～0．01CCID50,比普通RT-PCR高100倍。结论该方法具有快速、灵敏、特异、重复性好等优点,可应用于甲型肝炎减毒活疫苗生产过程中病毒含量滴度测定及指导疫苗成品的配制。     

TaqMan荧光定量RT-PCR检测水稻RAc1基因mRNA方法的建立

构建包含RAc1基因cDNA片段的质粒,作为水稻肌动蛋白基因RAc1之mRNA定量检测的标准品,建立检测方法,为水稻其他基因的定量建立内参.从水稻叶总RNA中逆转录扩增总cDNA,PCR扩增RAc1基因中设计的目的片段,将纯化的目的片段与pMD19-T Simple载体进行连接,转化宿主菌JM-109,提取重组质粒DNA,PCR鉴定并测序分析.纯化质粒并检测260nm吸光值,确定重组质粒原液的拷贝浓度并以此制备荧光定量PCR梯度浓度标准品,进行实时荧光定量PCR实验.建立了RAc1基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法,特异性好,检测灵敏度达102拷贝,线性范围为102～107拷贝,阈值循环数(Ct)与PCR体系中起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系(r=1.000),扩增效率高(E=98.2%).建立了基因RAc1实时定量PCR的质粒标准品.     

荧光定量RT-PCR技术快速检测SARS病毒核酸

建立以特异性荧光探针为特点的TaqMan荧光定量RTPCR方法用于检测严重急性呼吸道综合症病毒(severeacuterespiratorysyndromeassociatecoronavirus,SARSCoV)核酸。筛选针对SARS病毒基因保守区域设计的引物与TaqMan探针,并对荧光定量RTPCR反应体系与反应条件进行优化,验证本方法的特异性、敏感度与重复性。实验结果表明:本方法对SARS病毒核酸的检测具有高度特异性,与甲1型、甲3型、乙型流感病毒、禽流感病毒H5N1、麻疹及其他呼吸道病毒均无交叉反应;检测灵敏度达0.1TCID50;从病毒核酸提取至检测完成仅需3h左右,且操作简便,重复性好。本研究建立的TaqMan荧光定量RTPCR方法特异、敏感、快速,适合于临床实验室进行SARS病毒的早期快速检测。     

检测蜜蜂急性麻痹病毒TaqMan实时荧光RT-PCR方法的建立和初步应用

[背景] 蜜蜂急性麻痹病毒（Acute Bee Paralysis Virus,ABPV）是一种高毒力的蜜蜂病毒,可以引起蜜蜂的大批死亡和蜂群衰竭。[目的] 建立一种快速、灵敏的ABPV实时荧光RT-PCR检测方法。[方法] 根据ABPV衣壳蛋白基因保守序列设计引物和探针,通过对引物、探针浓度和退火温度等反应条件进行优化,建立基于TaqMan探针检测ABPV的实时荧光RT-PCR方法,并对方法的灵敏性、特异性和稳定性进行验证。[结果] ABPV实时荧光RT-PCR检测方法在9.8×10¹-9.8×10⁸ copies/μL之间呈现良好的线性关系,线性相关系数R²为0.998,扩增效率为103.8%。该方法的检测灵敏度为9.8 copies/μL;对其他蜜蜂病毒不发生交叉反应,具有良好的特异性;重复性试验结果显示组内和组间的变异系数分别为0.19%-0.80%和0.57%-1.07%,重复性良好。对2018年-2019年在福建地区采集的70份蜜蜂样品进行ABPV检测,阳性率为2.86%。[结论] 建立的ABPV实时荧光RT-PCR检测方法能用于该病的实验室检测、流行病学调查和疫情监测。     

长爪沙鼠小鼠肝炎病毒（MHV）RT-PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立长爪沙鼠小鼠肝炎病毒（MHV）RT-PCR检测方法,应用于长爪沙鼠、小鼠等实验动物MHV的检测。方法根据已发表的小鼠肝炎病毒（MHV）S基因序列,设计合成引物。提取MHV细胞毒RNA,以其为模板,进行PCR扩增。优化反应条件,进行特异性、敏感性、稳定性、重复性试验。并对65只长爪沙鼠及12只小鼠进行检测。结果建立的MHVRT-PCR检测方法特异、敏感、稳定。以MHVRNA逆转录产物为模板,所能检测RNA最小模板浓度为3．1pg／μL,可检测病毒最小滴度为10^-3／mL。65只沙鼠经RT-PCR检测,均为阴性,12只小鼠经RT．PCR检测,有3只MHV阳性,测序结果与Genbank中MHV核酸序列同源性均为97％。结论建立的长爪沙鼠小鼠肝炎病毒（MHV）RT-PCR检测方法可用于长爪沙鼠、小鼠等实验动物MHV的检测。     

Nipah病毒一步法Real-time RT-PCR检测方法的建立

目的建立针对Nipah病毒N基因的一步法Real-time RT-PCR检测方法,用于Nipah病毒感染样本的快速准确检测和定量。方法针对Nipah病毒的保守基因N设计引物和探针,建立一步法Real-time RT-PCR反应方法并分析敏感性和特异性。结果所设计的引物经Blast检索可以用于检测所有已知的Nipah病毒株。本研究建立的一步法Real-time RT-PCR方法可以特异性检测出Nipah病毒,不与Hendra病毒产生交叉反应。检测灵敏度为1.1×100～1.1×101copies/μl。标准曲线的线性范围为1.1×102～1.1×106copies/μl。结论本研究建立的一步法real-time RT-PCR方法敏感性和特异性较高,且不易出现污染引起的假阳性结果,适合用于Nipah病毒感染样本的检测。     

toxR基因作为荧光定量PCR靶基因设计TaqMan探针快速检测副溶血弧菌

以toxR基因为靶基因,通过优化反应条件建立了快速检测副溶血弧茵的TaqMan实时荧光PCR方法.特异性试验表明,该方法能选择性检测副溶血弧茵,而与金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单增李斯特杆菌等多种常见的食源性病原茵没有交叉反应:灵敏度试验表明,该方法最少可检测到25个拷贝的toxR基因重组质粒,对纯培养物和模拟食品样品直接检测的灵敏度分别为21 cfu/mL和210 cfu/g;重复性试验表明,同一样品于试验内及试验间的变异系数分别为0.9%和1.3%:所制作的标准曲线在2.5 × 101～2.5 × 106拷贝数之间有较好的线性关系,能对副溶血孤菌进行准确的定量分析.结果表明,本研究所建立的副溶血弧菌实时荧光PCR检测方法具有特异性好,灵敏度高、重复性好的特点,能进行定量检测,而且检测时间从核酸抽提到出实验结果仅需要3 h.是快速检测副溶血弧菌的有效手段.     

Hendra病毒一步法Real-time RT-PCR检测方法的建立

目的 建立针对Hendra病毒N基因的一步法Real-time RT-PCR检测方法,用于Hendra病毒感染样本的快速检测和准确定量.方法 针对Hendra病毒的保守基因N设计引物和探针,构建体外转录的RNA片段作为标准品,建立一步法Real-time RT-PCR反应方法并分析敏感性和特异性.结果 所设计的引物经Blast检索可以用于检测所有已知的Hendra病毒株.本研究建立的一步法Real-time RT-PCR方法可以特异性检测出Hendra病毒,不与Nipah病毒产生交叉反应.检测灵敏度为2.6×100～2.6×101copies/μl.标准曲线的线性范围为2.6×101～2.6×107copies/μl.结论 本研究建立的一步法Real-time RT-PCR方法敏感性和特异性较高,且不易出现污染引起的假阳性结果,适合用于Hendra病毒感染样本的检测.