肠三叶因子表达载体构建及在酵母菌GS115中的表达

目的:构建肠三叶因子(ITF)的真核表达载体,并在酵母菌GS115中表达,为进一步研究ITF的生理和药理功能奠定基础。方法:通过RT-PCR获得ITF cDNA片断,将目的基因插入pPICZαA酵母表达载体,得到重组载体pPICZαA-ITF。经BspHI线性化后氯化锂转化进入GS115,Zeocin筛选转化酵母菌,PCR鉴定目的基因。阳性转化子经摇瓶表达,取上清TCA沉淀后做Tricine SDS-PAGE分析及Western blot检测表达蛋白。结果:经测序及PCR证实ITF cDNA准确插入酵母表达载体pPICZαA中。Tricille SDS-PAGE分析证明ITF的分子量约为14×10~3,表达蛋白具有良好的抗原性和特异性。结论:成功构建了真核表达载体pPICZαA-ITF,在酵母菌GS115中表达,获得重组ITF蛋白。     

人小肠三叶因子在大肠杆菌中的表达

利用PCR技术将人小肠三叶因子(hITF)基因重组入表达载体pGEX-4T-1,构建了融合蛋白GST-hITF的重组表达质粒pGTF,在大肠杆菌中诱导表达。表达的融合蛋白经亲和层析、凝血酶切和凝胶过滤层析得到纯化的hITF蛋白。测定了重组蛋白的氨基酸组成、分子量及其对酸和蛋白酶的抗性。Western印迹表明重组蛋白具有hITF的抗原性,并对大鼠胃溃疡具有明显的预防和保护作用。     

肠毒素大肠杆菌定居因子CS6蛋白的纯化和抗体制备

将大肠杆菌E519／66A在CFA固体培养基上培养,收菌后经热水浴脱蛋白、硫酸铵分级盐析、超速离心及S-200柱纯化,获得了相对分子量约14600的高纯度CS6蛋白。用其免疫家兔,然后颈动脉采血。ELSIA法检测血清,测得效价为1：32000。Westem印迹证实CS6抗原蛋白可特异性结合抗CS6多克隆抗血清。本研究建立了分离纯化肠毒素大肠杆菌定居因子CS6抗原蛋白的有效方法;获得了高纯度的野生型定居因子抗原CS6蛋白及相应的多克隆抗血清。对于进一步研究肠毒素大肠杆菌腹泻疫苗具有重要意义。     

大肠杆菌系统表达抗体片段

抗体在生物学研究以及在医学和工业应用方面的作用越来越重要,这是因为几乎所有物质都能产生抗体,并且抗体对靶物质有相当高的专一性和亲合性。抗体在与抗原结合后还有     

中性白细胞抑制因子在大肠杆菌中的表达与纯化

利用PCR技术扩增编码钩虫中性白细胞抑制因子(NIF)成熟肽的cDNA,克隆于表达载体pET-21a( )。序列分析表明与献报道一致。经IPTG诱导,在大肠杆菌BL21(DE3)plys中实现高效可溶性表达。SDS—PAGE分析结果表明,外源蛋白(相对分子质量28900)约占全菌蛋白的20％。菌体用溶菌酶处理。上清经Q—Sepharose FF阴离子交换、羟基磷灰石层析、Sephacryl S-100凝胶过滤,得到纯度约95％的重组NIF。活性测定结果表明,大肠杆菌表达的重组NIF能有效地抑制中性白细胞粘附。这些结果为利用大肠杆菌制备重组NIF奠定了基础。     

人小肠三叶因子在毕赤酵母中克隆表达及对肠粘膜修复作用的研究

为了研究人肠三叶因子(hITF)对肠粘膜的保护作用,利用RT-PCR从肠粘膜中扩增出hITF基因片段,与诱导分泌型毕赤酵母载体pPIC9连接构建了重组质粒pPIC9hITF,重组质粒转化至宿主菌GS115,经过PCR鉴定和转化子发酵筛选,得到一个重组毕赤酵母高产菌株GS115/pPIC9hITF。在5L发酵罐中用基本盐培养基培养重组菌株,添加甲醇诱导表达hITF,离心收集的上清液通过离心交换层析纯化得到hITF。质谱鉴定结果表明纯化的hITF与天然提取产品在N端序列上完全相同。细胞实验和动物实验结果表明重组hITF能够促进细胞迁移,并可以保护肠粘膜免受有害因子的侵袭,保持了较好的生物学活性。     

