西花蓟马传播番茄斑萎病毒研究进展

西花蓟马Frankliniella occidentalis是世界性重要检疫性害虫之一,不仅直接取食危害作物而且传播病毒,从而造成极为严重的经济损失.由于西花蓟马在我国具有广泛的适生范围,随其入侵我国并随之传播的番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus)已在我国不同地域发现,对经济作物已形成严重...     

接种番茄斑萎病毒番茄植株对西花蓟马生物学特性的影响

西花蓟马Frankliniella occidentalis(Pergande)是我国的一种重要入侵害虫。本文研究了西花蓟马在番茄3种处理(健康CK、机械接种番茄斑萎病毒MI、机械损伤MD)叶片上的生长发育、存活及种群增长。结果表明:健康、机械接种番茄斑萎病毒、机械损伤叶片上的发育历期依次为12.68、12.99和11.79d。雌雄成虫寿命和雌虫繁殖能力在各处理叶片上差异不显著(P>0.05)。健康、机械接种番茄斑萎病毒、机械损伤叶片上的内禀增长率依次为0.1362、0.1526和0.1292d-1。本研究表明,接种番茄斑萎病毒的番茄叶片未缩短西花蓟马发育历期,也不能延长寿命及提高产卵量,不能明显加速种群数量增长。这意味着番茄斑萎病毒对西花蓟马在番茄叶片上的生物学特性未能产生明显的有利作用。     

利用酵母双杂交技术筛选鉴定与番茄环纹斑点病毒NSs蛋白互作的西花蓟马蛋白

【目的】筛选鉴定西花蓟马Franiklinella ocicdentalis体内与番茄环纹斑点病毒(tomato zonate spot virus, TZSV)NSs蛋白互作的介体因子。【方法】利用酵母双杂交技术筛选与TZSV NSs互作的西花蓟马蛋白;进行序列分析鉴定后,将捕获的蛋白与NSs基因回转到酵母细胞,利用营养缺陷型培养基鉴定蛋白互作情况。再利用GST Pull-down技术验证TZSV NSs与鉴定出的西花蓟马蛋白的体外互作关系。【结果】构建了TZSV NSs的酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7-NSs,确定了诱饵质粒对酵母AH109细胞无毒性,并且无自激活活性。序列分析发现与TZSV NSs互作的西花蓟马蛋白为类电压依赖性阴离子通道(voltage-dependent anion-selective channel-like, VDAC)。酵母回转实验显示TZSV NSs与西花蓟马VDAC在酵母细胞内存在特异性互作。GST Pull-down结果表明TZSV NSs与西花蓟马VDAC在体外存在相互作用。【结论】通过酵母双杂交和GST Pull-down技术,分别在酵母细胞内...     

寄主植物接种番茄斑萎病毒对西花蓟马种群的影响

【目的】西花蓟马Frankliniella occidentalis (Pergande)是一种入侵我国的重要害虫, 而番茄斑萎病毒是以西花蓟马传播为主的一种极具危害性的世界性病毒, 通过研究西花蓟马与番茄斑萎病毒之间的互作将有助于进一步深入理解西花蓟马以及番茄斑萎病毒的发生与猖獗机制, 同时也将为制定合理、可持续的控制西花蓟马及其传播的植物病毒防控策略提供理论依据。【方法】利用应用特定年龄-龄期及两性生命表方法, 研究了西花蓟马在辣椒3种处理（健康CK、机械损伤MD、机械接种番茄斑萎病毒MI）叶片上的生长发育、存活及种群增长。【结果】健康、机械损伤和机械接毒叶片上的发育历期依次为12.45, 11.97和11.18 d。雌雄成虫寿命和雌虫产卵量在不同处理植株叶片上差异显著(P<0.05), 在机械接毒叶片上寿命最长(雌13.51 d, 雄12.69 d); 繁殖能力最强, 产子代数高达33.01头1龄若虫/雌。健康、机械损伤和机械接毒叶片上西花蓟马内禀增长率分别为-0.009, 0.153和0.190 d-1, 净生殖率依次为0.84, 14.54和21.79。【结论】番茄斑萎病毒诱导寄主植物辣椒反应使西花蓟马发育历期缩短, 成虫寿命延长, 繁殖能力提高, 种群增长加速。     

