小菜蛾基因组中内源性逆转录病毒元件PxERV的发现与特征分析

【目的】内源性逆转录病毒(endogenous retroviruses, ERVs)是一类在宿主基因组中世代留存的有类似病毒结构的序列元件。本研究在通过前期小菜蛾Plutella xylostella精巢转录组分析发现一个小菜蛾内源性逆转录病毒元件PxERV的基础上,探究该逆转录病毒元件的序列特征及侵染活性,为探明内源性逆转录病毒对小菜蛾的影响奠定基础。【方法】利用生物信息学方法分析鉴定了PxERV在小菜蛾基因组上的序列及结构特点,并用基因克隆和测序得到PxERV的env基因序列;进一步通过MEGA6软件构建了昆虫env基因编码的氨基酸序列与核型多角体病毒包膜糖蛋白的系统发育树。利用qPCR技术检测了env基因在小菜蛾G88品系不同发育时期虫体和精巢中的表达模式及FZ品系成虫和G88品系的成虫和幼虫中env基因拷贝数的变化。利用CRISPR/Cas9介导小菜蛾G88品系中env基因突变,检测PxERV的独立复制活性。【结果】PxERV有LTR-pol-env-LTR结构,其env基因与果蝇Drosophila buzzatii逆转座子osvaldo和粉纹夜蛾Trichoplusia ni内源性逆转录病毒Ted的env基因进化关系较近。PxERV的env基因在小菜蛾G88品系雄成虫精巢中特异性高表达,env基因的拷贝数在小菜蛾FZ品系中的低于在G88品系中的,但在不同发育时期的G88品系中没有差异。G88品系多代自交,突变型env基因在小菜蛾基因组上不断减少,直至完全恢复野生型env基因。【结论】内源性逆转录病毒元件PxERV在小菜蛾世代间存在独立复制活性,但在小菜蛾发育过程中不会独立复制。这种病毒元件可能通过小菜蛾雄性生殖系统实现侵染活性,但侵染机理还需进一步探究。     

小菜蛾基因组中内源性逆转录病毒元件PxERV的发现与特征分析

【目的】内源性逆转录病毒(endogenous retroviruses, ERVs)是一类在宿主基因组中世代留存的有类似病毒结构的序列元件。本研究在通过前期小菜蛾Plutella xylostella精巢转录组分析发现一个小菜蛾内源性逆转录病毒元件PxERV的基础上，探究该逆转录病毒元件的序列特征及侵染活性，为探明内源性逆转录病毒对小菜蛾的影响奠定基础。【方法】利用生物信息学方法分析鉴定了PxERV在小菜蛾基因组上的序列及结构特点，并用基因克隆和测序得到PxERV的env基因序列；进一步通过MEGA6软件构建了昆虫env基因编码的氨基酸序列与核型多角体病毒包膜糖蛋白的系统发育树。利用qPCR技术检测了env基因在小菜蛾G88品系不同发育时期虫体和精巢中的表达模式及FZ品系成虫和G88品系的成虫和幼虫中env基因拷贝数的变化。利用CRISPR/Cas9介导小菜蛾G88品系中env基因突变，检测PxERV的独立复制活性。【结果】PxERV有LTR-pol-env-LTR结构，其env基因与果蝇Drosophila buzzatii逆转座子osvaldo和粉纹夜蛾Trichoplusia ni内源性逆转录病毒Ted的env基因进化关系较近。PxERV的env基因在小菜蛾G88品系雄成虫精巢中特异性高表达，env基因的拷贝数在小菜蛾FZ品系中的低于在G88品系中的，但在不同发育时期的G88品系中没有差异。G88品系多代自交，突变型env基因在小菜蛾基因组上不断减少，直至完全恢复野生型env基因。【结论】内源性逆转录病毒元件PxERV在小菜蛾世代间存在独立复制活性，但在小菜蛾发育过程中不会独立复制。这种病毒元件可能通过小菜蛾雄性生殖系统实现侵染活性，但侵染机理还需进一步探究。     

牛痘病毒重组体表达的AIDS病毒包膜基因

<正>淋巴结相关病毒(LAY)的原病毒的基因组已被克隆,其全部核苷酸序列亦已确定。当推寻核苷酸序列中的开放读码,则LAV的基因组不仅含有编码核心蛋白(gag),反向转录酶(pol)和包膜蛋白(env)典型逆转录病毒基因,而且还有两种未知功能的新基因Q和F。选择表达LAV的env基因,因为对许多病毒来说,它是刺激中和反应或保护性应答的主要包膜糖蛋白。     

