DNA氧化损伤的免疫组织化学研究

采用目前公认的DNA氧化损伤标志物8-OHdG的单抗,利用LSAB法研究不同年龄组BALB/C小鼠胸腺和脾脏8-OHdG的生成水平,对免疫组织在衰老过程中DNA氧化损伤的水平进行免疫组织化学研究。以探讨免疫系统的自由基损伤对衰老的影响。结果表明,在胸腺,8-OHdG^ 细胞密度随增龄而增多,并主要位于髓质区;脾脏中的阳性细胞则无明显的增龄性变化,但胸染形态却存在明显差异。本研究结果显示,衰老过程中,免疫细胞内8-OHdG含量发生改变,免疫系统受到了氧自由基的损伤。8-OHdG可作为免疫老化过程中的一种生物标志。     

8-OHdG在医学领域的应用与研究进展

氧化应激带来的氧化损伤是造成人体多种损伤和病变的重要因素。8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy-2’-deoxyguanosine,8-OHdG)作为DNA氧化损伤产物是广泛用于研究疾病中氧化损伤机制的关键标志物。国内外大量研究已普遍应用8-OHdG作为分析指标,该文着眼于近年来研究动向,就8-OHdG的作用机理与检测方法,以及职业与环境暴露的危害评价、辅助疾病早期诊断、治疗和新药研发等方面的应用作一综述。     

基于胶体金的8-羟基-2′-脱氧鸟苷免疫层析试纸条北大核心CSCD

8-羟基-2′-脱氧鸟苷(8-hydroxy-2′-deoxyguanosine,8-OHdG)是评价DNA氧化损伤较灵敏和稳定的生物标志物。文中采用竞争法建立一种快速、灵敏检测8-OHdG的胶体金免疫层析试纸条。将样品垫(玻璃纤维素膜)、结合垫(玻璃纤维素膜)、硝酸纤维素膜和吸水垫依此粘贴在聚氯乙烯(polyvinyl chloride,PVC)底板上,构建试纸条。通过柠檬酸钠还原三水合四氯金酸制备胶体金(gold nanoparticles,AuNPs),8-OHdG配对的抗体(antibody,Ab)包被于AuNPs的外层(Ab coated AuNPs,Ab@AuNPs)作为探针。牛血清蛋白(bovine serum protein,BSA)与8-OHdG用碳二亚胺盐酸盐偶联制备人工抗原,作为检测线的包被抗原。羊抗鼠多抗(imunoglobulin G,IgG)作为质控线的包被抗体。对试纸条的硝酸纤维素膜、上样液的配方、金标抗体喷涂量等实验参数进行了优化。结果表明,硝酸纤维素膜(nitrocellulose film,NC)膜采用CN 95,上样液的最优配方为1%BSA+3%吐温-20+3%蔗糖+0.9%NaCl溶液,最适金标抗体喷涂量为4μL。利用试纸条在可见光下检测8-OHdG,根据检测线(test line,T线)和质控线(control line,C线)的显色强度对比,可初步判断尿液中8-OHdG的含量水平。并通过T线的灰度值计算尿液中的8-OHdG的浓度,检测限为2.55μg/L。该方法简单、快速且有较好的特异性,可检测人体尿液中的8-OHdG含量,以初步评价人体的健康状态。     

抗癌药顺铂对小鼠脑和肾组织DNA氧化损伤的检测分析

目的:探讨抗癌药顺铂(cisplatin)对小鼠脑和肾组织DNA的氧化损伤。方法:采用SABC法进行脑和肾组织8-OHdG的免疫组化染色。结果:顺铂给药组小鼠的大脑皮质和海马的毛细血管内皮细胞及肾小球毛细血管内皮细胞呈现8-OHdG免疫组化阳性反应,对照组小鼠在上述区域未见阳性反应细胞。结论:顺铂可引起大脑皮质和海马的毛细血管内皮细胞及肾小球毛细血管内皮细胞DNA的氧化损伤。     