利用酵母双杂交系统筛选与黄瓜花叶病毒外壳蛋白互作的寄主蛋白

利用酵母双杂交系统,以黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)的外壳蛋白(coat protein,CP)为诱饵,从番茄叶片c DNA文库中筛选与其互作的蛋白。结果显示,诱饵载体pBT3-SUC-CMV-CP均能在酵母细胞中正确表达,无自激活活性而且对酵母无毒性;通过对酵母双杂交文库的筛选和回转验证,共获得了98个阳性克隆,分别编码67个可能与CMV-CP相互作用的蛋白,分别参与植物防御反应、光合作用、物质转运、信号转导、能量代谢、氨基酸代谢、细胞壁的形态建成、植物的激素代谢等。本研究结果表明,CMV CP可同时调控寄主的多个代谢过程,在CMV的致病过程中有多重功能。     

番茄斑萎病毒对多杀菌素抗性西花蓟马发育繁殖和药剂敏感性的影响

【目的】西花蓟马Frankliniella occidentalis (Pergande)是重要的入侵害虫,是番茄斑萎病毒（TSWV）最有效的传播媒介,TSWV对西花蓟马的生长发育有一定的影响。多杀菌素是防治西花蓟马最有效的药剂之一,但已有田间西花蓟马对多杀菌素产生抗药性的报道。TSWV对抗性西花蓟马是否也有影响及程度如何尚不清楚。本研究通过对此问题进行深入研究,以期为进一步了解TSWV对西花蓟马的影响提供依据。【方法】应用特定年龄-龄期及两性生命表的方法,研究用番茄斑萎病毒处理和未处理的多杀菌素抗性和敏感西花蓟马种群的生物学特性;用叶管药膜法测定不同处理种群对3种药剂（多杀菌素、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐和虫螨腈）的敏感性变化。【结果】对于抗性品系,TSWV处理后西花蓟马的发育历期缩短,雌成虫寿命和产卵量略高,但与对照组差异不显著(P＞0.05),内禀增长率（r）和净生殖率（R₀）分别为0.0433 d^-1和2.210,显著高于对照组（分别为0.0356 d^-1和1.972）（P ≤ 0.001）。对于敏感品系,TSWV处理后西花蓟马的发育历期缩短,雌雄成虫寿命均显著延长（P ≤ 0.001）,产卵量也略有提高,R₀为4.125,显著高于对照组（3.979）（P ≤ 0.001）。TSWV处理后敏感和抗性西花蓟马对多杀菌素的敏感性没有发生明显变化,对甲氨基阿维菌素苯甲酸盐和虫螨腈的敏感性显著降低。【结论】番茄斑萎病毒对多杀菌素敏感和抗性西花蓟马均有直接有利影响,病毒处理的西花蓟马发育历期缩短,繁殖能力增强,成虫寿命延长,对药剂的敏感性降低。     

云南省昆明地区番茄斑萎病毒核衣壳蛋白和运动蛋白变异分析

为了明确对番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt virus,TSWV)免疫的番茄YNAU335自交系表现出TSWV感病症状(抗性被打破)的原因,在排除YNAU335自交系不纯和或混杂其它感病番茄材料的因素外,选取96172I(感病)和YNAU335(抗性被打破)自交系感病植株,进行TSWV核衣壳蛋白(nucleocapsid protein,NP)和运动蛋白(movement protein,MP)基因的RT-PCR检测,并对阳性克隆进行基因测序分析。结果表明:(1)2个自交系中均克隆出TSWV的NP和MP基因,共获得5条NP(登录号:MK628735～MK628739)和3条MP(登录号:MK883723、MK883724和MK887284)多态性基因序列。(2)96172I感病材料中克隆出以上所有基因序列,YNAU335感病材料中克隆出其中的3条NP和1条MP基因序列。(3)对YNAU335中TSWV特有的NP和MP氨基酸突变位点进行分析,结果发现4个特异突变位点可能与打破YNAU335抗性有关,4个突变位点分别为:NP 18位氨基酸G突变为V,36位T突变为I,39位L突变为R,MP 274位E突变为K。(4)系统发育分析显示,5条NP和3条MP与云南省已登记的NP和MP聚类在不同的分支,表明云南省昆明地区TSWV存在丰富的遗传多样性。     

采用酵母双杂交系统筛选GmDREB5的互作蛋白

以无自激活活性的GmDREB5蛋白73～226位氨基酸区段为诱饵,采用酵母双杂交系统筛选干旱处理5 h大豆cDNA文库.结果发现:一个互作蛋白含有保守的TPR(Tetratricopeptide repeat)结构域,与拟南芥的TPR蛋白仅有14%的相似性,说明其可能是一类新的大豆TPR蛋白,将其定名为GmTPR1;表达特性分析表明,GmTPR1基因受干旱、低温、高盐、ABA的诱导;证明GmTPR1不仅参与植物对非生物胁迫的响应,同时参与对GmDREB5蛋白水平的调控.     

