疆夜蛾Plus-C气味结合蛋白PsauOBP7的组织表达谱及配体结合特性分析

【目的】明确疆夜蛾Peridroma saucia Plus-C气味结合蛋白PsauOBP7在不同化学感受器官中的表达谱，解析PsauOBP7重组蛋白的气味结合特异性。【方法】通过qRT-PCR检测PsauOBP7在疆夜蛾雌蛾和雄蛾的触角、口器、足和翅中的表达谱。原核表达并纯化PsauOBP7重组蛋白，利用Western blot检测PsauOBP7在疆夜蛾不同龄期幼虫头部及成虫不同组织中的表达情况；通过荧光竞争结合实验检测PsauOBP7重组蛋白对39种气味化合物的结合能力。【结果】成功表达并纯化PsauOBP7重组蛋白。qRT-PCR及Western blot检测显示PsauOBP7表达于4-6龄幼虫头部及雌雄成虫的触角、口器、足和翅中。荧光竞争结合实验显示PsauOBP7与反-2-己烯醛的结合能力最强，Ki=1.4 μmol/L。此外，PsauOBP7与5种酯类化合物乙酸月桂酯、顺-3-己烯乙酸酯、乙酸苯乙酯、苯甲酸己酯和肉桂酸甲酯有一定的结合能力，Ki值分别为5.7, 6.5, 8.9, 9.5和10.2 μmol/L。PsauOBP7与两种醇类化合物顺-3-己烯-1-醇和法尼醇也有较强的结合能力, Ki值分别为5.8和5.9 μmol/L。【结论】疆夜蛾Plus-C气味结合蛋白PsauOBP7表达于其幼虫和成虫的多种化学感受器官中，且能结合多种植物气味化合物，说明其在疆夜蛾寻找寄主植物过程中发挥重要作用。     

甘薯蚁象气味结合蛋白CforOBP8的基因表达谱及配体结合特性分析

【目的】明确甘薯蚁象Cylas formicarius气味结合蛋白(odorant binding protein, OBP) OBP8的基因表达谱及与配体化合物的结合特性。【方法】基于甘薯蚁象成虫转录组数据,利用RT-PCR方法从甘薯蚁象成虫触角中克隆了气味结合蛋白OBP8基因,并进行生物信息学分析;采用qPCR方法测定该基因在甘薯蚁象成虫触角、口器、翅和跗节中的表达谱;构建原核表达载体,进行诱导表达及蛋白纯化。利用荧光竞争结合实验测定纯化的重组蛋白与16种配体化合物(1种性信息素和15种植物挥发物)的结合特性。【结果】获得甘薯蚁象气味结合蛋白基因CforOBP8(GenBank登录号:MH549528)的完整编码序列,其开放阅读框长414 bp,编码138个氨基酸,预测分子量为15.56 kD,等电点为4.71,N末端具有21个氨基酸组成的信号肽序列,蛋白序列具有4个保守的半胱氨酸,CforOBP8属于Minus-C OBPs亚家族。荧光定量PCR结果表明,CforOBP8在甘薯蚁象成虫触角中特异性表达,在其他组织中微量表达。SDS-PAGE结果显示融合蛋白成功表达。CforOBP8与配体化合物的结合力测试表明,CforOBP8与性信息素(E)-2-丁烯酸顺-(Z)-3十二烯基酯结合能力最强,解离常数K_i为4.13μmol/L;其次与5种植物挥发物也有一定的结合能力,依次为乙酸顺-3-己烯酯(K_i=7.54μmol/L)、柠檬烯(K_i=15.23μmol/L)、橙花醇(K_i=16.31μmol/L)、壬醛(K_i=28.71μmol/L)和苯乙醛(K_i=29.54μmol/L)。【结论】CforOBP8可能是甘薯蚁象性信息素结合蛋白,并且在感受性信息素和寄主植物挥发物的过程中都发挥作用。     

小地老虎化学感受蛋白AipsCSP8的表达及配体结合特性分析

【目的】本研究旨在解析小地老虎Agrotis ipsilon化学感受蛋白AipsCSP8的表达谱及配体结合特征。【方法】利用qRT-PCR方法测定了AipsCSP8在小地老虎成虫头、胸、腹、足、翅、性腺(附腺)、触角、喙和下唇须以及雌雄虫羽化前后触角中的表达水平。体外重组表达AipsCSP8蛋白,通过荧光竞争结合实验测定重组蛋白AipsCSP8对24种性信息素、22种植物挥发物和10种化学农药的结合特性。【结果】qRT-PCR检测结果显示,AipsCSP8在小地老虎雄成虫的足和下唇须中表达量最高,在附腺和触角中的表达量次之;在雌成虫的触角中表达量最高,在足、性腺、下唇须中的表达量次之。另外,雄、雌虫触角中AipsCSP8表达量分别在成虫羽化前1 d和羽化当天达到顶峰。荧光竞争结合实验结果表明,重组蛋白AipsCSP8对植物挥发物邻苯二甲酸-丁酯(解离常数Ki=14.6 μmol/L)、苯乙醛(Ki=17.2 μmol/L)以及化学农药阿维菌素(Ki=12.9 μmol/L)均有较强的结合能力。【结论】化学感受蛋白AipsCSP8可能参与小地老虎嗅觉行为及味觉识别,并可能在小地老虎感受化学农药的过程中发挥作用。     