一氧化氮合酶的遗传、生理研究进展

一氧化氮具有广泛的生理功能,哺乳动物体内的NO是由NO合酶(NOS)氧化L-精氨酸而合成的,合成后的NO迅速跨膜扩散释放,NO合成失调能介导多种疾病。催化NO生物合成的NOS有三种亚型:神经元型NOS(nNOS)、内皮型NOS(eNOS)和诱导型NOS(iNOS),目前,人的三型NOS已纯化并且已分子克隆成功,对一氧化氮合酶的遗传研究确认了NOS家族的基因结构和染色体定位。     

DNA氧化损伤8-羟鸟嘌呤与肿瘤的发生发展

有氧代谢有机体细胞无法避免活性氧(reactive oxygen species, ROS)的伤害。ROS会造成多种形式的DNA损伤,其中鸟嘌呤G的氧化产物8-羟鸟嘌呤(8-oxoG)是频度最高的一种DNA氧化损伤,由特异性的糖苷酶OGG1识别并开启碱基切除修复通路完成修复。8-oxoG如果没有及时修复,可能会在复制的过程中引入G:C配对到T:A配对的碱基颠换突变。因此8-oxoG的积累或OGG1修复功能异常被认为会影响基因功能,进而导致肿瘤或衰老相关疾病的发生,然而直接实验证据却极为有限。近年来一系列研究表明,8-oxoG倾向于产生在基因的调控区,在这种情形下,8-oxoG可视为一种表观遗传学修饰,而OGG1则是这一信息的特异性读取者,OGG1对底物的识别、结合或切除会引发DNA构象或组蛋白修饰的改变,进而引起基因表达的上调或下调。因此,除了潜在的遗传毒性,鸟嘌呤氧化损伤与肿瘤的关联与其通过表观遗传学机制引发基因表达的异常密切相关。本文对8-oxoG及修复酶OGG1与肿瘤发生发展的关联机制进行了分析与总结,旨在提示研究人员从新的视角解读DNA氧化损伤与肿瘤的关系,并为肿瘤的治疗提供新...     

植物体内一氧化氮合成途径研究进展

一氧化氮(NO)作为一种气体信号分子,在植物生理过程中发挥重要作用,它参与调节植物的生长、发育及对外界环境的应激反应.植物体内主要通过酶催化途径和非酶催化途径合成NO.酶催化途径合成NO的主要酶包括一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)和硝酸还原酶(nitrate reductase,NR),以及在某些植物的特定组织或器官或在特殊环境条件下存在的一氧化氮氧化还原酶(nitric oxide oxidoreductase,Ni-NOR)和黄嘌呤氧化还原酶(xanthine oxidoreductase,XOR).非酶催化合成途径主要是在酸性和还原剂存在条件下将亚硝酸盐还原成NO.该文主要结合研究方法,综述了植物体内NO合成途径的研究进展,为植物体内NO信号的作用机理的深入研究提供信息资料.     

孕酮通过抑制iNOS的表达和NO的生成保护新生鼠缺氧缺血性脑损伤

目的:观察孕酮对缺氧缺血性脑病新生鼠皮层和海马组织中一氧化氮(NO)的含量、诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)活性和iNOS表达的影响。方法:建立新生鼠缺氧缺血脑病动物模型,孕酮处理组于建立模型前腹腔注射孕酮溶液,24 h后动物被全部处死,采用硝酸还原酶法检测NO水平和iNOS活性的变化,免疫组化检测各组iNOS的阳性细胞数,RT-PCR检测iNOS mRNA的表达。结果:缺氧缺血组新生鼠皮层和海马组织中NO水平、iNOS活性、iNOS的阳性细胞数、iNOS mRNA的表达明显高于假手术组,孕酮处理组明显低于缺氧缺血组(P<0.05)。结论:孕酮可以保护新生鼠缺氧缺血后引起的皮层和海马损伤,其作用机制与抑制iNOS的活性,抑制iNOS的表达,降低NO水平有关。     