转录因子CTCF的克隆、表达及其抗体制备

用RT-PCR方法从HeLa细胞总RNA中扩增转录因子CTCF的cDNA序列,克隆至pGEM-TEasy载体上。将CTCF蛋白N段的编码序列亚克隆至pET22b( )载体中,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并用镍柱进行亲和纯化。用纯化后的CTCFN段蛋白免疫家兔,获得CTCF的多克隆抗体,进而用于细胞内CTCF蛋白的免疫印迹检测。     

棉铃虫蜕皮调节转录因子在大肠杆菌中的重组表达及其包涵体纯化

蜕皮调节转录因子(hormone receptor 3,HR3)在昆虫蜕皮过程中启动蜕皮相关早期基因簇表达,并抑制蜕皮相关晚期基因簇表达,对昆虫蜕皮级联反应起着关键的调控作用。利用合成的特异性引物通过RT-PCR扩增了棉铃虫 Helicoverpa armigera 蜕皮调节转录因子(HHR3),并与pGEX-4T-1载体连接,在大肠杆菌Escherichia coli DH5α内进行扩增,经过PCR筛选获得了HHR3-pGEX-4T-1重组质粒。 用该质粒转化大肠杆菌表达菌株BL21并进行诱导表达,获得了与谷胱甘肽-S转移酶（GST）融合表达的HHR3包涵体,分子量在94 kD左右,通过无离子去垢剂CAPS（3-［cyclohexylamino］-1-propanesulfonic acid）变性、复性后获得了可溶性GST-HHR3融合蛋白,经凝血酶裂解和SDS-PAGE分离得到纯化的HHR3,经蛋白质N-端测序确认表达正确。用重组表达的HHR3免疫家兔,制备了兔抗HHR3多克隆抗体,免疫印迹检测显示该抗体对HHR3有特异性识别能力, 可以用于HHR3功能与调控等下游研究。免疫印迹检测结果还表明,HHR3在5龄向6龄蜕皮的幼虫脂肪体中高表达,在进入6龄24 h 的幼虫脂肪体中含量明显下降,在6 龄72 h 的幼虫中肠中没有检测到HHR3表达;成虫卵巢中有HHR3表达。     

单克隆非特异性抑制因子—β（MNSFβ）在大肠杆菌中的表达、抗体的制备及在小鼠子宫内膜上的组织定位

为了获得足够量的单克隆非特异性抑制因子-β蛋白（monoclonal nonspecific supressor factorβ,MNSFβ）及其抗体用于探讨MNSFβ在着床中的作用机理,本研究构建了表达质粒pBV220/MNSFβ-hCCβ,在大肠杆菌中表达了融合蛋白MNSFβ-hCCβ,用抗hCGβ抗体对表达产物进行鉴定,结果表明融合蛋白MNSFβ-hCGβ得到了正确表达,且分子量和理论值相近,表达产物MNSFβ-hCGβ经初步纯化后用于免疫Balb/C小鼠,制备抗体,同时,我们还构建了表达质粒pGEX-4T-2/MNSFβ,在大肠杆菌中表达了融合蛋白GST-MNSFβ,用融合蛋白GST-MNSFβ对融合前的免疫小鼠回忆刺激并进行检测,制备了抗MNSFβ多克隆抗体和单克隆抗体,应用所制备的多克隆抗体进行免疫组化研究,对MNSFβ在小鼠子宫内膜上进行了组织定位,结果显示,MNSFβ在着床日（受精后第4.5天）小鼠子宫非着床位点的表达和着床位点相比明显提高。     

人三叶因子3在毕氏酵母中的表达及生物活性分析

利用PCR方法在人胎儿胎盘cDNA中扩增了人三叶因子3基因（hTFF3）,插入到含有AOX1启动子和α－因子信号肽序列的表达载体pPIC9K中,采用毕氏酵母表达系统对其进行了高效的分泌表达,并用G418筛选高拷贝整合转化子。2％甲醇诱导酵母表达48h后,上清经SDS－PAGE和Western印迹证明重组蛋白质以双体的形式分泌表达,占总蛋白质的45％,能被抗hTFF3抗体所识别。表达产物经S－Sepharose、Q-Sepharose离子交换及Sephacryl S-100纯化后纯度达到95％以上。体内生物学活性研究证实hTFF3可有效的防止盐酸诱导的大鼠胃溃疡。     

人小肠三叶因子（hITF）基因在生菜中的整合与表达

用根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens(Smith et Townsend)conn)介导的叶盘法,将人小肠三叶因子（hITF)导入生菜（Lactuca sativa L.)中,在含有除草上培养基上筛选,获得抗性植株,通过PCR和Southern印迹分析证明,hITF cDNA已整合到生菜基因组中,Western印迹分析证明hITF在生菜中的表达。ELISA检测表明,hITF在生菜新鲜叶片中的表达量为200－300ng/g,最高达700ng/g,约占总可溶性蛋白的0．1％。     

