Ⅰ型人免疫缺陷病毒(HIV-1)逆转录酶在大肠杆菌中的表达及其初步纯化

Ⅰ型人免疫缺陷病毒(HIV-1)逆转录酶(RT)在抗病毒感染及AIDS治疗药物的设计中是一个重要的靶分子,并且可作为工具酶应用于逆转录PCR等分子生物学研究中。本研究将HIV-1RT基因经PCR扩增并修饰后克隆入大肠杆菌表达载体pBV220,所获重组子所表达的HIV-1RT蛋白占菌体总蛋白的8％左右,且经[~3H]dTTP掺入法证实该重组HIV-1RT具有RT聚合酶活性。用Q-Sepharose层析柱对重组HIV-1RT蛋白进行了初步纯化,所获纯化样品的RT聚合酶比活性(1.7×10~4U/mg)比纯化前的裂解上清提高612倍。     

人免疫缺陷病毒的受体与辅助受体

人免疫缺陷病毒（ＨｕｍａｎＩｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙＶｉｒｕｓ,ＨＩＶ）是引起艾滋病的病原。由于该病的病死率较高,目前尚没有被广泛接受的有效的医治方法,所以世界各国对艾滋病都十分重视。在感染ＨＩＶ时,ＨＩＶ首先与靶细胞上的受体（ｒｅｃｅｐｔｏｒ...     

人类免疫缺陷病毒-1进入细胞的分子机制及相关药物的研究

艾滋病（AIDS）是由人类免疫缺陷病毒（HIV）侵染表达CD4表面抗原（CD4⁺）的T淋巴细胞而引起的.艾滋病病毒进入CD4⁺T淋巴细胞首先是通过病毒与细胞膜的融合来完成的.该融合过程涉及到病毒表面膜蛋白（gp120和gp41）与细胞表面受体蛋白（CD4和CCR5等）之间的相互作用.根据对这些蛋白质分子结构及作用机制的认识,从破坏病毒与细胞的融合入手,设计新型的抗艾滋药物及疫苗,已成为目前药物开发的新热点.     

明胶颗粒凝集试验联合ELISA法在梅毒检测中的应用价值

目的 分析明胶颗粒凝集试验(TPPA)联合酶联免疫吸附试验(ELISA)在梅毒检测中的应用价值。 方法 选择我院2015年1月至2018年12月收治的128例疑似梅毒患者为研究对象,将其中43例临床确诊患者纳入梅毒组,余下85例为非梅毒组,全部受试者均接受ELISA法联合TPPA检测,比较单独ELISA法和ELISA联合TPPA检测的结果。 结果 梅毒组患者中ELISA法诊断阳性35例,阴性8例;ELISA联合TPPA诊断阳性42例,阴性1例;ELISA法假阳性率14.63%(6/41),明显高于ELISA联合TPPA法的2.33%(1/43),差异有统计学意义(χ2=4.163,P=0.041)。ELISA联合TPPA诊断梅毒的特异性、敏感性、阴性预测值及阳性预测值分别为98.82%、97.67%、98.82%、97.67%,均显著高于单独ELISA检测的92.94%、81.40%、90.80%、85.37%,差异均有统计学意义(χ2=143.650、6.081、5.575、4.163,P结论 ELISA适用于大批量梅毒筛查,TPPA法的特异性及敏感性高,可作为梅毒血清抗体检测的确认试验。二者联合检测能够提高梅毒诊断效能,具有较高的应用价值。     

应用明胶凝集颗粒试验检测人群中T细胞白血病病毒抗体

曾毅等报道,应用间接免疫荧光法(IIF)检测了8,279份正常成年人血清标本,发现3例T细胞白血病病毒(HTLV)抗体阳性:一例马杨氏,丈夫是日本人(HTLV抗体也阳性),侨居南京46年;第二例是台湾籍妇女;第三例是位侨居北京的日本人。650份各类白血病病人血清中,一例成人T细胞白血病患者HTLV抗体阳性,此人是船员,常去日本。     

人免疫缺陷病毒Ⅰ型膜糖蛋白gp160人单链抗体

人获得性免疫缺陷综合症（ＡｃｑｕｉｒｅｄＩｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙＳｙｎｄｒｏｍｅ,简称ＡＩＤＳ）主要是由人免疫缺陷病毒Ⅰ型（ＨＩＶ１）引起的严重危害人类健康的传染病。ＨＩＶ研究的最新进展揭示了膜糖蛋白ｇｐ１２０与其受体和中和抗体复合物晶体结...     

