啤酒酵母原生质体的制备、融合及再生

本文以16号(his~-)啤酒酵母和STA(ade~-)啤酒酵母作出发菌株进行原生质体融合,并探讨了菌龄、酶解时间,菌体分散程度和培养基种类等对原生质体融合的影响。     

啤酒酵母融合株QSB-Ⅺ6的发酵试验

从选育构建的大量融合子中,得到了较好的、各具特色的近百株啤酒酵母菌株,在进行小型发酵试验及理化指标鉴定的基础上选出了由出发菌株LQ16与QSB7得到的融合株QSB-Ⅺ6,经六个批次的小试发酵与生产性能、理化指标的全面鉴定,证实QSB-Ⅺ6是一株口味独特、发酵率高、凝絮性强兼具多种优良性状的啤酒酵母新菌株.     

灭活原生质体作黑木耳融合育种遗传标记研究

本文采用0.83％碘乙酰胺(CIA)化学灭活剂和热处理灭活方法,对黑木耳单株原生质体灭活,观察了化学灭活与不同温度热灭活的灭活效果。并通过对灭活原生质体与未经灭活处理的原生质体融合后再生产物分析、证明,不论化学灭活还是热灭活处理,只要筛选好灭活条件,作为黑木耳种内原生质体融合遗传标记是可行的。     

林青链霉菌双亲灭活原生质体融合的研究

分别以紫外线、热灭活性林肯链霉菌947和9502原生质体,然后进行灭活双亲的原生质体融合,从16株融合子筛选到林青霉素高产株。用双亲的互补营养缺陷型对林肯链霉菌原生质体的制备、融合、再生的部分条件进行了研究。发现含0．4％Gly和34％蔗糖的SM培养基最适于实验菌株原生质体的制备、再生。聚乙二醇（PEG）分子量对原生质体融合影响不大,其在P缓冲液中的浓度却很重要。含50％PEG的P缓冲液最有利于原生质体融合。     

灭活原生质体融合选育木糖、葡萄糖共发酵酿酒酵母工程菌

为了选育高效利用木糖、葡萄糖共发酵,并使乙醇产量有所提高的酿酒酵母工程菌株。以酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae W5和休哈塔假丝酵母Candida shehatae 20335为亲本株,确定了双亲株原生质体灭活剂量,并进行原生质体融合获得融合子,用高效液相色谱（HPLC）测定融合子以木糖、葡萄糖单碳源及混合碳源发酵时的乙醇得率。结果表明,获得一株发酵性能优良的融合子HDY2-14,其利用木糖和葡萄糖单碳源发酵的乙醇得率分别为0.213g/g和0.257g/g,混合碳源发酵的乙醇得率为0.310g/g,其中混合碳源乙醇得率比亲本株W5和20335的乙醇得率分别提高了20.2%和15.2%。     

树状多节孢的双亲灭活原生质体融合*

以紫杉醇产生菌树状多节孢HQD33的诱发突变株UL50-6和UL40-19 为出发菌株,将收集到的出发菌株UL50-6和UL40-19的菌丝体分别用pH5.5~6.0的0.7mol/L NaCl配制的3%溶壁酶、2%蜗牛酶、1%溶菌酶组成的复合酶系,30℃恒温酶解3~5h,制备原生质体。两菌株的原生质体经纯化后分别用热和紫外线灭活,其中UL50-6的原生质体在54℃热灭活5分钟,UL40-19的原生质体在30W紫外灯下,30cm,照射85秒进行紫外灭活,双亲株的原生质体存活再生率为零。同时对融合条件进行了初步探索,以含有Ca2 和Gly的35%~40%的PEG作为融合剂,融合时间为20分钟时,融合率可以达到4.44?0-2~6.92?0-2。对融合株TPF-1与双亲株的形态学、可溶性蛋白、过氧化物同工酶进行分析,确证其为双亲株的融合子。     

通过原生质体融合产生的苏云金杆菌的新菌株

用苏云金杆菌以色列变种Bacillus thuuringiensis subsp.israelensis和苏云金杆菌库斯塔基变种Bacillus thuringuensis subsp.kurstaki HD-1进行了PEG诱导的原生质体融合实验,探讨了影响原生质体形的几个条件。用抗性标记对融合子进行了选择,在198株融合子中,有17株稳定传代10次以上。它们具有两个亲本菌株所具有的一些特性。在融合子中,BTI比HD-1稳定。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法研究比较了稳定融合子的晶体毒素成分,观察到了代表HD—l毒素蛋白和BTI毒素蛋白的带。杀虫试验结果表明,融合形成的杂种菌株具有毒杀文字孑孓和鳞翅目幼虫的能力。     

