中蜂囊状幼虫病毒RdRp基因dsRNA干扰的研究

中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)可以引起中蜂幼虫死亡,给中蜂的养殖造成严重的威胁。其RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)是病毒复制中必不可少的中心酶,控制着病毒的复制和翻译过程。本研究以CSBV RdRp基因为靶标,选取两个干扰区域RdRp-1和RdRp-2,并构建相应的dsRNA表达载体,获取dsRNA后进行RNAi实验,通过qRT-PCR检测CSBV RdRp基因的表达情况。实验结果显示:干扰片段RdRp-1不能显著下调RdRp基因的转录,而干扰片段RdRp-2可显著性下调RdRp表达并具有剂量依赖性,当添食2μg dsRdRp-2时,在72 h RdRp基因表达下调了85%,CSBV的衣壳蛋白VP1基因下调表达78%,幼虫死亡率降低60%,表明RdRp基因可以作为RNA干扰的靶标用于CSBV防治,本研究为后期在养蜂场进行蜜蜂病毒病的防治奠定了基础。     

RNAi靶向VP2基因抑制中蜂囊状幼虫病毒在中华蜜蜂幼虫体内复制研究

中蜂囊状幼虫病(Chinese sacbrood disease,CSBD)是造成中华蜜蜂患病死亡的主要原因之一,目前尚无有效的治疗方法。为了研究靶向中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)结构蛋白VP2基因的siRNA介导的RNA干扰(RNA interference,RNAi)作用和其对CSBV在中华蜜蜂幼虫体内复制的影响,设计合成针对CSBV VP2基因的特异性siRNA,以100 nM的浓度与pEGFPN1-VP2-CSBV融合表达载体共同转染至293T细胞中,通过荧光显微镜和流式细胞仪观察和分析siRNA在体外对CSBV VP2基因表达的干扰效果。同时,将siRNA(1μg/μL)和1×10~7拷贝数的CSBV共同饲喂2日龄中华蜜蜂幼虫,检测幼虫体内CSBV拷贝数和幼虫存活率,研究siR-NA对中华蜜蜂幼虫体内CSBV复制的影响。荧光结果显示,在293T细胞中siRNA能抑制CSBV VP2蛋白的表达,并且通过流式细胞仪检测分析发现干扰效果接近40%。幼虫饲喂实验表明,饲喂siRNA组在各时间点幼虫体内CSBV拷贝数均低于CSBV对照组,且在摄入siRNA后感染CSBV的幼虫存活率明显上升,与CSBV组差异极显著(P<0.01)。通过本研究,证明了针对CSBV结构蛋白VP2基因的特异性siRNA能够介导产生RNAi,影响CSBV在中蜂体内的复制,为深入研究CSBV VP2基因的功能和研发抗CSBV生物制剂提供了理论基础。     

中蜂囊状幼虫病病毒核酸和多肽的研究

中蜂囊状幼虫病病毒(CSBV)核酸经聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和琼脂糖凝胶电泳(AGE)分析,表明为单链RNA,易于降解;CSBV结构多肽经SDS-PAGE分析,有3个多肽,其分子量分别为27,000、29,000、39,000道尔顿。此病毒RNA和多肽与意蜂囊状幼虫病病毒(SBV)有差异。     

福建本地中蜂与不同地区中蜂的杂交试验

试验表明,福建本地中蜂Apis cerana cerana与不同地区中蜂间的杂交,可以产生杂种优势。经过两年生产考察,云×福、川×福、京×福等杂交组合的杂种一代中蜂,在产蜜量上都高于幅建本地中蜂,尤其是云×福杂交一代中蜂的采蜜量更显地高于其他杂交组合的中蜂。     

中蜂囊状幼虫病病毒的三维结构

提取纯化中蜂囊状幼虫病病毒(CSBV)的RNA,通过RT-PCR扩增获得1069bp的DNA片段,将其克隆到pGEM-T Easy载体上.测序分析表明,该段基因序列与意蜂囊状幼虫病病毒(SBV)基因序列的同源性为87.6%,与之对应的氨基酸序列的一致性高达94.6%,说明CSBV是与SBV十分相似而又不相同的病毒.在此基础上,应用冷冻电子显微镜与计算机三维重构方法测得病毒颗粒的三维结构,分辨率为2.5nm,其衣壳按T=1(p=3)的对称二十面体结构排列,表面光滑,有12个五邻体和132个孔洞.研究还发现,病毒内部的核酸是按5-3-2对称的二十面体结构排列,这种排列方式在细小RNA病毒中尚未见报道.     