银川番茄斑萎病毒的分子鉴定

为明确银川番茄(Lycopersicon esculentum)是否遭受了番茄斑萎病毒(TSWV)的危害, 采用国家标准TSWV RT- PCR检测技术对银川番茄上采集的14份疑似感染TSWV病叶样本进行分子鉴定, 对克隆得到的核衣壳蛋白基因N (Nucleocapsid)序列进行多序列比对和系统进化树分析, 随后对PCR阳性样本进行蛋白检测。结果表明, 14份病叶样本中有8份扩增出长度为394 bp的TSWV N基因序列, 且8条序列完全一致; 获得的银川番茄TSWV分离物与云南番茄、中国莴苣(Lactuca sativa)、中国鸢尾(Iris tectorum)和重庆辣椒(Capsicum annuum) TSWV分离物相对近缘, 与山东、黑龙江和北京等地及国外TSWV分离物相对远缘; 利用TSWV的抗体通过Western blot对8个PCR阳性样本进一步检测, 结果也证实8个阳性样本中存在TSWV感染。该研究首次通过分子鉴定及蛋白检测证明银川番茄上存在TSWV感染, 需要加快抗TSWV番茄品种的选育工作。     

水稻锌指蛋白ZFP36互作蛋白的筛选及互作蛋白基因表达

C₂H₂类型的锌指蛋白转录因子在植物生长发育和应对逆境胁迫中发挥重要作用。水稻(Oryza sativa L.)中,一种C₂H₂类型的锌指蛋白ZFP36(zinc finger protein 36)是脱落酸(abscisic acid, ABA)介导的细胞信号转导中的重要组分。为了研究水稻ZFP36在ABA介导的细胞信号转导中作用机制,本研究采用酵母双杂交系统,将ZFP36作为诱饵蛋白,通过筛选经ABA诱导的水稻叶片获得的酵母文库,筛选出59个阳性克隆。进一步通过酵母双杂交(yeast two-hybrid system, Y2H)和萤火虫荧光素酶互补成像(firefly luciferase complementary imaging, LCI)系统,最终获得4个与ZFP36互作的蛋白,包括OsAE7(asymmetric leaves1/2 enhancer 7)、OsDjC46(heat shock protein)、OsDIP1(R3H domain containing protein)...     

西花蓟马对二斑叶螨为害后番茄的行为反应及挥发物成分分析

【目的】为明确二斑叶螨Tetranychus urticae为害番茄后诱导的防御反应对西花蓟马Frankliniella occidentalis行为的影响。【方法】采用四臂嗅觉仪测定了西花蓟马对二斑叶螨不同密度和时间为害后番茄植株的选择行为,并用气相色谱-质谱联用仪测定了不同处理下番茄挥发物的成分,比较了它们的异同。【结果】西花蓟马对二斑叶螨不同为害株的选择率与为害时间和为害密度密切相关,并且西花蓟马对二斑叶螨为害程度居中的番茄喜好性强。10种不同处理番茄挥发性物质种类、含量及其比例在各处理间存在较大差异,二斑叶螨为害后诱导番茄新产生了香橙烯,并且在为害程度较高的番茄上检测到邻-异丙基苯、2-甲基-1-丁醇和(E)-2-己烯醛3种化合物。结合嗅觉仪的结果,推测间伞花烃和邻-异丙基苯对西花蓟马具有一定的驱避作用,对伞花烃和1-辛烯-3-醇对西花蓟马具有一定的引诱作用。【结论】西花蓟马对二斑叶螨为害程度居中的番茄植株有一定的偏好,二斑叶螨为害能诱导番茄挥发物种类和含量的变化,并且与螨害的密度和时间有关。     