棉铃虫气味结合蛋白HarmOBP16的组织表达谱及配基结合特性分析

【目的】揭示棉铃虫Helicoverpa armigera气味结合蛋白(odorant binding protein,OBP)基因Harm OBP16的组织表达谱及其重组蛋白与气味化合物的结合特性。【方法】基于棉铃虫触角转录组数据,利用PCR技术从棉铃虫成虫触角中PCR克隆气味结合蛋白基因,并进行生物信息学和系统进化分析;采用qPCR对其进行组织[头部(去除触角和喙)、胸部、腹部、足、翅、触角和喙]表达谱分析;进一步采用原核表达系统表达和纯化重组蛋白;最后采用荧光竞争结合实验测定该重组蛋白与85种候选气味物质的结合能力。【结果】从棉铃虫成虫触角中克隆得到一个Atypical OBP家族基因Harm OBP16(Gen Bank登录号:JQ753074),其开放阅读框长441 bp,编码146个氨基酸,推断的编码蛋白等电点为6.87,具有10个保守的半胱氨酸。组织表达谱结果表明,Harm OBP16在雌成虫翅中高表达。纯化后的重组蛋白Harm OBP16对植物花的挥发物香叶基丙酮(Ki=14.2μmol/L)、β-紫罗兰酮(Ki=15.2μmol/L)、辛醛(Ki=15.3μmol/L)、芳樟醇(Ki=16.8μmol/L)、(R)-(+)-柠檬烯(Ki=14.9μmol/L)和β-蒎烯(Ki=17.3μmol/L)有较强的结合能力。【结论】Harm OBP16可能在棉铃虫识别寄主植物的过程中发挥一定的作用,可为基于气味物质的棉铃虫引诱剂或驱避剂的研发提供潜在的分子靶标。     

光肩星天牛气味结合蛋白AglaOBP12的基因克隆、表达及配体结合特征

【目的】克隆和鉴定光肩星天牛Anoplophora glabripennis气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)基因,明确其表达特点及与寄主植物挥发物的结合特性,有助于阐明光肩星天牛嗅觉识别的分子机制。【方法】根据光肩星天牛雌成虫触角转录组数据,利用RT-PCR克隆OBP12基因,并进行生物信息学分析。通过实时定量PCR(qRT-PCR)测定OBP12在光肩星天牛成虫触角、头(移除触角)、胸、腹、足、翅中的转录水平。利用原核表达系统和Ni离子亲和层析技术表达和纯化OBP12重组蛋白,荧光竞争结合实验测定重组蛋白与39种气味配体的结合能力。【结果】获得光肩星天牛气味结合蛋白基因AglaOBP12(GenBank登录号:KX890109)的完整编码序列,其开放阅读框长414 bp,编码137个氨基酸,N末端具有18个氨基酸组成的信号肽序列,蛋白序列具有6个保守的半胱氨酸残基,Agla OPB12属于Classical OBPs亚家族基因。qRT-PCR测定结果表明,AglaOBP12主要在成虫触角中表达,在其他组织微量表达。在待测的39种寄主植物挥发物中,重组蛋白AglaOBP12仅与19种化合物具有结合活性,表明AglaOBP12对寄主植物挥发物具有明显的选择结合特性。重组蛋白AglaOBP12与十二烷醇、十四烷醇、法尼醇、十二醛、乙酸-顺-3-己烯酯和β-石竹烯的结合能力较强,结合常数分别为1.96,0.96,1.03,0.82,0.77和0.74μmol/L。【结论】明确了AglaOBP12的核苷酸和氨基酸序列组成,重组AglaOBP12蛋白与主链有12个碳原子的醇类、醛类和萜烯类挥发物有特异性的结合活性。根据AglaOBP12基因的表达特点和重组蛋白的结合特性,推测AglaOBP12在光肩星天牛成虫定位补充营养寄主植物中发挥重要作用。     