中蜂扁腹茧蜂生物学和防治

中蜂扁腹茧蜂隶茧蜂科。本文报道其危害、形态、生活史;成虫羽化、性比、交尾产卵、寿命,寄生率;幼虫和蛹的特性;并提出防治意见。     

秦巴山区中华蜜蜂种群微卫星DNA遗传分析

【目的】中华蜜蜂Apis cerana cerana是一种兼有生态价值和经济价值的授粉昆虫。本研究拟揭示秦巴山区中华蜜蜂种群遗传多态性现状,探讨中华蜜蜂的种群分化机制及其影响因素。【方法】使用8个微卫星DNA标记评估秦巴山区17个样点共979个蜂群的中华蜜蜂遗传多态性,以长白山中华蜜蜂和阿坝中华蜜蜂作为外群进行种群遗传分化分析。【结果】秦巴山区中华蜜蜂95%的差异来源于样点内,样点间遗传分化系数(Fst)为0.002~0.037,基因流参数Nm为6.51~124.75,与外群的遗传分化分析中均显示秦巴山区中华蜜蜂不存在遗传分化。平均期望杂合度(He)为0.6877±0.1098,平均观察杂合度(Ho)为0.6364±0.1367,平均有效等位基因数(Ne)为3.7488±1.6201个,平均等位基因数(Na)为7.71±2.52个,多态信息含量(PIC)为0.6418±0.1152,香农指数(I)为1.5026±0.3754,这些参数均表明微卫星遗传多态性丰富。中蜂囊状幼虫病流行过的地区,其杂合度、多态信息含量以及等位基因数均显著低于未发病地区。【结论】秦巴山区中华蜜蜂种群数量大,分布均匀,基因流水平高,在650 km距离范围内没有发生种群分化;秦巴山区中华蜜蜂微卫星遗传多态性丰富,仅部分地区中华蜜蜂遗传多态性受中蜂囊状幼虫病的选择压而降低。     

重庆中华蜜蜂囊状幼虫病病毒多聚蛋白基因分子特性分析

【目的】分析地处中国南方的重庆地区中华蜜蜂 Apis cerana cerana（简称“中蜂”）囊状幼虫病病毒（sacbrood virus, SBV）（AcSBV-S.Chn-CQ）的遗传特性。【方法】采用RT-PCR法对采自重庆23个区县的阳性中蜂幼虫进行SBV多聚蛋白基因扩增、序列测定和序列分析,采用邻接法（neighbor-joining method）基于基因组和基因组片段SB11-SB12构建系统进化树,使用RDP3检测SBV的基因重组。【结果】AcSBV-S.Chn-CQ与中国南方中蜂SBV（AcSBV-S.Chn）其他分离株、越南北部东方蜜蜂 A. cerana SBV（AcSBV-N.Vie）、越南北部西方蜜蜂 A. mellifera SBV（AmSBV-N.Vie）、韩国东方蜜蜂SBV（AcSBV-S.Kor）的同源性较高。AcSBV-S.Chn-CQ在结构蛋白编码区域存在连续51个核苷酸缺失,在非结构蛋白编码区域有3个不连续的核苷酸缺失,与AcSBV-N.Vie, AmSBV-N.Vie和AcSBV-S.Kor核苷酸缺失相同。AcSBV-S.Chn-CQ与AcSBV-S.Chn-FZ, AcSBV-N.Vie, AmSBV-N.Vie和AcSBV-S.Kor在亚洲基因型中形成一亚型,亚型内检测到重组事件。【结论】推测AcSBV-S.Chn-CQ与SBV-N.Vie和AcSBV-S.Kor可能来自一个共同祖先。     