一氧化氮、内皮素-1对大鼠肢体缺血/再灌注后脑损伤的影响

目的: 研究一氧化氮(NO)和内皮素-1(ET-1)在大鼠肢体缺血/再灌注(LI/R)后脑损伤中的作用,探讨NO/ET-1平衡关系的变化对脑损伤的影响.方法: 在大鼠LI/R损伤模型上,应用NO合成前体物质L-精氨酸(L-Arg)、一氧化氮合酶(NOS)抑制剂氨基胍(AG)、ETA受体阻断剂BQl23进行干预,观察血浆 NO、ET-1、MDA、XOD、SOD、LDH及脑组织tNOS、iNOS、cNOS、NO、ET-1、MDA、XOD、MPO、 SOD的变化.结果: 与对照组比较,I/R组血浆MDA、XOD、LDH及脑组织MDA、XOD、MPO升高,SOD活性降低(P<0.01),脑组织tNOS和iNOS明显升高,而cNOS明显降低(P<0.01),I/R组血浆及脑组织NO、ET-1增加,NO/ET-1比值降低,脑损伤加重.应用L-Arg及BQ123后,血浆及脑组织NO/ET-1比值较I/R组升高,脑损伤减轻,应用AG后,NO/ET-1比值降低,脑损伤进一步加重.结论: 肢体缺血/再灌注后,一氧化氮与内皮素-l的比值降低时脑损伤加重.     

鼻咽癌5-8F细胞膜蛋白质组初步分析

细胞膜蛋白是细胞的重要组成部分,作为细胞的"门铃"与"门户",参与细胞内外物质交换、信息转换、细胞生长发育、细胞迁移以及免疫应答等重要生理活动.为鉴定鼻咽癌转移相关膜蛋白,运用差速离心联合双水相方法分离纯化鼻咽癌高转移细胞5-8F的细胞膜,SDS-PAGE分离膜蛋白,液相色谱/电喷雾串联质谱分析(LC-MS/MS)结合生物信息学分析鉴定出316种非冗余蛋白质,其中152种(48.5%)被注释为膜蛋白或膜相关蛋白.通过肿瘤差异蛋白质组数据库(dbDEPD)搜索,发现在114个膜蛋白中有49种膜蛋白与其它肿瘤的发生发展密切相关,其中21个膜蛋白与肿瘤转移相关.进一步分析发现膜蛋白CD104、VDAC2、CD298和SLC25A3与同属头颈部肿瘤的口腔癌转移相关,提示这4个膜蛋白也可能是鼻咽癌潜在的转移相关蛋白.研究结果提供了一个鼻咽癌细胞5-8F包含中高丰度膜蛋白的数据库,为进一步研究头颈部肿瘤鼻咽癌癌变分子机理积累了有价值的资料.     

肢体缺血预适应的肝保护作用与一氧化氮／内皮素-1系统关系的研究

目的：观察肢体缺血／再灌注（I／R）后一氧化氮／内皮素-1（NO／ET-1）失衡与肝损伤的关系以及缺血预适应（1pc）对NO／ET-1系统的调节作用。方法：实验用雄性Wistar大鼠18只,随机分为3组（n=6）：对照组（control）、缺血／再灌注组（I／R）和缺血预适应组（IPC＋I／R）,分别测定血浆谷草转氨酶（ALT）、谷丙转氨酶（AST）;血浆和肝组织一氧化氮（NO）、内皮素-1（ET-I）的含量变化,一氧化氮／内皮素-1（NO／ET-1）比值及肝组织的总一氧化氮合酶（tNOS）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、结构型一氧化氮合酶（cNOS）的水平;免疫组化法检测肝组织的诱导型一氧化氮舍酶（iNOS）、内皮型一氧化氮合酶（eNOS）的表达;HE染色,在光学显微镜下观察肝组织的形态学改变。结果：发现肢体再灌注期血浆和肝组织NO、ET-1均明显增加,而NO／ET-1的比值却明显降低,同时血浆ALT、AST升高,光学显微镜下肝细胞、内皮细胞肿胀,肝细胞变性及肝窦淤血,炎性细胞浸润,肝损伤加重,肢体I／R后肝组织iNOS的表达增强,而eNOS（主要为eNOS）的表达减少,伴有总NOS活性增强。说明肢体缺血再灌注后肝组织内皮源的NO产生减少,而非内皮源的NO产生增多;IPC减轻了肢体I／R后引起的NO／ET-1失衡。结论：肢体I／R后肝组织损伤与NO／ET-1失衡有关,IPC对肢体I／R继发的肝组织损伤的保护作用可能是通过对NO／ET-1系统的调节作用而介导的,此时内皮源的NO产生增加,非内皮源的NO产生减少。     