中红侧沟茧蜂气味结合蛋白MmedOBP18的原核表达及配体结合特性

【目的】研究中红侧沟茧蜂Microplitis mediator气味结合蛋白MmedOBP18在触角中的表达定位,解析MmedOBP18重组蛋白的配体结合特性。【方法】原核表达中红侧沟茧蜂气味结合蛋白MmedOBP18;采用荧光免疫组织化学技术研究MmedOBP18在中红侧沟茧蜂雌蜂触角中的表达定位;通过荧光竞争结合实验分析MmedOBP18重组蛋白与99种候选配体的结合特性。【结果】在原核表达系统中成功表达MmedOBP18重组蛋白。荧光免疫定位结果显示MmedOBP18主要表达在触角锥形感器Ⅰ内的淋巴液中。荧光竞争结合实验结果表明,MmedOBP18重组蛋白能够与16种候选配体结合,与低挥发性植物挥发物2-十三酮、十二醛、十四酸和十一酸的结合能力最强,其解离常数K_i值分别为5.21, 6.42, 6.49和6.58μmol/L;而且MmedOBP18重组蛋白与非挥发性植物次生物质棕榈酸、棉酚、槲皮素及亚麻酸也有较强的结合能力,K_i值分别为3.86, 5.07, 5.08和6.51μmol/L;此外,MmedOBP18重组蛋白与鳞翅目昆虫性信息素组分顺-9-十四碳烯醛及顺-11-十六碳醛表现出较强的结合能力,K_i值分别为9.09和11.67μmol/L,提示该蛋白在寄主定位过程中可发挥重要的作用。【结论】中红侧沟茧蜂气味结合蛋白MmedOBP18能够结合长链低挥发和非挥发性化合物,推测其在嗅觉和味觉识别中发挥双重功能,主要参与对寄主和寄主生境的化学信息的近距离识别。     

梨小食心虫Minus-C气味结合蛋白的分子克隆、表达谱及结合特性分析

【目的】通过克隆梨小食心虫Grapholita molesta的Minus-C气味结合蛋白(odorant binding protein,OBP)基因,并测定其在成虫不同组织中的表达量及其重组蛋白对气味配体的结合能力,推测其嗅觉生理功能。【方法】基于梨小食心虫雌虫触角转录组测序数据,利用RT-PCR克隆MinusC OBP基因的完整编码区;qPCR测定该基因在成虫不同组织[触角、头(去除触角)、胸、腹、足、翅]中的表达量;构建原核表达系统表达重组蛋白,利用SDS-PAGE和Western blot检测蛋白的表达和纯度;运用荧光竞争结合实验测定重组蛋白与35种气味配体的结合能力。【结果】成功克隆了梨小食心虫的一个Minus-C OBP基因,命名为GmolOBP14(GenBank登录号:MF066361)。GmolOBP14开放阅读框长411 bp,编码136个氨基酸,成熟蛋白具有4个保守的半胱氨酸残基,属于Minus-C OBP亚家族。GmolOBP14在雌雄成虫的不同组织中均有表达,但在雄成虫翅和雌成虫触角中的表达量显著高于同性别的其他组织。重组蛋白GmolOBP14与气味配体的结合谱较窄,仅能与16种配体表现出不同程度的结合活性,其中与梨酯和十二醛的结合能力较强,解离常数Ki分别为6.92和12.74μmol/L;与癸醛、十四醛、顺-3-己烯-1-醇、苯甲醇和己酸丁酯有中等程度的结合活性,Ki分别为25.54,20.61,24.35,23.44和23.33μmol/L;GmolOBP14对性信息素组分没有结合活性,提示该蛋白不参与对性信息素的感受和识别。【结论】根据GmolOBP14基因的组织表达特点及其重组蛋白的结合特性,推测GmolOBP14除具有选择性结合和运输寄主植物挥发物的作用外,还参与与嗅觉无关的生理过程。     

悬铃木方翅网蝽触角气味结合蛋白基因鉴定

【目的】悬铃木方翅网蝽Corythucha ciliata是专性危害悬铃木属Platanus植物的外来入侵害虫,本研究旨在获得该害虫触角中气味结合蛋白(OBPs)基因信息,以期寻求有效控制害虫的嗅觉分子靶标。【方法】利用Illumina HiSeq~(TM) 4000高通量测序技术对悬铃木方翅网蝽雌雄成虫触角进行转录组测序并对测序结果进行生物信息学分析;通过实时荧光定量PCR(qPCR)方法,分析OBP基因在悬铃木方翅网蝽雌雄成虫触角中的表达模式。【结果】对悬铃木方翅网蝽雌雄成虫触角6个样品的转录组测序,共获得40.87 Gb clean reads,各样品的序列长度均达到6.31 Gb。转录组数据分析共鉴定出26个推测的悬铃木方翅网蝽OBP基因,其编码蛋白中24个(CcilOBP1-24)属于Classic OBPs,CcilOBP25/26属于Plus-C OBPs;与半翅目其他昆虫相关OBPs系统发育分析表明,大部分CcilOBPs形成独立一簇,少数与其他半翅目昆虫OBPs直系同源。qPCR分析显示,有11个OBP基因在雌雄成虫触角中表达量差异显著,其中有9个OBP基因(CcilOBP5/6/9/10/17/18/21/24/25)在雄成虫触角中显著高表达,有2个OBP基因(CcilOBP14/16)在雌成虫触角中显著高表达。【结论】本研究获得了悬铃木方翅网蝽成虫触角气味结合蛋白基因信息,研究结果为生物控制该害虫提供了重要基础数据和候选分子靶标。     