中蜂囊状幼虫病毒结构蛋白VP2的密码子优化表达及其免疫原性研究

利用生物信息学软件对编码中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)VP2结构蛋白的密码子进行优化来提高VP2蛋白表达量,并进行免疫原性研究确定VP2蛋白的免疫原性。通过对17株囊状幼虫病毒(SBV)和7株中蜂囊状幼虫病毒(CSBV)的VP2基因序列进行比对,选取代表毒株(GenBank:HM237361.1)CSBV-LN株VP2基因作为参考序列,并用在CSBV所有毒株中保守性相对较强的氨基酸替换CSBV-LN株VP2对应位置的氨基酸,通过在线软件(http://www.jcat.de/和http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/)对其密码子进行优化,构建原核表达质粒pET-28a-optiVP2,并转化入BL21(DE3)中,进行诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Westren blot鉴定正确后,将表达蛋白纯化并免疫至白来杭母鸡,对免疫鸡的抗体水平和淋巴细胞增值指数进行检测,研究CSBV VP2蛋白的免疫原性。同时,收集免疫后鸡蛋制备卵黄抗体,经纯化再与CSBV相互作用后,接种于3日龄蜜蜂幼虫,观察接种后幼虫死亡率,研究卵黄抗体中和CSBV病毒能力。结果显示,优化后的optiVP2能够在大肠杆菌中高效表达,其表达产物具有良好免疫原性,表达产物接种白来杭母鸡可诱导产生抗体,制备的卵黄抗体具有中和CSBV的作用。本实验实现了CSBV结构基因VP2在原核系统的高效表达,鸡免疫实验表明其具有良好免疫原性,并且可诱导鸡产生保护作用中和抗体,为进一步开发防治CSBV的生物制剂提供了帮助。     

中华蜜蜂热休克蛋白70的克隆、表达及中蜂囊状幼虫病毒感染后表达差异分析

[目的]本研究旨在明确中华蜜蜂Apis cerana cerana热休克蛋白70 (Heat shock protein 70,HSP70)与中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)的关系.[方法]首先根据NCBI上已公布的中华蜜蜂HSP70的全基因(NO.MH122655.1)序列,设计特异性引物,提取3日龄中华蜜蜂幼虫总RNA,通过RT-PCR方法获得HSP70基因,并通过生物信息学软件进行分析;其次将其克隆到原核表达载体pET-32a中,转化入大肠杆菌BL21(DE3)进行蛋白表达,并制备重组蛋白,将纯化的重组蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体;最后利用制备多克隆抗体作为一抗,通过Western-blot方法检测CSBV感染中华蜜蜂前后HSP70在幼虫体内的变化.[结果]成功获取中华蜜蜂HSP70蛋白的全基因,其核苷酸序列全长为1833 bp,生物信息学分析后,发现其编码蛋白存在7个抗原表位.利用原核表达系统,成功获得大小约87 ku的重组蛋白HSP70,免疫小鼠后获得多克隆抗体,经Western-blot分析能与标签蛋白发生特异性反应;对感染CSBV前后蜜蜂体内HSP70蛋白检测发现感染后HSP70表达水平显著提高.[结论]通过原核表达系统,成功表达中华蜜蜂HSP70基因和HSP70多克隆抗体,并证实CSBV感染后影响中华蜜蜂体内HSP70蛋白表达量的改变,为深入研究HSP70功能提供了帮助.     