大鼠肢体缺血/再灌注后肺损伤及一氧化氮合酶的变化与意义

目的：研究大鼠肢体缺血／再灌注后急性肺损伤时,内皮型一氧化氮合酶（eNOS）和诱导型一氧化氮合酶（i-NOS）的表达及其在急性肺损伤发生中的作用。方法：雄性Wistar大鼠于后肢根部阻断血流后松解（4h／4h）,分别给予L-Arg和氨基胍（AG）预先干预,分为control、IR、L-Arg和AG组,免疫组织化学方法检测肺组织中iNOS和eNOS的表达,同时检测肺组织中MDA、MPO、W／D和NO2^-／NO3^-值,肺组织形态学观察以评价肺损伤的程度。结果：与control组比较,I／R组eNOS表达降低,iNOS表达增强,MDA、MPO、W／D和NO2^-／NO3^-值增加。肺组织充血、炎细胞浸润,肺泡腔渗液;与I／R组比较,L-Arg组eNOS、iNOS表达无明显变化,NO2^-／NO3^-增加。MDA、MPO、W／D降低,肺组织损伤有减轻趋势,AG组eNOS表达无明显变化,iNOS活性降低,NO2^-／NO3^-减少,MDA、MPO、W／D增加,肺组织损伤有加重趋势。结论：肢体缺血／再灌注急性肺损伤过程中,iNOS表达增加,NO生成增多,在肺损伤发生中有一定的保护作用。     

呼吸道合胞病毒感染人肺上皮细胞一氧化氮的产生及其作用

本文探讨呼吸道合胞病毒(RSV)感染人肺上皮细胞(A549细胞)后, 一氧化氮(NO)的水平变化及其在RSV感染中的氧化损伤和抗病毒作用。RSV以不同时间感染A549细胞, 并给予NO合成的抑制剂氨基胍(AG)处理。收集细胞培养上清, 分别用硝酸还原酶法和硫代巴比妥酸法检测NO和丙二醛(MDA)含量, 化学法检测羟自由基(OH·)与超氧阴离子(O2.—)水平, 空斑形成试验测定病毒复制滴度(PFU)。结果显示在RSV感染4 h后即上调NO、OH·、O2.—和MDA的表达水平。当RSV感染中给予AG处理以抑制iNOS合成NO时, 则降低OH·、O2.—和MDA含量, 但病毒PFU升高。各指标的变化与相应时间点的感染组相比, 差异均有显著性。提示RSV感染肺上皮细胞诱导生成的NO与细胞内自由基水平升高和加重细胞的自由基损伤程度有关; 但在一定程度上可抑制病毒的增殖水平。     