E92A是HIV-1整合酶耐药突变N155S的活性回复突变

HIV-1整合酶是目前抗艾滋病药物研发的重要靶点之一,整合酶的耐药突变是导致整合酶抑制剂类药物治疗失败的主要原因,但突变产生耐药性的机理仍不清楚.本工作通过人工构建突变型整合酶,测试其活性和耐药性,对整合酶的耐药机理进行初步探索.构建整合酶的突变型包括E92A、N155S两种单突变及E92A/N155S双突变.通过基因工程操作引入突变、构建质粒、表达纯化得到整合酶蛋白.用基于磁珠的整合酶链转移ELISA测试整合酶的链转移活性,用S-1360和Raltegravir两种抑制剂测试整合酶的耐药性.另外,用Autodock软件做了S-1360和整合酶核心区(包括野生型和突变型)的分子对接.结果表明,N155S突变使整合酶链转移活性下降约80%,而E92A/N155S双突变仅使活性下降约42%,这表明N155S突变基础上的E92A突变可使整合酶的活性大幅回复.E92A和E92A/N155S对不同的抑制剂可产生不同的耐药性,它们对Raltegravir的耐药性强于对S-1360.突变对整合酶活性和耐药性的影响主要是通过改变整合酶活性中心结构实现的,E92A突变可能导致其与周围残基静电相互作用减弱,间接影响到D64和D116残基,产生活性回复作用.     

人类免疫缺陷病毒(HIV-1)整合酶抑制剂筛选及其活性测定

整合酶作用的病毒DNA整合进宿主DNA的过程是反转录病毒在宿主细胞中增殖的关键步骤.由于在正常人类细胞中不存在相似的功能蛋白,其抑制剂对人体的副作用可能很小,相对于经典AIDS治疗药物的毒副作用,整合酶抑制剂理论上要具有优势.在线性七肽库中筛选与整合酶有特异结合作用的噬菌体展示肽,选取TPSHSSR和HPERATL 2条肽,它们可以竞争性地抑制展示相应肽段的噬菌体与整合酶的结合,同时它们对整合酶的整合活性也有一定程度的抑制,半数抑制率分别为IC50=(54.56±5.18)μmol/L,IC50=(28.29±1.32)μmol/L.这些多肽可用于治疗艾滋病新药的开发应用及整合酶结构及作用机制的研究.     

PCR技术在猴免疫缺陷病毒(SIV)感染模型中的应用

目的(1)建立RT PCR方法,定性测定SIV感染猴血浆中病毒RNA,比较其与传统血浆病毒分离方法的敏感性;(2)建立DNA PCR方法,检测SIV感染猴外周血淋巴细胞(PBMCs)中的前病毒DNA。(3)检验DNA PCR和RNA PCR方法在猴SAIDS模型应用中的实用性和可操作性。方法用SIVmac251静脉感染恒河猴,定期采血,从血浆中提取病毒RNA,以RNA为模板通过RT PCR法扩增,凝胶电泳定性;从感染猴PBMC中提取带有整合的SIV前病毒DNA的细胞基因组DNA,巢式PCR扩增,凝胶电泳定性。结果DNA PCR和RNA PCR经两轮扩增后均得到一长度为477bp的特异条带,测序鉴定确为目的片段。9只实验猴感染SIV后7d,RNA PCR结果为79阳性,DNA PCR结果为100%阳性,而血浆病毒分离只有59阳性;此后一直到感染后的42d,RNA PCR和DNA PCR的结果一直为100%阳性,而血浆病毒分离阳性率在感染后35d下降到49,到42d时下降为零。结论PCR方法比病毒分离方法的敏感性高。尤其是DNA PCR,既可检测具有活跃病毒复制的受感染细胞,又可检测那些携带病毒处于转录休眠期的细胞,所以在感染的早期和中后期———血浆病毒水平较低的情况下或病毒处于潜伏感染的阶段,它作为猴艾滋病(SAIDS)模型病毒学指标之一有其必要性和重要性。这个指标的检测方法应该是较血浆病毒RNA检测更为敏感。     