牛泡沫病毒长末端重复序列在大肠杆菌中的启动子功能

泡沫病毒具有复杂的基因组结构,包含典型反转录病毒共有的长末端重复序列(long terminal repeat,LTR)启动子,负责起始结构基因gag、pol、env的表达,并在env基因内部存在独有的内部启动子(internal promoter,IP)[13],用以起始下游反式作用因子Tas(在BFV中称Borf-1)的表达.有报道劳斯肉瘤病毒(rous sarcoma virus,RSV)和人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)LTR可在E.coli中起始基因表达[4,7].泡沫病毒至今未见报道.     

略阳乌鸡内源性逆转录病毒鉴定及表达分析

内源性禽白血病病毒等以多种逆转录病毒基因组稳定存在鸡染色体中,其致病性低或无致病性,但是内源性病毒的基因表达降低了鸡抵抗外源病毒感染的能力。本研究以略阳乌鸡为研究对象,利用多重PCR鉴定鸡基因组中禽内源性病毒EAV-HP和禽白血病病毒E亚群(ALV-E),分析ALV-E的env基因表达情况。结果表明,30只略阳乌鸡的基因组中均携带EAV-HP病毒序列,其中28只携带ALV-E序列。通过MEGA和NETWORK软件对ALV-E的gp85基因分析表明,略阳乌鸡与江苏绿壳蛋鸡聚在同一分支,两者同源性高达99.1%。此研究也为后续略阳乌鸡遗传背景分析和选育抗病毒感染优良品种提供基础数据。     

SPF鸡胚中内源性白血病病毒全基因序列鉴定与分析

摘要:以国内某3家SPF鸡场的SPF鸡胚成纤维细胞提取的基因组DNA为模板,参照已发表的序列,设计合成了4对检测内源性白血病病毒引物,分别检测gag基因、pol基因、env基因和LTR片段,结果显示4者检出阳性率很高(gag,29/46;pol,27/46;env,24/46;LTR,31/46).设计合成了8对引物,选取4片段检测均为阳性的样品之一,经PCR成功扩增出了8段连续的、相互部分重叠的目的DNA片段,分别连接入T载体进行克隆测序.用DNAstar软件对测序结果进行拼接,从一个鸡胚得到了内源性白血病病毒前病毒全基因组序列.比较分析发现,该序列env基因与已知的E亚群内源性病毒代表株env基因的核苷酸序列同源性在98.5%以上,全基因组序列同源性在99.1%以上,而与其他亚群代表株同源性相对较低,env基因同源性仅为56.3%～91.5%.     

四川山鹧鸪基因组中内源性逆转录病毒的分析

内源性逆转录病毒(ERV)是插入到宿主基因组中的、可以稳定遗传的病毒基因组,能够在宿主体内表达和复制,调节插入位点附近的基因表达,以及抑制同源病毒的感染。从四川山鹧鸪Arborophila rufipectus基因组中确定了3 962个全长ERV拷贝,其中4个具有完整的结构,72个具有自我复制的能力,554个含有gag、pol或env基因所编码的蛋白质结构域。根据逆转录酶序列的相似性,确定了7个ERV家族,并依据与其他物种的相似性对家族进行了命名。其中,AruERV-L包含122个ERV拷贝,为拷贝数最多的家族。7个ERV家族的年龄分布在0～12百万年,其中AruERV-K1是最年轻的家族,其约86%的拷贝年龄在1百万年以内。     

复制缺陷型人泡沫逆转录病毒载体构建和外源基因表达

在人泡沫逆转录病毒 (humanfoamyvirus ,HFV)原病毒全长克隆pHRSV13的基础上 ,缺失病毒基因组的env基因和bel基因 ,构建了一个表达标记基因neo和报道基因 gfp的重组人泡沫病毒载体质粒pGPSNI GFP。在与辅助质粒 p△GP共转染情况下 ,得到复制缺陷型的重组病毒颗粒GPSNI GFP。该病毒颗粒可以感染多种宿主细胞 ,将携带的外源基因整合于细胞染色体DNA上并实现表达     