绿盲蝽八个普通气味受体基因的克隆及功能鉴定

【目的】本研究旨在克隆绿盲蝽Apolygus lucorum的气味受体基因,明确这些气味受体基因在绿盲蝽成虫不同组织中的表达水平及对主要寄主植物挥发物的电生理反应,为揭示绿盲蝽对寄主植物的识别机制提供理论基础。【方法】在绿盲蝽成虫触角转录组测序与分析的基础上,通过PCR技术克隆得到8个具有完整ORF的气味受体基因序列。用qPCR研究这8个基因在雌雄成虫不同组织(触角、无触角的头、胸、腹、足和翅)中的表达水平。然后通过爪蟾卵母细胞体外表达结合双电极电压钳技术测试这些气味受体对56种气味化合物的电生理反应。【结果】克隆得到了绿盲蝽8个气味受体基因AlucOR9, AlucOR16,AlucOR38, AlucOR53, AlucOR55, AlucOR56, AlucOR57和AlucOR58的cDNA全长序列(GenBank登录号:MN905538-MN905545)。这些气味受体含有7个跨膜结构域,且N末端位于胞内,C末端位于胞外,符合昆虫气味受体的典型特征。qPCR结果表明,这8个气味受体基因均在绿盲蝽成虫触角中高表达,而在其他组织中低表达,其中除AlucOR38外的其他7个气味受体基因在雌雄成虫触角间存在显著的表达差异。双电极电压钳记录结果显示,AlucOR57对其中15种气味化合物(苯甲醛、氧化石竹烯、庚醛、反-2-己烯醛、乙酸苯甲酯、桃金娘烯醛、4-乙基苯甲醛、乙酸壬酯、四氢芳樟醇、十三烷、反-3-己烯醇、2-丙烯酸丁酯、丙酸丁酯、乙酸辛酯和乙酸戊酯)有反应,其余7个气味受体对测试的全部气味化合物均无反应。【结论】AlucOR57对测试的一些气味化合物有反应,推测其在绿盲蝽的寄主识别过程中发挥重要作用;其他7个气味受体对测试气味化合物均无反应,其功能有待进一步研究。     

双委夜蛾气味结合蛋白AdisOBP6的原核表达抗体制备及表达谱分析

【目的】本研究旨在对双委夜蛾Athetis dissimilis气味结合蛋白OBP6进行原核表达、抗体制备以及表达谱分析,便于今后对AdisOBP6功能展开研究。【方法】利用生物信息学软件分析AdisOBP6蛋白结构特征;利用通过原核表达获得的重组蛋白4次免疫新西兰大白兔,制备AdisOBP6抗体;采用荧光定量PCR和Western blot技术检测AdisOBP6在双委夜蛾雌雄成虫触角、不同时期精巢以及受精卵和未受精卵中的表达情况。【结果】同源建模预测显示,AdisOBP6具有6个保守半胱氨酸残基和7个α-螺旋结构,并 折叠成一个结合口袋。原核表达结果显示,在20℃下0.5 mmol/L IPTG诱导重组蛋白表达量最多、最稳定。4次免疫重复中,抗体效价分别超过1∶512 000, 1∶512 000, 1∶512 000和1∶64 000。Westernblot检测获得的抗体与AdisOBP6蛋白能够特异性结合。荧光定量PCR结果显示,AdisOBP6在双委夜蛾精巢中的表达量远高于在触角中的,在幼虫期精巢中AdisOBP6就已经开始表达,在蛹期精巢中表达量低于在幼虫期的, 成虫羽化后精巢中的表达量逐渐进入高峰,在未受精卵和受精卵中几乎不表达或表达量极低。Western blot分析发现,AdisOBP6蛋白也主要在精巢中表达,在雌雄成虫触角、受精卵和未受精卵中表达量很低。【结论】本研究实现了AdisOBP6的原核表达,成功地制备了抗体;并证实AdisOBP6在双委夜蛾精巢中大量表达,成虫羽化后表达量达到高峰,推测AdisOBP6可能参与了授精过程。本研究结果为今后进一步研究AdisOBP6的功能奠定了基础。     