人源单克隆抗人免疫缺陷病毒1型抗体Fab段基因的获得

应用噬苏体抗体库技术有效地筛选出了多株抗ＨＩＶ－１人源单克隆抗体。以逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）从ＨＩＶ－１感染者外周血淋巴细胞中扩增抗体轻重链可变区基因,插入载体ｐＣＯＭＢ３,建立噬菌体抗体库。分别以ＨＩＶ－１ｇｐ１２０和ｇｐ１６０为固相抗原,经过多轮筛选,从中获得了多株抗ＨＩＶ－１ｇｐ４１、ｇｐ１２０和ｇｐ１６０的单克隆抗体Ｆａｂ段基因。抗ＨＩＶ特异性噬菌体抗体随抗体库的筛选高度富集,抗     

HIV-1 P24抗原国家参考品的研制

收集正常人、HIV感染者和疑似感染者血浆以及HIV-1病毒培养裂解液,对其进行HIV抗体、HIV P24抗原、HCV抗体和HBsAg检测,对HIV P 24抗原阳性者进行HIVRNA检测,并对部分样品进行基因分型.以NIBSCP 24抗原标准品的系列稀释样品作为线性灵敏度参考品.经过实验筛选出20份阴性参考品,10份阳性参考品,10份线性灵敏度参考品,2份精密性参考品,共同组成HIV-1 P24抗原国家参考品,经多家不同的试剂进行标定,制定了相应的标准.稳定性研究结果表明,反复冻融三次对该参考品的稳定性没有影响.由此,初步建立了HIV-1 P24抗原国家参考品,该参考品将对HIV-1 P24抗原、HIV抗体/P 24抗原联合检测试剂的质量控制提供重要依据.     

套式聚合酶链反应在HIV-1检测中的应用

根据HIV-1 gag.pol和env基因序列设计了套式聚合酶链反应(nesled polymerasechain reaction,nPCR)引物。将外周血单个核细胞裂解液先用外侧引物扩增,其产物再经内侧引物扩增,直接走凝胶电泳判定结果。nPCR的敏感性。较常规PCR高100～1000倍,可检测到0.5fg质粒DNA和50μ1HIV-1感染者外周血样中的HIV基因。用本法检测63名HIV-1感染者全为阳性,而61名健康人和可疑者均为阴性,后者经追踪检测抗体排除了HIV-1感染。实验证明,nPCR是一种敏感性极高、特异性很强、操作简便易行的HIV-1基因检测技术。它已经在早期诊断和外周血病毒含量检测中发挥了重要作用,而且有着更广阔的应用前景。     

HIV—1核蛋白p24在昆虫细胞中的表达

将完整的ＨＩＶ－１ ｐ２４基因克隆到杆状病毒转移质粒中,使用重组转移质粒与野生型杆状病毒ＤＮＡ共转染Ｓｆ９昆虫细胞,经筛选获得带有编码ｐ２４基因的重组杆状病毒。重组杆状病毒感染Ｓｆ９细胞后在细胞中表达了ＨＩＶ核蛋白ｐ２４。其重组蛋白的分子量为２４ｋＤ。此重组糖蛋白在免疫荧光,免疫印染和酶联免疫实验中都能被人ＨＩＶ－１阳性血清和单克隆抗体所识别。     

Pharmacokinetics of an HIV-1 gp120-specific chimeric antibody in patients with HIV-1 disease

The pharmacokinetics of mouse V/human C (1,) chimeric monoclonal antibody CGP47 439 specific for the principal neutralizing determinant of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) was studied in patients with stage IV HIV-1 disease in an open-labeled phase I/IIA trial. Twelve male patients were enrolled and nine completed the study. Patients were divided into three groups according to the extent of CGP 47 439 to bind to gp120 from their viral isolates: undetectable for group 1, modestly reactive for group 2, and strongly reactive for group 3. A first dose of 1, 10, or 25 mg was administered by intravenous infusion to group 1, group 2 and group 3 patients, respectively. The patients then received seven doses of 50, 100, or 200 mg, respectively, every three weeks. CGP 47 439 serum concentrations were determined by an ELISA using monoclonal antibody AB19-4 specific for the idiotope of CGP 47 439. Half an hour after infusion only 25.5–36.1% of the administered antibody was found in the serum, reflecting its rapid distribution in the extravascular space and possibly binding to gp120 antigen in some of the patients. The terminal elimination half-life (T_1/2) was 16.2 days in group 1 patients, 9.7 days in group 2 and in group 3 patients 7.5 days and 9.1 days. An antibody response to CGP 47 439 was not a factor in determining elimination rates, because only very low and transient responses were found in three patients. These results suggest that the reactivity of CGP 47 439 with HIV-1 gp120 contributed to its elimination in HIV-1 infected patients.Abbreviations AIDS aquired immune deficiency syndrome - ARC AIDS-related complex - HIV-1 human immune deficiency virus type 1 - gp120 envelope glycoprotein with 120 KD molecular weight - V3 variable domain of gp120 - PND principle neutralizing determinant of gp120 - IgG immunoglobulin G - CD4⁺ lymphocytes: lymphocytes expressing the CD4 marker V_H and V_L variable heavy and variable light chain region of an antibody - C₁ and C_K constant heavy chain region of gamma l and constant K light chain region of an antibody - anti-id anti-idiotypic - AUC area under curve - T_1/2 terminal elimination half-life - ELISA enzyme-linked imuno sorbent assay - PBS phosphate buffered saline - NP-40 detergent - CDC center of disease control - GMP good manufacturing practice     