绵羊肺腺瘤病毒NM株前病毒基因组的克隆与全序列分析

本研究参照GenBank中已发表的绵羊肺腺瘤病毒的基因组全序列,设计合成8对引物,从内蒙古某羊场自然感染绵羊肺腺瘤病的病肺肿瘤组织中提取总DNA为模板,对JSRV-NM株基因组分8段进行PCR扩增,产物分别为8个(531bp,888bp,949bp,944bp,1428bp,947bp,1836bp,538bp)基因片段,将其分别克隆入pMD-18T载体中进行双向测序并拼接序列,获得完整的JSRV-NM株前病毒基因组全序列。结果表明,JSRV-NM株前病毒基因组全长7430bp,有相互重叠的4个较长的开放阅读框(ORF),分别代表gag、pro、pol和env基因。与绵羊肺腺瘤病毒Ⅰ型即南非代表株(NC-001494)和绵羊肺腺瘤病毒Ⅱ型即美国代表株(AF105220)的核苷酸同源性比较分别为90.4%和90%,推导出的氨基酸同源性分别为90%和89.1%。分析JSRV-NM株基因组结构,发现在LTR的上游和下游都具有外源性exJSRV特有的ScaⅠ酶切位点,在gag基因编码的NC区发现有2个较典型的“胱氨酸—组氨酸序列”,可形成锌指结构。在env基因编码的TM区有特异性的“YXXM”基序。用地高辛标记外源性exJSRV特异的JSRV-2片段制成探针,原位杂交法检测自然感染绵羊肺腺瘤病(OPA)的病肺组织中JSRV-NM的RNA及前病毒DNA,结果表明OPA患羊肺肿瘤细胞的胞浆和核内都有JSRV-2基因mRNA的表达,说明JSRV-NM株是具有致瘤作用的外源性反转录病毒。这是我国首次报道的绵羊肺腺瘤病毒的基因组全序列。     

复制缺陷型人泡沫逆转录病毒载体构建和外源基因表达

在人泡沫逆转录病毒(human foamy virus,HFV)原病毒全长克隆pHRSV13的基础上,缺失病毒基因组的env基因和bel基因,构建了一个表达标记基因neo和报道基因gfp的重组人泡沫病毒载体质粒pGPSNI-GFP.在与辅助质粒p△GP共转染情况下,得到复制缺陷型的重组病毒颗粒GPSNI-GFP.该病毒颗粒可以感染多种宿主细胞,将携带的外源基因整合于细胞染色体DNA上并实现表达.     

绵羊肺腺瘤病毒NM株前病毒基因组的克隆与全序列分析

本研究参照GenBank中已发表的绵羊肺腺瘤病毒的基因组全序列,设计合成8对引物,从内蒙古某羊场自然感染绵羊肺腺瘤病的病肺肿瘤组织中提取总DNA为模板,对JSRV-NM株基因组分8段进行PCR扩增,产物分别为8个(531bp, 888bp, 949 bp, 944bp, 1428bp, 947bp, 1836bp, 538bp)基因片段,将其分别克隆入pMD-18 T载体中进行双向测序并拼接序列,获得完整的JSRV-NM株前病毒基因组全序列.结果表明,JSRV-NM株前病毒基因组全长7430bp,有相互重叠的4个较长的开放阅读框(ORF),分别代表gag、 pro、 pol 和 env基因.与绵羊肺腺瘤病毒Ⅰ型即南非代表株(NC-001494)和绵羊肺腺瘤病毒Ⅱ型即美国代表株(AF105220)的核苷酸同源性比较分别为90.4%和90%,推导出的氨基酸同源性分别为90%和89.1%.分析JSRV-NM株基因组结构,发现在LTR的上游和下游都具有外源性exJSRV特有的ScaⅠ酶切位点,在gag基因编码的NC区发现有2个较典型的"胱氨酸-组氨酸序列",可形成锌指结构.在env基因编码的TM区有特异性的"YXXM"基序.用地高辛标记外源性exJSRV特异的JSRV-2片段制成探针,原位杂交法检测自然感染绵羊肺腺瘤病(OPA)的病肺组织中JSRV-NM的 RNA及前病毒DNA,结果表明OPA患羊肺肿瘤细胞的胞浆和核内都有JSRV-2基因mRNA的表达, 说明JSRV-NM株是具有致瘤作用的外源性反转录病毒.这是我国首次报道的绵羊肺腺瘤病毒的基因组全序列.     