硫化氢对1型糖尿病大鼠膈肌NO含量和iNOS活性的影响

目的：观察硫化氢（H2S）对1型糖尿病大鼠膈肌一氧化氮（NO）含量和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）活性的影响。方法：将32只雄性SD大鼠随机分为4组：正常组（NC组）、糖尿病组（DM组）、糖尿病治疗组（DM + NaHS组）和NaHS对照组（NaHS组）（n=8）。采用一次性腹腔注射链脲佐菌素55 mg/kg制备1型糖尿病大鼠模型,造模成功后第4周起,DM + NaHS组和NaHS组大鼠腹腔注射NaHS溶液14μmol/kg干预治疗。连续注射5周后,测大鼠空腹血糖值（FBG）和膈肌重量/体重量比（DW/BW）;HE染色观察膈肌显微结构变化;利用NOS分型测试盒测膈肌组织iNOS活性;硝酸还原法测定膈肌组织NO含量;利用RT-PCR和Western blot分别检测膈肌组织iNOS mRNA和蛋白表达。结果：与NC组比较,DM组大鼠FBG显著升高,膈肌显微结构损伤明显,DW/BW下降,膈肌组织iNOS活性和NO含量显著增加,iNOS mRNA和蛋白表达明显增高,NaHS组各项指标差异无统计学意义。与DM组比较,DM + NaHS组膈肌显微结构明显改善,DW/BW增高,膈肌组织iNOS活性和NO含量明显下降,iNOS mRNA和蛋白表达显著降低。结论：外源性补充H2S可能通过下调膈肌组织iNOS活性和蛋白表达,降低NO含量,进而保护糖尿病大鼠膈肌的功能。     

DNA修复酶MYH在食管鳞癌的表达和临床意义

目的:探讨食管鳞癌组织MYH的表达与8-oxoG氧化损伤和临床病理特征之间的关系。方法:用免疫组化染色和Western blot实验,比较食管鳞癌组织和癌旁组织MYH表达的高低;用免疫组化染色比较食管鳞癌组织和癌旁组织8-oxoG氧化损伤程度的高低。统计分析食管鳞癌组织MYH表达的高低与患者临床和病理特征的关系,采用x2检验。结果:食管鳞癌组织MYH蛋白表达低于其癌旁组织,食管鳞癌组织8-oxoG氧化损伤程度高于其癌旁组织。食管鳞癌组织MYH蛋白低表达,与该组织8-oxoG氧化损伤程度、浸润深度、静脉侵犯、TNM分期、淋巴结转移有关,与年龄、性别、病理分化程度无关。结论:食管鳞癌组织MYH蛋白低表达,可能与食管鳞癌的发展有关,后常规对患者食管癌标本做MYH表达的检测,可指导食管鳞癌术后化学治疗方案的制定。     

慢病毒转染对鼻咽癌细胞5-8F增殖迁移的影响

目的:探讨慢病毒转染对鼻咽癌细胞株5-8F增殖、迁移的影响,以验证慢病毒转染是否能有效的应用于鼻咽癌细胞的增值及迁移相关研究。方法:以红色荧光标记的慢病毒为转染载体,选定不同的MOI值转染鼻咽癌5-8F细胞株,扩大培养后筛选纯化,流式细胞仪检测转染效率。以最佳MOI值转染后的5-8F(RFP-5-8F)细胞为实验组,未转染的亲代5-8F为空白对照组,取对数生长期未转染的亲代5-8F和红色荧光标记的慢病毒转染的5-8F(RFP-5-8F)细胞进行MTT、划痕实验,观察细胞镜下形态,了解细胞转染前后生长曲线,细胞迁移能力的变化。结果:流式细胞仪检测5-8F细胞慢病毒转染效率大于95%,转染最佳MOI值为30,镜下荧光强度适中。实验组与对照组比较,转染前后5-8F细胞光镜形态相似,生长曲线一致,差异无统计学意义(P=0.997),划痕实验显示5-8F与RFP-5-8F细胞迁移能力一致,差异无统计学意义(P0.05)。结论:慢病毒转染后鼻咽癌细胞能真实有效的的反应原细胞的增值及迁移能力,可以很好的应用于鼻咽癌增殖及其转移机制的相关研究。     