HIV-1 P24抗原国家参考品的研制

收集正常人、HIV感染者和疑似感染者血浆以及HIV-1病毒培养裂解液,对其进行HIV抗体、HIVP24抗原、HCV抗体和HBsAg检测,对HIVP24抗原阳性者进行HIVRNA检测,并对部分样品进行基因分型。以NIBSCP24抗原标准品的系列稀释样品作为线性灵敏度参考品。经过实验筛选出20份阴性参考品,10份阳性参考品,10份线性灵敏度参考品,2份精密性参考品,共同组成HIV-1P24抗原国家参考品,经多家不同的试剂进行标定,制定了相应的标准。稳定性研究结果表明,反复冻融三次对该参考品的稳定性没有影响。由此,初步建立了HIV-1P24抗原国家参考品,该参考品将对HIV-1P24抗原、HIV抗体/P24抗原联合检测试剂的质量控制提供重要依据。     

应用异源双链泳动分析法快速确定(HIV-1)基因亚型

应用异源双链泳动分析法（Ｈｅｔｅｒｏｕｄｕｐｌｅｘ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ａｓｓａｙ,ＨＭＡ）,对来自我国云南、四川、新疆、浙江、广东、福建、天津７省市７３份ＨＩＶ感染者样品,进行了ＨＩＶ－１膜蛋白（ｅｎｖ）基因片段亚型分析。通过ＨＭＡ能确定亚的有７０份,占样品总数的９５．８９％（７０／７２）。其中Ａ亚型２．８６％（２／７０）,Ｆ亚型２．８６％（２／７０）,泰国Ｂ亚型１８．５８％（１３／７０）,欧美Ｂ     

Antibody Responses Raised against a Conformational V3 Loop Peptide of HIV-1

The amino acid sequence of the principal neutralizing determinant (PND) of 224 cases of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) was determined and the most frequently occurring sequence was used as a peptide antigen for studying virus-specific antibody responses. In our present study, a linear peptide of the most frequent PND was first synthesized and then oxidized to create a disulfide-bridged loop conformation. Then, in order to construct a macromolecular structure for the purpose of increasing anti-genicity, the synthetic peptide was conjugated to a core peptide. We compared the immunogenicity of the disulfide-bridged loop PND peptide antigen (AG4) and the linear PND peptide antigen (AG5). After immunizing rabbits 5 and 6 times with both peptides, the results obtained using ELISA revealed that AG4 (conformational-loop type) was more capable of inducing a high titer of antigen-specific antibodies than was AG5 (linear type). Despite an amino acid sequence homology of 72%, a 1:8 dilution of serum raised against AG4 inhibited 81.9% of HIV-1_IIIB-mediated cell fusion, suggesting that conformational V3 loop peptide is able to elicit an antibody response which is strongly HIV-1-specific.     

HIV-1 CN54 Pol P51抗原高效表达、纯化、复性及在抗体检测中的应用

为获得可溶性高纯度HIV-1中国株CN54PolP51抗原,将携带CN54polp51基因的重组质粒pTHioHisA51转化大肠杆菌BL21codonplus-RIL,用IPTG进行诱导表达。用Chelating SepharoseFF-Ni亲和层析柱及DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱纯化目的蛋白,采用透析复性法得到可溶性抗原,Western blotting检测目的蛋白。用纯化的P51抗原蛋白标记辣根过氧化物酶及包被酶标板进行双抗原夹心法ELISA检测。结果显示P51以包涵体的形式表达,表达量占菌体总蛋白的50%,经两步层析和透析复性,目的蛋白纯度大于95%。Western blotting和双抗原夹心法ELISA检测均显示了良好的灵敏度和特异性。本研究可以为HIV-1疫苗研究和开发检测试剂提供支持。