泡沫病毒Gag蛋白的研究进展

Gag蛋白在逆转录病毒复制周期的许多阶段中发挥重要作用。泡沫病毒基因组结构与其它逆转录病毒类似,但它们的基因组成分和生活周期存在明显差异,这在一定程度上是由其Gag蛋白的结构和功能所决定的。本文对18种不同株型的泡沫病毒gag基因序列进行进化树分析,探究不同来源的泡沫病毒的亲缘关系;并以典型的原型泡沫病毒为代表,阐述泡沫病毒Gag蛋白的结构和功能以及对病毒复制不同阶段的影响。     

牛泡沫病毒两类启动子活性的比较和机制探讨

牛泡沫病毒(Bovine foamy virus, BFV)属反转录病毒科泡沫病毒属.其基因组两端为长末端重复序列(Long terminal repeat, LTR),中间部分除gag、pol、env三个结构基因外,还有两个重叠的读码框ORF-1、2,起始于env基因3′端,终止于3′LTR,编码Borf-1、Borf - 2等多种调节蛋白[1～3].     

马传染性贫血病毒白细胞弱毒疫苗株及其亲本毒驴强毒株前病毒基因组比较分析

为阐明马传染性贫血白细胞弱毒疫苗株(EIAVDLV)的致弱和免疫保护机理,对EIAVDLV121及其亲本驴强毒株(EIAVDV117)前病毒全基因组序列进行了测定,并结合准种理论,分析了EIAV疫苗致弱过程中基因组进化特点。利用LA-PCR技术对EIAVDV117和EIAVDLV121的前病毒基因组分两段进行扩增,分别获得4个和10个前病毒全基因组序列。EIAVDV117前病毒基因组平均为8236bp,G C含量38.0。EIAVDLV121前病毒基因组平均8249bp,G C含量37.3。两者的前病毒基因组平均差异率为2.8。其中S2、LTR和env基因差异较大,分别为4.1、3.9和3.1。此外,S2、S3和env推导的氨基酸的差异明显,分别为10.4、5.6和4.8(gp90为6.8)。EIAVDLV121各基因的异质性均显著高于EIAVDV117。研究发现体外培养的EIAVDLV121至少有5种类型的LTR混合存在。在gp90推导的氨基酸序列上,EIAVDV117比EIAVDLV121平均多2个N-糖基化位点,总数为19,其中3个为EIAVDV117特有。EIAVDLV121有1个疫苗株特有N-糖基化位点。研究结果为进一步探讨马传染性贫血弱毒疫苗生物学特性提供信息。     

冠状病毒的新成员--SARS-CoV的基因组特性

2003年3月,人类发现一种新的冠状病毒SARS-CoV,这种病毒是非典型性肺炎(SARS)的病原体。SARS-CoV的基因组序列已经由包括中国科学家在内的全世界的科研人员测定完成。该文对国际报道的SARS病源的基因序列进行了收录,阐述了SARS-CoV基因组的基本特性：SARS-CoV的基因组长约28-30kb,与冠状病毒科的基因组长度相符合,其中包括11个编码序列,基因组的组织方式也与其他冠状病毒类似,从表面蛋白(S蛋白)、外膜蛋白(M蛋白)和核蛋白(N蛋白)上看,SARS病毒与其他冠状病毒的对应蛋白进化关系接近。同时发现,在某些区域,SARS病毒的基因序列与其他冠状病毒存在相当大的差异,具有自身比较保守的基因组序列结构。而且氨基酸的序列也与其他冠状病毒有很大程度的不同。基因信息的冗余分析表明,SARS-CoV具有较低的冗余度,即发生变异的可能性比较大。虽然SARS-CoV外表与冠状病毒类似,亲缘关系未超出冠状病毒科界限,但由于蛋白基因与氨基酸的序列与其他冠状病毒有本质不同,因此可能不是其他冠状病毒的变异体,而是一种与冠状病毒类似、但早已独立存在、此前未被人类所认识的新病毒。     

逆转录病毒基因组RNA的二聚作用

逆转录病毒科(Retroviridae)是一成员众多、易变异的RNA病毒科.在逆转录病毒复制周期内,所有逆转录病毒均将两拷贝的单股正链RNA带入病毒粒子[1,2].在此过程中,遗传物质--基因组RNA能顺利包装入病毒粒子是病毒复制与繁衍的关键,而基因组RNA通过二聚作用(Dimer-ization)形成二聚体(Dimer)是包装逆转录病毒的前提.     