人小肠三叶因子缺失半胱氨酸57突变体的构建及其生物活性

用 PCR方法构建了一个不能形成二聚体的 C端缺失半胱氨酸 57的 h ITF突变体 .将其克隆到大肠杆菌表达载体 p GEX- 4T- 1中 ,ITPG诱导表达 ,融合蛋白经 Glutathione- Sepharose 4B亲和层析 ,凝血酶酶切和 Sephacryl S 1 0 0纯化 ,得到突变体蛋白 .SDS- PAGE,氨基酸组成 ,飞行质谱 ,N端氨基酸序列测定结果与期望值一致 .研究表明突变体的生物学活性有所降低 .对胃蛋白酶作用的稳定性降低 .     

人小肠三叶因子在糙皮侧耳中的整合、表达及检测

用原生质体法将含双 35S_AMV启动子及人小肠三叶因子 (hITF)cDNA的表达载体导入糙皮侧耳 (Pleurotusostreatus)中 ,原生质体转化子在含有除草剂的培养基上初步筛选 ,获得抗性菌株。通过PCR分析证明hITFcDNA已整合到侧耳基因组中。以hITF为抗原免疫家兔制备了抗血清 ,纯化后的IgG以直接型酶联免疫吸附检测 (ELISA)方法测定效价 ,并建立起hITF的竞争型酶联免疫吸附检测 (ELISA)方法 ,给出了标准工作曲线 ,以应用于大规模表达菌株的筛选确立。检测表明 ,hITF在侧耳新鲜菌丝体中分 3个表达量段 :10 0 0～ 12 5 0ng g、14 80～ 170 0ng g、最高达2 0 0 0～ 2 2 5 0ng g ,约占总可溶性蛋白的 0 7%～ 1 5 %。Western印迹进一步分析证明hITF在侧耳中的表达。     

人三叶因子1大肠杆菌及毕赤酵母表达载体的构建与鉴定

目的:构建人三叶因子1(hTFF1)的大肠杆菌及毕赤酵母表达载体。方法:从人胃窦部提取总RNA,经RT-PCR得到hTFF1 cDNA,用PCR方法扩增hTFF1基因,并将其分别克隆到大肠杆菌的表达载体pET32α及毕赤酵母的表达载体pCAPZαA中,构建原核及真核重组表达质粒pET32α-hTFF1和pGAPZαA-hTFF1。结果:通过双酶切和基因序列分析确定插入pET32α和pGAPZαA中的片段为hTFF1基因片段。结论:重组质粒pET32α-hTFF1和pGAPZαA-hTFF1成功构建,为在比较原核和真核细胞中hTFF1高效表达的情况及下一步的功能研究奠定了基础。     

人小肠三叶因子的理化性质及光谱学行为

酵母表达的重组人小肠三叶因子(rh-ITF)飞行质谱测定二聚体的分子量为13154,等电点约为4.5～4.75.紫外和荧光光谱表明rh-ITF在pH2.7～8.4和pH2.7～7.7时,吸收值增加。随pH进一步增加,吸收值降低。推测色氨酸和酪氨酸所处微环境发生了一定的变化。园二色谱表明在不同pH下,rh-ITF所含二级结构百分数有所变化,但仍保留有一定的二级结构,即含有一定数量的α-helix,β-sheet或β-turn,其三级结构基本不变。光电滴定和有机溶剂微扰法表明rh-ITF分子中有两个酪氨酸,一个处于分子表面,另一个参与氢键的形成或存在于一个非极性的环境中。rh-ITF中的色氨酸处于分子内部。另外,质谱测定rh-ITF在体外对酸和蛋白酶有一定的抗性     

重组人胰激肽原酶在大肠杆菌中的表达

根据人胰激肽原酶的氨基酸序列,采用大肠杆菌偏爱密码子,设计合成目的基因片段约750 bp.将设计得到的片段连接到pET-22b(+)表达载体中并测序,将重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta中进行诱导表达.将IPTG诱导表达的菌体进行SDS-PAGE电泳,在相对分子质量24 kD处可明显观察到高表达带,主要以包涵体形式存在,质量分数可达21.6％,进一步测得蛋白活性为2.27 nmol/s.利用MALDI串联飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS/MS)鉴定蛋白,蛋白得分106,大于可信得分83(P ＜0.05),确定了蛋白一级结构的正确性.