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苜蓿中华根瘤菌与耐盐有关DNA片段的亚克隆和测序分析 总被引:3,自引:1,他引:2
将苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)042B与耐盐有关的4kb ClaⅠ DNA片段克隆在pML122上,用HindⅢ酶切下其2.4kb DNA片段,回收后与pBBR1\|MCS2连接,然后转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α,筛选到转化子GS2〖DK〗。将残留在pML122上16kb ClaⅠ\|HindⅢ DNA片段连同质粒一起回收,让其自连,转化大肠杆菌S17-1,得到转化子GS0。以GS0为供体,042B的盐敏感突变株GZ17为受体,进行二亲本杂交,没有得到接合子。以GS2为供体,GZ17为受体,在辅助质粒pRK2013的协助下,进行三亲本杂交,筛选到接合子GG2,获得2.4kb HindⅢ与耐盐有关的DNA片段。将此片段连接到测序载体pGEM\|7Zf(+)上进行测序。测序结果表明,该24kb HindⅢ DNA片段含有3个开放阅读框(ORF)。在此基础上再一次亚克隆,获得19kb与耐盐有关的DNA片段。 相似文献
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费氏中华根瘤菌与耐盐有关基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达 总被引:5,自引:0,他引:5
费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)RT19与耐盐有关的4.4kb DNA片段含有3个相间的开放阅读框,经亚克隆及功能检测,证实其中的ORF2与耐盐有关,将ORF2分别克隆到表达载体pTHioHisA、B和C上,得到3个重组质粒pGA、pGB和pGC,转化大肠杆菌(escherichia coli)5α。经IPTG诱导后和作SDS-PAGE分析,发现只有pGC编码的融合蛋白获得了表达,其分子量为53kDa。恰好是trxA基因编码的硫氧还蛋白与推测的蛋白质分子量之和。Westerm印迹证实,表达的蛋白质是trxA基因和目的基因编码的。 相似文献
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转座子挽救法对苜蓿中华根瘤菌与耐盐有关基因的定位 总被引:5,自引:0,他引:5
用含Tn5转座子的质粒pRL1063a诱变苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)042BM,得到盐敏感突变株042BML-2。采用转座子挽救法对Tn5插入位点两边的序列进行克隆与测序,获得了1179bp的转座子插入位点侧翼DNA序列。在GenBank中进行序列同源性和基因定位分析,结果表明:转座子插入在一个功能未知的基因内部,此基因长6270bp。研究证明:该基因与042BM的耐盐性有关,并定名为rtsC。氨基酸疏水性分析表明,在RtsC蛋白的N端有两个跨膜区,该蛋白与细菌趋化性相关蛋白的功能域有同源性。并对RtsC蛋白在苜蓿中华根瘤菌042BM耐盐性中的作用进行了讨论。 相似文献
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苜蓿中华根瘤菌与耐盐有关基因rstA在大肠杆菌中的高效表达及其产物的纯化 总被引:2,自引:1,他引:1
苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti) 0 4 2BM与耐盐有关的1 9kbDNA片段含有两个开放阅读框,采用PCR方法分别将它们扩增,连接到穿梭质粒上,并进行了耐盐功能检测,证明其中的ORF2具有耐盐性,定名为rstA基因。将它分别克隆到表达载体pThio HisA、B和C上,构建成重组质粒pGSA、pGSB和pGSC ,转化大肠杆菌(Escherichiacoli)Top10后,经IPTG诱导,pGSA获得高效表达。表达蛋白占菌体总蛋白的36 % ,但大多数以包涵体形式存在。对表达产物依次进行ProBondTM树脂亲和纯化、饱和硫酸铵盐析,最后得到纯度为95 %的融合蛋白。SDS PAGE显示纯化的蛋白质为分子量4 3kD的单一蛋白带,经Westernblot检测证实了表达结果 相似文献
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根瘤菌的nodABC和nodD在结构和功能上保守,在不同的菌种之间能够互换[1],是目前所有供试的豆科植物结瘤所必不可少的,称为共同结瘤基因。另一类是寄生专一性结瘤基因,如苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)的nodPQ等[2... 相似文献
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对苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti) 0 4 2BMnoeAB基因的表达调控进行研究。结果发现,葫芦巴碱不能使noeAB的表达水平提高,证明它们的转录不受nodD2的调控。当nodD3和syrM同时存在时,noeAB的表达水平没有明显的变化,表明它们也不受nodD3 syrM系统的调控。在FY基本培养基上,毛地黄黄酮的诱导使noeAB基因的表达水平提高16倍,而在不添加该诱导物的TY培养基上,noeAB基因的表达水平也能够提高30倍以上,说明noeAB是受nodD1控制的,但除受毛地黄黄酮诱导外,noeAB还可能受到其他因子的调节 相似文献