中华蜜蜂AcNPC2b的原核表达和鉴定

[目的]中华蜜蜂Apis cerana cerana(简称中蜂),其胞内胆固醇转运体AcNPC2a能够识别并结合几种微生物的细胞壁,AcNPC2存在于该蜂触角,参与嗅觉通讯,关于AcNPC2b的功能尚未见报道.[方法]通过对中华蜜蜂AcNPC2b基因进行原核表达,以纯化的重组蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗血清;利用荧光定量PCR和免疫印迹检测AcNPC2b的转录活性及蛋白水平,通过微生物结合测定对AcNPC2b的功能进行探索.[结果]中蜂AcNPC2b含有信号肽和ML结构域,具有3个二硫键,与果蝇Drosophila melanogaster DmNPC2b聚为一个亚枝.荧光定量qRT-PCR检测发现,感染中蜂囊状幼虫病毒(Chinses sacbrood virus,简称CSBV)的幼虫体内AcNPC2b基因的表达呈现出先微弱下调再持续上调的趋势.获得了约16ku的重组蛋白AcNPC2b并制备了多克隆抗体,免疫印迹结果表明,中蜂AcNPC2b蛋白在工蜂头、胸与中肠中的表达量最高,触角、马氏管与脂肪体中次之.AcNPC2b蛋白在正常与感染CSBV病毒的中蜂幼虫中均有表达,且在感染CSBV的中蜂幼虫中有微弱上调.重组蛋白AcNPC2b微生物结合测定实验结果显示中蜂AcNPC2b重组蛋白均能与活的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、芽孢杆菌以及白僵菌结合.[结论]正常与感染CSBV病毒的中蜂幼虫体内AcNPC2b基因转录水平和AcNPC2b蛋白的表达含量存在差异,重组蛋白AcNPC2b具有识别并结合病原菌的能力,为后续深入研究AcNPC2b蛋白的分子功能奠定了一定理论基础.     

中蜂的传粉作用研究

蜜蜂授粉在维持自然生态系统的平衡与发展过程中发挥着重要作用,也与农业生态系统中农作物的增产及品质提升有着密切联系.中蜂(中华蜜蜂Apis cerana cerana)是我国特有的蜜蜂遗传资源,广泛分布于除新疆以外的华南、中南、西南、西北、华北及东北等地区,野生资源丰富、民间饲养基础好,种群数量大,是本土开花植物的重要传...     

中华蜜蜂和意大利蜜蜂感染囊状幼虫病毒后免疫及发育相关基因表达比较

【目的】本文旨在探究囊状幼虫病毒(sacbrood virus, SBV)对中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂)和意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,简称意蜂)工蜂幼虫发育和免疫基因、营养代谢基因、抗病毒基因、细胞发育及代谢相关基因表达的影响。【方法】从蜂群中移取2日龄的中蜂和意蜂幼虫,在培养箱(34℃, RH 85%)进行人工饲养,3日龄时接种SBV病毒,每天观察记录死亡情况,并通过实时定量PCR (real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)检测4日龄和7日龄幼虫体内SBV基因相对表达量,及免疫基因(Apidaecin、Abaecin、Hymenoptaecin、Denfensin、Lys-1、Pgrp-lc、Kenny、Domeless)、营养代谢基因(Ilp1、Hex110、Vg)、抗病毒基因(Dis3、Dicer、Ago1)、细胞组成及发育调控基因(Vhdl、Co-1-iv)以及细胞代谢和调控基因(Mta1)的表达水平。【结果】通过分析比较发现,感染相同剂量...     

LncRNA13164通过ace-miR-4968-y调节中华蜜蜂幼虫对蜜蜂球囊菌侵染的免疫应答

【目的】长链非编码RNA (long non-coding RNA,lncRNA)可通过竞争性内源RNA(competing endogenous RNA,ce RNA)等多种方式发挥重要的调控作用,但蜜蜂lncRNA的功能研究至今依然缺失,lncRNA在蜜蜂免疫应答中的作用尚不清楚。本研究旨在揭示中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂)幼虫响应蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis)侵染的免疫应答中lncRNA的调控功能及作用机制。笔者团队前期通过深度测序和生物信息学分析发现,lncRNA13164与ace-miR-4968存在靶向关系且潜在参与在中蜂幼虫对蜜蜂球囊菌侵染的应答。【方法】利用实时荧光定量PCR (real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测蜜蜂球囊菌接种后中蜂幼虫肠道内lncRNA13164的表达谱。采用ILoc-Lnc RNA软件预测lncRNA13164的亚细胞定位。联用RNAhybrid、Miranda和Target Scan软件预测lnc...     