小菜蛾触角结合蛋白PxylOBP31的鉴定与结合特性分析

【目的】触角结合蛋白(antennal binding proteins,ABPs)为昆虫气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)家族的一个亚类,是昆虫识别和响应外界环境中气味信号的载体之一,对昆虫的生存和繁衍有着重要的意义。明确触角结合蛋白在小菜蛾Plutella xylostella(L.)嗅觉识别中的作用,有助于揭示小菜蛾嗅觉识别分子机制。【方法】利用PCR技术克隆小菜蛾的一个触角结合蛋白基因;采用实时荧光定量PCR技术对该基因在小菜蛾不同发育阶段和成虫不同组织中的表达量进行分析;利用荧光竞争结合实验测试该触角结合蛋白与39种配基化合物的结合特性。【结果】成功克隆了一个小菜蛾触角结合蛋白基因,命名为Pxyl OBP31(Gen Bank登录号:KT156676)。序列分析结果显示,其开放阅读框全长411 bp,编码136个氨基酸,N端自起始位置开始21个氨基酸为信号肽,含有气味结合蛋白家族的6个保守半胱氨酸残基,预测分子量为14.74 k D,等电点为4.41。表达谱分析表明,Pxyl OBP31主要在雄蛾中表达,且交配后的雄蛾中表达量明显降低;该基因在小菜蛾触角中有较高表达,在雄蛾触角中的表达量比雌蛾触角中高近2倍。结合特性实验结果显示,Pxyl OBP31与醛、酮、萜品油烯以及邻苯二甲酸二异丁酯等物质的结合能力较强,与3种性信息素及其他烯烃与酯类结合能力弱。【结论】本研究明确了Pxyl OBP31的核苷酸序列以及发育和组织表达谱。根据qRT-PCR和荧光竞争结合实验结果,推测Pxyl OBP31蛋白可能与小菜蛾觅偶、定位寄主植物等行为有关。     

亚洲小车蝗触角转录组及化学感受蛋白基因表达谱分析(英文)

【目的】化学感受蛋白(chemosensory proteins, CSPs)是一类小分子的可溶性蛋白,在昆虫中发挥多种作用。本研究旨在组装中国北方主要草原害虫之一——亚洲小车蝗Oedaleus asiaticus的触角转录组,鉴定出化学感受蛋白基因以及分析其在成虫不同组织中的表达水平。【方法】利用RNA-s eq 亚洲小车蝗成虫触角进行转录组测序和组装;通过筛选转录组数据库、克隆及测序,鉴定出化学感受蛋白基因;应用qPCR分析CSP基因在成虫不同组织(触角、去除触角和口器的头、上唇、去掉下唇须的下唇、下唇须、下颚须、胸部、跗节、翅和腹部)中的表达模式。【结果】成功构建了亚洲小车蝗成虫触角转录组,共获得61 629个unigenes,平均长度为733 nt,总长度和N50分别为45 175 449和1 130 nt。其中26 064个unigenes(42.29％)注释到6个数据库(NR, NT, Swiss-Prot, KEGG, COG和GO)。通过Blast验证、克隆和测序鉴定出17个CSP基因;BlastP和系统发育分析表明亚洲小车蝗CSPs(OasiCSPs)与东亚飞蝗Locusta migratoria CSPs(LmigCSPs)和沙漠蝗Schistocerca gregaria CSPs(SgreCSPs)关系最密切。qPCR分析表明,8个CSP基因在成虫不同组织中的表达水平存在显着差异,特别是,OasiCSP8在下唇须和下颚须中高表达,而OasiCSP11和OasiCSP13在触角中表达量最高。OasiCSP15在化学感受器官(触角、上唇、去掉下唇须的下唇、下唇须、下颚须和跗节)中的表达量远高于非化学感受器官(去掉触角和口器的头部、胸部、翅和腹部)中的表达量,而OasiCSP12在几乎所有测定的组织中具有相似的表达分布。【结论】OasiCSPs在亚洲小车蝗化学感受和发育过程中可能起着多种作用,这些结果为进一步研究这些化学感受蛋白在亚洲小车蝗中的功能奠定了基础。     