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通过同源性分析,发现苜蓿中华根瘤茵(Sinorhizobium meliloti)菌株Rm1021中matB基因与三叶草生物型豌豆根瘤茵(Rhizobium leguminosarum by.trifolii)和慢生型大豆根瘤茵(Bradyrhizobium japonicum USDA110)中编码丙二酸单酰辅酶A合成酶(malonyl-CoA synthetase)基因在氨基酸水平上分别达到了75%和67%一致性,具有高度同源性。因此,从Rml021中克隆出matB基因,并在大肠埃希菌(Escherichiacoli)中进行体外诱导表达和纯化。纯化的MatB蛋白具有丙二酸单酰辅酶A合成酶的活性,测定的Km值是710μmol,Vmax是0.209μmol/min/mg。 相似文献
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通过PCR扩增获得了 0 4 2BM的noeA基因。该基因与苜蓿中华根瘤菌 (Sinorhizobiummeliloti) 10 2 1noeA的同源性为 99% ,而其NoeA与 10 2 1NoeA的相似性为 97%。还发现其NoeA与中慢生根瘤菌 (Mesorhizobiumsp .)BNC1可能的SAM_依赖性的甲基转移酶相似性为 32 % ,而其 30 3~ 36 2氨基酸区域与大肠杆菌 (Escherichiacoli)的核糖体 5 0S亚基的L11蛋白甲基转移酶 (PrmA)的 16 0~ 2 2 0氨基酸区域的相似性达到 4 1%。通过插入卡那盒 ,敲除noeA ,获得突变株 0 4 2BMA_Km。与苜蓿中华根瘤菌 0 4 2BM相比 ,敲除noeA的突变株在普通紫花、保定、宁夏、百发和傲汉苜蓿品种上的结瘤数、根瘤鲜重和植株地上部分的干重都有不同程度的增加 ,而在秘鲁苜蓿品种上的结瘤数和植株地上部分的干重明显下降 ,在皇后和美国杂花苜蓿品种上则没有明显的变化。 相似文献
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苜蓿中华根瘤菌042B是一株能在苜蓿和大豆上结瘤的菌株。将042B的nodSD基因克隆到时载体pBBR1MCS-5,并在豌豆根瘤菌LRR5045系统中进行功能分析,发现042B的NodD蛋白能与大豆的类黄酮化合物genistein结合,也怀苜蓿原类黄酮化合物luteolin反应。 相似文献
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LEA蛋白是与植物抗逆反应相关的一类重要蛋白质,可以在发育的植物胚胎、处于干旱、寒冷、盐胁迫的植物组织中高水平表达。LEA蛋白最早发现于棉花子叶中,随后也在其他高等植物、藻类、真菌、蓝藻以及线虫中被发现。LEA蛋白代表一个庞大的基因家族,早期是根据 相似文献
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水稻线粒体DNA雄性不育有关特异片段的克隆及序列分析 总被引:7,自引:0,他引:7
应用任意单引物聚合酶链反应技术,从水稻WA 型雄性不育系的线粒体DNA 中得到一个特异的扩增片段R2-630 WA。以该片段为探针进行Southern 杂交分析检测到在雄性不育胞质与正常可育胞质间存在的线粒体DNA 多态性。不育系珍汕97A 和其F1 杂种的杂交图谱相同。而保持系珍汕97B和恢复系明恢63 的杂交图谱一样。序列测定该片段全长629 bp,其碱基组成A+ T= 54.1% ,同源性比较结果显示, 该片段与1236 个已报道的植物基因(包括16 个水稻线粒体基因)序列的同源性均小于50% 。序列内含有一个长度为10 bp 的反向重复序列5-ACCATATGGT-3,位于262—272 区段。另外,其379—439 区段可编码一个含20个氨基酸残基的短肽。上述结果表明,R2-630 WA 片段确与水稻野败型雄性不育密切相关。推测反向重复序列5-ACCATATGGT-3在细胞质雄性不育性状形成中,可能起着重要作用 相似文献
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银鲫两个蛋白合成相关基因全长cDNA的克隆及其特征分析 总被引:3,自引:3,他引:3
通过构建雌核发育银鲫心跳期SMART cDNA质粒库并从库中随机挑选克隆测序,克隆得到银鲫翻译起始因子3亚单位2(GTIF3—S2)和翻译延伸因子1亚单位α(GEF-1α)基因全长cDNA。银鲫翻译起始因子3亚单位2基因cDNA全长1280bp,开放阅读框位于117—1091bp之间,编码325个氨基酸。其推断的氨基酸序列存在三个WD结构域。该基因在鱼类中为首次报道。银鲫翻译延伸因子1亚单位alpha基因cDNA全长1784bp,开放阅读框位于82—1467bp之间,编码462个氨基酸。RT-PCR表明,这两个基因在成熟卵母细胞和胚胎发育早期可以检测到少量的转录产物,在胚胎发育期间从原肠期开始转录,并随着发育进程逐渐增强。成鱼组织中除精巢表达较弱外,其他组织都表达较强。同源分析比较表明,TIF3-S2和EF-1α在物种进化过程中具有高度的进化保守性,在物种间的同源性很高。因此,作认为,这两个基因是研究物种间系统发育的优良对象。 相似文献