大麦黄矮病毒GAV基因组全序列测定及其结构分析

测定了在中国分离得到由麦二叉蚜和麦长管蚜传播的大麦黄矮病毒GAV的基因组核苷酸全序列, 该病毒分离物的RNA由5685个核苷酸组成, 内含6个开放阅读框架(ORF)和4个非编码区(UTR), 基因组大小和结构与黄症病毒属(Luteovirus)的大麦黄矮病毒PAV(BYDV-PAV)和MAV(BYDV-MAV)相似. 序列分析表明, 它与BYDV-MAV的PS1分离物基因组序列的同源性最高. 在6个开放阅读框架中, 除ORF6核苷酸序列同源性为72.0%外, 其他ORF的核苷酸序列同源性均大于90%. 两者全基因组的同源性为90.4%. 推导的编码产物氨基酸序列同源性除P6和通读蛋白(RTP)分别为67.4%和87.4%外, 其他均大于90%, 其中外壳蛋白(CP)为95.5%. 根据与BYDV-MAV的相似性, BYDV-GAV应是一种与BYDV-MAV类似的病毒.     

我国中部HIV-1B′亚型分离株基因组结构特征及系统发育分析

为了分析河南省Humanimmunodeficiencyvirus-1(HIV-1)流行株的基因特征和传染来源,我们从一位HIV-1感染的有偿献血员体内分离HIV-1毒株。提取感染细胞的全基因组DNA,扩增病毒全基因组,Walking法测得全长序列。与HIV-1RL42和HIV-1HXB2株比较,分析基因特征。用Anthewin软件比较分析CNHN24株和RL42株env蛋白的二级结构。用Clustal软件对国内HIV-1分离株和国际参考株的全基因组、env基因和V3环基因分别进行了系统发育分析。结果发现,CNHN24株为HIV-1B′亚型,富含嘌呤,含量达到60.26%。与RL42株及HXB2株比较,pol基因和gag基因变异度较小,env基因及非结构基因变异度较大。与RL42株相比,env蛋白二级结构变异不大,但env保守区C4的氨基酸呈高度变异。系统发育分析显示,CNHN24株与RL42株遗传距离最近,HIV-1Lai株和HXB2株次之,与国内的HIV-1B/C及AE/BC重组毒株的遗传距离较远;从V3序列的比较可以发现,CNHN24株与来自云南省的毒株HIV-1CR206及RL42遗传距离最近。认为HIV-1CNHN24株可能由云南传入。     

中国小反刍兽疫病毒分离株China/Tib/07全基因组序列测定与分析

小反刍兽疫病毒属于副黏病毒科麻疹病毒属成员。本研究对我国首次分离的小反刍兽疫病毒株China/Ti-bet/07进行了全基因组序列测定及分子生物学特征分析。根据GenBank公布的小反刍兽疫病毒基因组序列设计引物通过RT-PCR扩增病毒基因组内部序列,通过3′和5′-RACE获得病毒基因组末端序列。序列测定与分析的结果表明,China/Tib/07株全长15948bp,预测编码6种结构蛋白和2种非结构蛋白,与已发表小反刍兽疫病毒基因组的长度和结构相似;在系统进化上与西南亚流行毒株有很高的同源性(91.6%～98.1%);与麻疹病毒属的其它成员相比,与牛瘟病毒的同源性最高(64.3%)。     

禽网状内皮组织增生症病毒env基因的原核表达及检测

根据禽网状内皮组织增生症病毒(REV)SNV株的前病毒基因组cDNA序列,设计并合成1对引物,以SNV株前病毒cDNA全基因组克隆为模板,通过PCR技术扩增出该病毒囊膜糖蛋白env基因部分片段。将PCR产物按正确的阅读框架定向克隆进pGEX-6P-1载体中谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的下游,将重组质粒转化进宿主菌BL21中,在1.0mmol/LIPTG(37℃)诱导下,env基因部分片段以融合蛋白的形式获得了良好的表达。表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,确定其表达的融合蛋白相对分子质量为72kD,并经Western-blot检测,发现在72kd目标条带处呈现一棕红色印迹。