NO在实验性大鼠颈动脉瘤发展中的作用

目的建立一种新的颈动脉动脉瘤模型,观察iNOS在实验性动脉瘤组织局部的表达情况和选择性iNOS抑制剂氨基胍对动脉瘤增大和对血清NO水平的影响。方法50只SD大鼠随机分为3组,应用弹性蛋白酶灌注颈总动脉建立颈动脉梭形动脉瘤模型。A组给予氨基胍干预;B组给予生理盐水;C组为阴性对照。测量颈总动脉直径和血清硝酸盐含量。应用HE、免疫组化和原位杂交评价动脉瘤的病理特征和iNOS的局部表达特点。结果选择性iNOS抑制剂可以明显抑制动脉瘤增大的程度和血清硝酸盐水平。诱导的动脉瘤病理特征和外形与人动脉瘤组织相似,主要表现为动脉瘤壁明显增厚,内弹力膜和弹性膜全部消失,平滑肌细胞层变薄和消失。中膜和外膜管壁大量的炎症细胞浸润,氨基胍明显抑制iNOS的表达。结论应用弹性蛋白酶灌注颈动脉可以在大鼠诱导出梭形动脉瘤。动脉瘤的增大与局部升高的NO有关。     

程序性死亡配体-1在鼻咽癌组织中的表达及临床意义

目的:探讨程序性死亡配体-1(PD-L1)在鼻咽癌组织中的表达及临床意义。方法:选取2015年7月-2017年6月期间在我院接受治疗的鼻咽癌患者333例,收集其鼻咽癌组织作为观察组标本,另选取同期在我院接受治疗的慢性鼻咽炎患者102例的鼻咽炎组织作为对照组标本。采用免疫组化法和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测两组患者鼻咽组织中PD-L1蛋白和PD-L1 mRNA的表达,并分析观察组患者鼻咽癌组织中PD-L1蛋白和PD-L1 mRNA的表达与临床病理参数的关系。结果:对照组患者鼻咽炎组织中PD-L1蛋白的阳性率为0.00%(0/102),观察组患者鼻咽癌组织中PD-L1蛋白的阳性率为69.37%(231/333),两组PD-L1蛋白的阳性率比较差异有统计学意义(P0.05)。RT-PCR结果显示,对照组患者鼻咽炎组织中未见PD-L1 mRNA表达,观察组患者鼻咽癌组织中PD-L1 mRNA的相对表达水平为(0.82±0.27),差异有统计学意义(P0.05)。观察组患者鼻咽癌组织中PD-L1蛋白和PD-L1 mRNA的表达与年龄、性别无关(P0.05),而TNM分期为Ⅲ-Ⅳ期、有淋巴结转移、有吸烟史患者鼻咽癌组织中PD-L1蛋白阳性率和PD-L1 mRNA的表达均高于TNM分期Ⅰ-Ⅱ期、无淋巴结转移、无吸烟史患者(P0.05)。结论:在鼻咽癌组织中PD-L1蛋白和PD-L1 mRNA呈现高表达,且其表达与TNM分期、淋巴结转移、吸烟史有关。     

核因子κB、NO 与肺纤维化的研究进展

国内外对导致肺纤维化的肺部疾病中诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)基因在NF-κB参与诱导活化下,催化合成的一氧化氮(nitric oxide,NO)在肺纤维化过程中发挥细胞保护性及细胞毒性双重作用的研究已取得一些进展。本文主要阐述iNOS基因在NF-κB诱导活化下合成的NO与肺纤维化的关系,从而为NO作用的双重性和网络性及NO与肺纤维化关系的研究提供一些线索。     

糖皮质激素对机械通气大鼠肺组织iNOS、NO表达的影响

目的通过观察糖皮质激素对机械通气大鼠肺组织诱导型一氧化氮合酶（iNOS）及一氧化氮（NO）表达的影响,探讨糖皮质激素对呼吸机所致肺损伤（ventilator induced lung injury,VILI）的干预作用。方法 24只雄性Wistar大鼠随机分为对照组、机械通气组、地塞米松（DXM）干预组。用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法检测肺组织iNOS mRNA表达,用免疫组织化学染色法检测肺组织iNOS蛋白表达,用硝酸还原酶法测定肺组织和血浆NO含量。结果机械通气组和DXM干预组大鼠肺组织iNOS mRNA及其蛋白表达水平,以及血浆和肺组织NO含量均明显高于对照组（P〈0.01）;DXM干预组上述指标与机械通气组比较均明显降低（P〈0.01）。结论糖皮质激素可通过抑制肺组织iNOS的表达,减少NO的生成,对机械通气大鼠肺组织具有保护作用。