气味结合蛋白MmedOBP19在中红侧沟茧蜂足部的表达及配体结合特征

【目的】明确气味结合蛋白基因Mmed OBP19在中红侧沟茧蜂Microplitis mediator足部的表达定位及重组Mmed OBP19的配体结合特征。【方法】利用扫描电镜观察化学感器在中红侧沟茧蜂足部的分布,通过原位杂交研究Mmed OBP19在中红侧沟茧蜂雌蜂前足中的表达定位,并采用荧光竞争结合实验分析Mmed OBP19重组蛋白与86种潜在配体的结合特征。【结果】扫描电镜观察发现,中红侧沟茧蜂的足部主要分布3种类型的感器,分别是毛形感器、刺形感器和锥形感器。原位杂交结果显示,Mmed OBP19的表达主要集中在中红侧沟茧蜂前足跗节的感器下方。重组Mmed OBP19与配体的结合力测定结果显示,Mmed OBP19与非挥发性植物次生物质包括棉酚(K_i=2.32±0.17μmol/L)、硫酸黄连素(K_i=4.86±1.81μmol/L)、槲皮素(K_i=4.93±0.21μmol/L)、单宁(K_i=5.23±0.38μmol/L)、芸香叶苷(K_i=5.91±0.26μmol/L)和奎宁(K_i=6.05±0.51μmol/L)等具有较强的结合能力,同时能够结合油酸(K_i=4.32±1.73μmol/L)及亚油酸(K_i=3.55±0.44μmol/L),但与柠檬烯(K_i=12.65±2.55μmol/L)的结合力较弱。【结论】推测中红侧沟茧蜂足部具有化学感受功能,Mmed OBP19主要参与中红侧沟茧蜂足部味觉识别过程。     

枣食芽象甲化学感受蛋白PyasCSP4的基因克隆、表达及配体结合特征

【目的】本研究为明确枣树Zizyphus jujuba主要害虫枣食芽象甲Scythropus yasumatsui化学感受蛋白4(chemosensory protein 4, CSP4)的表达特点及配体结合特性。【方法】基于枣食芽象甲成虫触角转录组数据,利用RT-PCR方法克隆了枣食芽象甲PyasCSP4 cDNA序列,并进行生物信息学分析。通过RT-qPCR方法测定PyasCSP4在枣食芽象甲成虫不同组织(触角、去除触角的头、胸、腹、足和翅)中的表 达水平。通过原核表达系统和镍柱纯化获得PyasCSP4重组蛋白,采用荧光竞争结合实验测定重组蛋白PyasCSP4与35种枣树挥发物的结合特性。【结果】克隆获得枣食芽象甲PyasCSP4的cDNA序列(GenBank 登录号: OK322362),其开放阅读框全长为366 bp,编码121个氨基酸,N末端有18个氨基酸组成的信号肽序列, PyasCSP4成熟蛋白序列具有4个保守的半胱氨酸残基。RT-qPCR结果表明, PyasCSP4基因在成虫不同组织中均有表达,在触角和翅中的表达量显著高于在其他组织中的表达量。重组蛋白PyasCSP4与25种配体具有结合活性,尤其与α-蒎烯、α-水芹烯和罗勒烯等的结合能力最强,解离常数(Ki)值分别为6.29, 6.58和6.69 μmol/L。【结论】PyasCSP4能够与多种枣树挥发物结合,推测其可能在枣食芽象甲定位寄主植物的过程中发挥重要作用。本研究的结果对阐明枣食芽象甲嗅觉机制和开展绿色防控研究具有重要意义。     

铜绿丽金龟气味结合蛋白AcorOBP1的表达和结合特性分析

【目的】揭示铜绿丽金龟Anomala corpulenta Motschulsky气味结合蛋白(odorant binding protein,OBP)基因的表达特征及其与特异信息化合物的结合特性。【方法】通过RT-q PCR测定了铜绿丽金龟AcorOBP1基因的时空表达谱;用原核表达系统对AcorOBP1进行表达纯化,然后利用荧光竞争结合实验测定了AcorOBP1蛋白与56种候选化合物的结合特征。【结果】AcorOBP1基因在铜绿丽金龟卵、1龄幼虫和成虫等特定发育时期表达,在成虫触角中的表达量显著高于其他部位(P0.05)。在被测的56种化合物中,AcorOBP1与53种化合物具有结合活性,其中结合能力较强的为小叶女贞Ligustrum quihoui挥发物水杨酸甲酯和癸醇,解离常数分别为2.10±0.08和5.04±0.59μmol/L。【结论】铜绿丽金龟AcorOBP1结合谱广,该蛋白可能在铜绿丽金龟对寄主植物小叶女贞的定位过程中发挥重要作用。     