白桦开花抑制因子BpFLC与BpSVP蛋白互作的结构域筛选与互作验证

为深入研究白桦开花抑制因子FLC与SVP的相互作用的分子机理。从重组质粒pGBKT7-BpFLC、pGBKT7-BpSVP分别克隆出6个BpFLC截短体（BpFLC1~6）和6个BpSVP截短体（BpSVP1~6）,分别编码MI、MIK、K、IKC、KC和C域。在酵母Y2HGold菌中,分别共转诱饵质粒pGBKT7-BpFLC1~6×pGADT7-BpSVP及pGBKT7-BpFLC×pGADT7-BpSVP1~6。酵母转化子Y2HGold［pGBKT7-BpFLC2~5×pGADT7-BpSVP］,可在选择性固体培养基TDO、QTO/A上生长,并在QDO/A/X上长出蓝色菌落,表明BpSVP能与截短体蛋白BpFLC2~5异源结合。此外酵母Y2HGold［pGBKT7-BpFLC×pGADT7-BpSVP2~5］也能同时激活报告基因AUR1-C、HIS3、ADE2、MEL1。进一步研究发现：Y2HGold［pGBKT7-BpFLC3×pGADT7-BpSVP3］存在相互作用,表明BpFLC的K域与BpSVP的K域能够异源结合,是介导BpFLC与BpVP蛋白互作的关键结构域。     

利用酵母双杂交筛选与苹果褪绿叶斑病毒MP互作的寄主因子

为了找到与苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)运动蛋白(Movement protein,MP)互作的寄主因子,首先构建了ACLSV MP酵母双杂交诱饵载体,然后通过顺序转化的方法自前期已构建好的苏俄苹果(Malus sylvestris cv.R12740-7A)cDNA文库中筛选互作基因;在GenBank中对互作寄主基因进行BLAST分析,根据基因注释推测其在病毒与寄主互作过程中可能发挥的作用。结果表明,构建的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-MP无自激活性、无毒性。筛选到69个与ACLSV MP互作的苏俄苹果寄主因子,包括水解酶活性、病程相关蛋白、氧化还原酶活性、磷酸酶活性、催化活性、连接酶活性、苯丙氨酸解氨酶活性、过氧化物酶活性、DNA结合功能和未知蛋白,共10类不同功能的蛋白。通过生物信息学分析,推断蛋白磷酸酶、病程相关蛋白及3-磷酸甘油醛脱氢酶可能在互作过程中起重要作用。该研究为深入了解ACLSV致病特征及病原与寄主互作机制奠定基础。     

以番茄斑萎病毒核蛋白为靶点的荧光偏振药物筛选体系的建立及应用

目的:基于荧光偏振技术建立靶向番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)核蛋白(NP)与核酸相互作用的药物筛选体系,并应用该体系展开药物筛选。方法:将目的基因克隆到pGEX-6p-1表达载体上,并采用大肠杆菌表达系统进行目的蛋白的异源表达。建立靶向TSWV NP与核酸相互作用的荧光偏振药物筛选体系,对体系的结合时间、DMSO耐受、变异性和稳定性进行研究,并展开药物筛选。结果:成功构建重组质粒pGEX-6p-1-NP,在大肠杆菌中表达并分离纯化出高质量的核蛋白。基于荧光偏振技术建立了信噪比为8∶1,Z因子为0. 82的稳定的靶向TSWV NP与核酸相互作用的药物筛选体系,并对化合物库中1 000种化合物展开药物筛选,经过初步筛选获得了1种IC_(50)为4. 15μmol/L的化合物。结论:建立了稳定的荧光偏振筛选体系,适用于靶向NP与核酸相互作用的药物的筛选。筛选到的化合物为番茄斑萎病毒的预防和控制提供参考。     

利用酵母双杂交系统筛选水稻组蛋白去乙酰化酶HDA705的互作蛋白

为了解水稻(Oryza sativa)组蛋白去乙酰化酶HDA705的生物学功能,构建了HDA705酵母双杂交诱饵表达载体与双杂交文库,并筛选了与HDA705相互作用的蛋白。结果表明,HDA705的诱饵载体无自激活活性且对酵母无毒性作用,文库的滴度也适合常规的酵母双杂交文库筛选。通过对酵母双杂交文库的筛选,共获得了164个阳性克隆,经DNA测序分析,这些克隆编码47个可能与HDA705相互作用的蛋白,其中包括3个在逆境响应或激素信号转导过程中起到重要作用的(辅)转录因子、6个参与光合作用的叶绿体蛋白、1个含有R3H结构域的蛋白以及22种酶类等。这为进一步研究HDA705的生物学功能提供了重要的线索。     