引入西方蜜蜂对中蜂的危害及生态影响

作者阐述自1896年中国引进西方蜜蜂Apis melliferaL.的优良品种如意大利蜂Apis mellifera ligusticaSpinola和喀尼阿兰蜂Apis mellifera Carnica Pollmann以来,使当地的东方蜜蜂Apis cerana F.受到严重危害,其分布区域缩小75%以上,种群数量减少80%以上。使山林植物授粉总量减少,导致植物多样性减少。文中提出: 建立自然保护区保存本地蜜蜂遗传特性,和采用基因转移等技术,培育具有西方蜜蜂优良生产性能的中蜂新品种,逐步恢复中蜂的种群数量。     

中华蜜蜂对猕猴桃的访花行为及授粉效果研究

本研究采用中华蜜蜂Apis cerana cerana(简称"中蜂")为猕猴桃授粉,研究中蜂对猕猴桃的访花授粉行为规律,以及中蜂授粉对猕猴桃果实生长发育及品质的影响,以期为规范猕猴桃中蜂授粉和产业提质增效提供理论依据.结果表明:中蜂既采集雄花又采集雌花,每日的访花活动时间为7:40-19:30,访花的温度区间为18.9...     

文摘

人乳铁蛋白cDNA的克隆及序列分析 人MGMT基因cMNA的克隆表达及表达蛋白修复功能的鉴定 全人源化抗结肠癌单键抗体基因的克隆和表达 用腺相关病毒载体介导人血管内皮生长因子受体KDR胞外区基因的表达 表面等离子体共振技术在分子生物学中的应用 PAC579基因组序列外显子计算机分析与预测 中蜂囊状幼虫病病毒的三维结构     

基于TaqMan探针的蜜蜂囊状幼虫病病毒荧光PCR检测方法的建立和应用

为建立快速有效的蜜蜂囊状幼虫病检疫方法, 依据TaqMan荧光标记探针技术原理, 针对蜜蜂囊状幼虫病病毒保守序列, 设计出一对特异性引物和一条探针, 建立了一种快速检测蜜蜂囊状幼虫病病毒的荧光PCR方法。该方法对蜜蜂囊状幼虫病的检测具有较好的特异性, 与蜜蜂急性麻痹病病毒、蜜蜂慢性麻痹病病毒、蜜蜂残翼病病毒和黑蜂王台病病毒之间均无交叉反应。检测灵敏度可达1.0×10²拷贝/μL阳性质粒, 可对低病毒含量的样品进行准确检测。重复性和稳定性试验结果显示, 变异系数为1.6%, 说明该方法具有较好的重复性和稳定性。应用该方法对蜜蜂及蜂制品进行检测, 结果显示所建立的荧光PCR检测方法4 h内即可报告检测结果, 该方法具有快速、灵敏、特异及重复性好等优点, 适用于蜜蜂及其制品中蜜蜂囊状幼虫病病毒的快速检疫。     

我国蜜蜂主要病原检测技术

蜜蜂是重要的经济昆虫。蜜蜂病害威胁蜜蜂产业的发展。蜜蜂病害检测及病原鉴定是病害防治的基础。文章详细介绍我国蜜蜂常见6种主要病害(美洲幼虫腐臭病,欧洲幼虫腐臭病,囊状幼虫病,慢性麻痹病,微孢子虫病,白垩病)的病原快速准确的检测方法。     

侵染中华蜜蜂6日龄幼虫的蜜蜂球囊菌的微小RNA差异表达谱及调控网络

【目的】蜜蜂球囊菌(Ascosphaeraapis,简称球囊菌)是专性侵染蜜蜂幼虫的致死性真菌病原。MicroRNA(miRNA)作为一类重要的基因表达调控因子,能够广泛参与真菌及其宿主的相互作用过程。本研究通过比较分析球囊菌孢子(AaCK)和侵染中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂) 6日龄幼虫肠道内的球囊菌(AaT)的smallRNA(sRNA)组学数据对球囊菌的差异表达miRNA(differentiallyexpressed miRNA,DEmiRNA)、靶mRNA及二者间的调控网络进行全面解析,旨在揭示miRNA介导的球囊菌对中蜂幼虫的侵染机制。【方法】对于球囊菌侵染的中蜂6日龄幼虫肠道的small RNA-seq (sRNA-seq)数据,利用BLAST工具连续比对东方蜜蜂(Apiscerana)和球囊菌的参考基因组筛滤得到AaT的sRNA组学数据。分别将AaCK和AaT的sRNA组学数据比对miRBase数据库,对球囊菌侵染宿主前后miRNA的数量和结构特征进行分析。联用RNAhybrid+svm_light、Miranda和Tar...