梨小食心虫气味结合蛋白GmolOBP3的cDNA克隆、表达谱及结合特性分析

【目的】为了更好地了解昆虫气味结合蛋白（odorant binding proteins, OBPs）在梨小食心虫Grapholita molesta（Busck）嗅觉识别中的作用,并明确其与寄主挥发物的结合特性。【方法】利用RT-PCR和RACE技术克隆梨小食心虫OBP基因;采用RT-PCR和实时定量PCR对该基因在成虫不同组织和羽化后不同日龄成虫中的表达情况进行了测定;以N-phenyl-1-naphthylamine（1-NPN）为荧光探针,采用荧光竞争结合试验对GmolOBP3蛋白的结合特性进行了分析。【结果】得到梨小食心虫一个新的气味结合蛋白基因,命名为GmolOBP3（GenBank登录号：KF395363）。GmolOBP3开放阅读框全长492 bp,编码163个氨基酸残基,预测分子量和等电点分别为18.72 kDa和4.93,呈酸性,具有典型的6个半胱氨酸位点。GmolOBP3在雌、雄成虫触角和腹部均有表达,成虫在羽化后5 d内,雌蛾触角中GmolOBP3表达量随羽化后日龄而增加,但雄蛾在羽化后第5天触角中 GmolOBP3表达量显著降低。通过构建GmolOBP3原核表达载体,在大肠杆菌Escherichia coli中诱导表达并获得了GmolOBP3重组蛋白。荧光竞争结合实验对GmolOBP3蛋白与16种寄主挥发物及4种性信息素类似物的结合力发现,在供试的4种梨小食心虫性信息素类似物中,GmolOBP3蛋白与反-8-十二碳烯醋酸酯和十二烷-1-醇不结合,而与顺-8-十二碳烯醋酸酯和顺-8-十二碳烯醇结合,但结合力较弱,结合常数分别为83.00和103.70 μmol/L;与16种寄主挥发物结合能力也不强,其中结合最强的是β 紫罗酮,结合常数为49.36 μmol/L。【结论】由此推断,GmolOBP3具有选择性识别和结合各种配基的特性。     

沙葱萤叶甲化学感受蛋白基因的鉴定及表达谱分析（英文）

【目的】沙葱萤叶甲Galeruca daurica是一种在内蒙古草原上爆发成灾的新害虫。昆虫的化学感受蛋白(CSPs)是一类水溶性小分子蛋白,其主要功能是识别和传导环境中的化学刺激至受体,参与众多昆虫行为。本研究旨在鉴定沙葱萤叶甲化学感受蛋白基因,并对其表达谱进行分析。【方法】通过筛选本实验室组装的沙葱萤叶甲转录组鉴定沙葱萤叶甲化学感受蛋白基因;采用实时荧光定量PCR方法分析其在沙葱萤叶甲不同发育阶段(卵、1-3龄幼虫、蛹和成虫)和成虫组织[触角、头(去触角)、胸、腹、足和翅]中的表达水平。【结果】鉴定出10个化学感受蛋白基因,将其命名为Gdau CSP1-10(Gen Bank登录号:KY885471-KY885480)。10条编码蛋白的氨基酸序列一致性范围为17.27%~62.79%,彼此间分化程度较高。通过NCBI的Blast比对结果显示,Gdau CSPs与榆黄毛萤叶甲Pyrrhalta maculicollis的Pmac CSP氨基酸序列一致性最高,为90%。系统发育分析表明,4种Gdau CSPs首先与榆黄毛萤叶甲的Pmac CSPs聚为一支。实时荧光定量PCR结果显示,Gd CSPs在不同发育阶段中的表达量有显著差异,Gdau CSP4-5,Gdau CSP7-8和Gdau CSP10 5个Gd CSPs在成虫中的表达量显著高于其他发育阶段,而Gd CSP2在卵中的表达量显著高于其他发育阶段;Gd CSPs不仅表达于成虫触角中,在头(去触角)、胸、腹、足、翅等其他部位也有表达,且10个Gd CSPs在沙葱萤叶甲成虫各组织中有着不同的表达谱,其中Gdau CSP2,Gdau CSP4,Gdau CSP5,Gdau CSP8和Gdau CSP9 5个Gd CSPs在雌成虫触角中的表达量显著高于其他组织。【结论】结果提示化学感受蛋白在沙葱萤叶甲的生长发育和化学感受过程中可能起着不同的作用。本研究为进一步研究沙葱萤叶甲化学感受蛋白的生理功能及化学通讯的分子机理奠定了必要的基础。     

核桃举肢蛾性信息素结合蛋白2的分子克隆和免疫荧光定位

【目的】明确核桃举肢蛾 Atrijuglans hetaohei Yang性信息素结合蛋白2(AhetPBP2)在核桃举肢蛾触角中的分布。【方法】本研究提取羽化后3-4 d的核桃举肢蛾成虫触角总RNA并反转录合成cDNA,设计简并引物进行RT-PCR获得cDNA片段,然后利用RACE技术获得 AhetPBP2全长cDNA序列。将去除信号肽序列的AhetPBP2进行原核表达,重组蛋白经镍柱纯化并免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。制备的多克隆抗体作为一抗对核桃举肢蛾触角进行免疫组化分析。【结果】AhetPBP2基因cDNA序列全长923 bp,开放阅读框504 bp,共编码167个氨基酸,分子量为19.26 kD,等电点为5.47。1 mmol/L IPTG诱导10 h获得可溶性重组蛋白,Western blot结果表明重组蛋白诱导表达成功,ELISA检测显示抗体效价为1:1 024 000。免疫荧光定位结果显示核桃举肢蛾成虫触角部分感器被AhetPBP2抗体标记。【结论】核桃举肢蛾成虫触角的部分感器中可能存在AhetPBP2,推测该部分感器具有感受性信息素的功能。     