番茄斑萎病毒运动蛋白NSm在植物细胞和昆虫细胞内的定位

[目的]研究番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)运动蛋白NSm的细胞定位.[方法]将NSm基因融合GFP后构建到植物双元表达载体pCHF3中,农杆菌介导浸润本氏烟叶片,同时将融合GFP的NSm基因利用Bac-to-Bac杆状病毒表达体系转染昆虫Tn细胞.在激光共聚焦显微镜下观察NSm-GFP在烟草表皮细胞和昆虫Tn细胞中的定位情况.[结果]观察发现与单独表达GFP在细胞壁周围和细胞核处均匀分布不同,NSm-GFP融合蛋白会在植物细胞内扩散,能够在细胞壁边缘定位,并且在胞间连丝处呈不连续的绿色荧光小点,偶尔成对出现在相邻的两个细胞之间;NSm蛋白在昆虫Tn细胞表面产生数量众多的管状结构并向外延伸.[结论]研究结果表明NSm能够特异性定位在植物细胞的胞间连丝处,并能在昆虫Tn细胞内表达,在细胞表面产生运动蛋白小管.     

西花蓟马蛋白的提取及双向电泳体系的建立

【目的】蛋白样品的制备是获得良好双向凝胶电泳(2-DE)图谱的前提,建立合理的西花蓟马蛋白的双向电泳体系,获得分辨率较高、重复性较好的图谱,能够为后续的研究提供有力支撑。【方法】实验以西花蓟马成虫为实验材料,对比了饱和酚法、TCA/丙酮法和直接裂解法3种蛋白提取方法,从中选出最适宜双向电泳分析的一种蛋白提取方法。【结果】3种方法蛋白提取率差异显著,直接裂解法蛋白提取率最高,饱和酚法的蛋白提取率最低;3种方法的SDS-PAGE条带数差异不明显;TCA/丙酮法的双向凝胶图谱效果最好,蛋白点最多。【结论】TCA/丙酮法能够有效去除西花蓟马蛋白中的干扰物质,是最适合西花蓟马双向凝胶电泳的蛋白提取方法,为后续西花蓟马在蛋白组学方面的研究奠定了基础。     

西花蓟马与植物互作中的诱导防御与适应性研究进展

西花蓟马Frankliniella occidentalis通过取食、产卵和传播植物病毒对园艺和农业作物生产构成了严重威胁.利用植物诱导防御反应以抵抗西花蓟马危害是作物保护最具生态效益的方法.在植物与西花蓟马的互作中,虫伤、外源植物激素、微生物及其他一些非生物因子均可诱导植物产生防御反应,且植物次生化合物、Ca2+、防御酶及防御信号通路相关基因在植物诱导抗性中起着重要作用.而西花蓟马也形成了一系列解毒代谢和行为适应等反防御机制适应寄主植物的防御反应.本文综述了植物诱导防御反应对西花蓟马抗性、及西花蓟马对植物防御反应的适应性研究进展.     

不同诱导处理番茄植株对西花蓟马保护酶活性的影响

研究了西花蓟马取食茉莉酸、水杨酸甲酯、机械损伤、虫伤处理诱导的番茄植株对其虫体保护酶活性的影响。研究发现,不同处理的番茄植株对西花蓟马过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)3种保护酶的活性有明显的影响。只有西花蓟马取食茉莉酸处理的番茄植株24 h,POD活性明显升高,取食其它处理及在其它时间下,POD活性与对照没有明显的变化或活性受到抑制。取食水杨酸甲酯处理的番茄植株6 h和24 h,西花蓟马CAT活性均受到激发;取食虫害植株的3个时间段下,西花蓟马酶活性一直受到抑制;西花蓟马取食茉莉酸处理及机械损伤处理番茄植株,CAT酶活性在任何时间下都没有明显的变化或受到抑制。取食水杨酸诱导处理的番茄植株,西花蓟马SOD活性在6 h和24 h明显升高,36 h明显下降;但取食其它处理的SOD酶活性均在36 h明显升高。结果说明西花蓟马3种保护酶活性在取食不同处理诱导的番茄植株的不同时间下各不相同,说明保护酶活性的变化与不同诱导处理及时间密切相关。