甜菜夜蛾触角结合蛋白Ⅱ的cDNA克隆、 组织分布及配体结合特性分析

触角结合蛋白（antennal binding proteins, ABPs）是气味结合蛋白（odorant binding proteins, OBPs）的一个亚类, 推测其在昆虫嗅觉中起作用。为了探讨这一问题, 本研究通过转录组数据分析并利用RACE技术, 克隆了甜菜夜蛾Spodoptera exigua触角结合蛋白Ⅱ基因（SexigABP2）的全长cDNA序列（GenBank登录号为HQ234486）。序列分析表明, 该基因开放阅读框长444 bp, 编码148个氨基酸, 具有OBPs典型的6个半胱氨酸位点; 其氨基酸序列和烟芽夜蛾Heliothis virescens的HvirABP2的一致性最高, 达72%。实时定量PCR分析显示, 该基因主要在触角中表达, 在喙、 足、 翅等组织中也有少量表达, 且在雌蛾触角及足中的表达量显著高于雄蛾。进一步对该基因进行原核表达和纯化, 利用荧光竞争结合实验测定了SexigABP2对35种气味物质的结合能力, 发现其对甜菜夜蛾性信息素组分(Z)-9-十四碳烯醇和植物挥发物法尼醇的结合能力较强, 结合常数分别为8.24 μmol/L和8.14 μmol/L。结合能力比较表明, SexigABP2对不饱和长碳链化合物较饱和短碳链化合物具有更强的结合能力; 在不饱和长碳链化合物中, 对醇类物质又较乙酸酯类物质具有更强的结合能力。结果提示SexigABP2可能参与了成虫对不饱和长碳链的植物挥发物的感受。     

桃小食心虫成虫期高表达气味结合蛋白基因的克隆与表达谱分析

【目的】桃小食心虫Carposina sasakii是我国北方落叶果树的重要蛀果害虫,一旦幼虫蛀入果内,便会对果实的品质产生影响。成虫期是控制此害虫发生为害的关键时期。气味结合蛋白(odorant binding protein, OBP)作为昆虫嗅觉感受系统中与气味分子结合的重要气味运转蛋白,在成虫寄主植物定位及交配行为中具有重要作用。本研究对桃小食心虫气味结合蛋白基因进行克隆、鉴定和成虫组织表达分析,以期为OBPs在桃小食心虫嗅觉感受过程中的功能研究奠定基础。【方法】基于前期获得的桃小食心虫转录组测序数据,选择在其雌雄成虫触角中相对高表达的5个OBP基因(CsasOBP7, CsasOBP12, CsasOBP15, CsasOBP19和CsasOBP21)。采用RACE技术克隆出这5个OBP基因cDNA全长序列,进行生物信息学分析;通过qRT-PCR技术检测这5个OBP基因在桃小食心虫不同发育阶段(1和5日龄卵、初孵幼虫、老熟幼虫和蛹)以及在刚羽化、交配高峰期的和交配后6 h的雌雄成虫不同组织［触角、头(不含触角)、胸、腹、足和翅］中表达量。【结果】获得桃小食心虫5个OBP基因CsasOBP7, CsasOBP12, CsasOBP15, CsasOBP19和CsasOBP21的全长cDNA序列(GenBank登录号: MZ476786-MZ476790)。其中CsasOBP19为一段C端不完整的Minus-C OBP,其余均属于完整的Classical OBPs,且均含有信号肽。系统发育分析表明,在桃小食心虫5个CsasOBPs中, CsasOBP7和CsasOBP19的亲缘关系最近。qRT-PCR结果表明,CsasOBP7和CsasOBP19均在桃小食心虫蛹期高表达,而CsasOBP12, CsasOBP15和CsasOBP21均在卵期高表达。从桃小食心虫成虫刚羽化、交配高峰直至交配后6 h,5个CsasOBP基因表达量总体呈下降趋势。在成虫刚羽化时,这5个CsasOBP基因在各组织中均有表达,且主要在雄虫组织中高表达;在成虫交配高峰期,这5个CsasOBP基因在雄虫触角中高表达,特别是CsasOBP7和CsasOBP15只在雄虫触角中特异性表达;在成虫交配后6 h,每个CsasOBP基因只特异性地高表达于1或2个组织中。【结论】桃小食心虫的这5个CsasOBP基因在成虫交配高峰期雄虫触角中高表达,意味着这些CsasOBP基因可能在雄虫寻找雌虫过程中发挥着重要作用。