利用原生质体融合选育米尔贝霉素高产菌株

以米尔贝霉素产生菌株M1834与M18102为出发菌株。用溶菌酶处理米尔贝吸水链霉菌获得原生质体,采用原生质体融合育种技术,通过摇瓶验证选育高产菌株。经大量筛选获得6株米尔贝霉素高产融合菌株,其中融合菌株M19046的发酵效价为6433μg/mL,比出发菌株M1834（4600μg/mL）、M18102（4432µg/mL）分别提高了39.8%和45.1%,并且遗传性状稳定。测试了米尔贝霉素高产菌的保藏方法、培养周期、培养方法等条件对其产量的影响。表明微生物原生质体融合育种技术在理论和实际生产中都具有重要意义。     

用灭活原生质体融合进行高温香菇育种——Ⅰ.融合产物的选出及其鉴定

用灭活的近裸香菇(Lentinus subnudus Berk.)双核菌株原生质体与香菇[L. edodes(Berk.)Sing.]双核菌株原生质体融合,在35℃的条件下选得融合子。融合频率为0—4.3×10~(-5)。融合子与双亲有明显的拮抗性。融合子的菌丝形态、氨基酸含量,子实体的形态,以及酸性磷酸酶同功酶的测定都与双亲不同。     

融合株SPSC发酵生产酒精的工艺研究 Ⅰ.絮凝速率、发酵过程的最适温度和pH值

酿酒酵母属(S. cereviae)变异株和粟酒裂殖酵母属(S. pombe)变异株进行属间原生质体融合得到融合株SPSC,该融合株比S. cereviae具有强的自身絮凝能力。以葡萄糖浓度150g/L的底物在30～44℃的温度范围内进行摇瓶厌氧发酵,获得最佳温度范围为34～38℃,最高发酵温度为40℃。在有效容积2.35L悬浮床反应器中,在pH值3.0～5.0范围内进行连续发酵,获得最适发酵pH为3.5～4.5。     

清酒酵母与酿酒醇母原生质体融合的研究

清酒酵母（ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｓａｋｅＹａｂｅ）是日本清酒的生产菌株．耐酒精能力强;Ｋ氏酿酒酵母（ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＫ）是酒精生产的常用菌株,发酵力强。本文应用原生质体融合技术进行了二菌株原生质体融合的研究。通过硫酸二乙酯（ＤＥＳ）诱变得到营养缺隐型菌株Ｑ（ａｒｇ－）和Ｋ（ｌｙｓ－,ρ－）,其融合率为１．２５×１０－５。检出的融合子其酒精发酵特性、细胞形态、体积大小都不同于双亲菌株。比较了在２８℃培养条件下,出发余株清酒酵母,Ｋ氏酿酒酵母和融合子Ｆ１、Ｆ２的发酵速度曲线、乙醇产量和酒精耐量等,得到一株在２８℃培养条件下,乙醇产量为７．４％（Ｖ／Ｖ）,酒精耐量为１５％的融合株Ｆ１。     

单亲灭活柠檬酸杆菌与奇球菌原生质体融合

利用单亲灭活原生质体技术对柠檬酸杆菌和奇球菌原生质体进行了融合,考察了原生质体制备条件与融合中的影响因素。试验表明,随着溶菌酶浓度,酶解时间的增加和温度的上升,原生质体的形成率呈上升趋势,而再生率则逐渐下降。另外,正交试验结果表明,在PEG(6000)浓度40%、融合时间10min、融合温度42°C、pH值为8的条件下促融,最大融合频率可达2.74×10-7。筛选出来的融合子传代10次,性状稳定。进一步研究发现融合子在铀溶度为85mg/L时,比柠檬酸杆菌耐受性好;融合子和亲本吸附比较试验中,融合子总体吸附性能比柠檬酸杆菌略高。研究结果为耐辐射基因工程菌的构建提供了基础。     

高产融合子Q4413的遗传学研究

本文通过对枯草芽孢杆菌BR151衍生株与北京棒杆菌1134衍生株的赖氨酸高产融合子Q4413的遗传型研究、生物量(菌体湿重、菌重、菌体体积和菌体密度)测定、DNA含量测定和GC比的研究,揭示了融合子在遗传学方面与双亲株之间的差异,进一步证实了该株确系稳定的重组子或新的融合子.     

原生质体融合子代的筛选和鉴定

介绍了绿色木霉N6和黑曲霉856原生质体融合子代的研究。经传代、发酵、筛选,从11株初筛的融合子中得到了3株纤维素酶活高且稳定的菌株AT23、AT16、AT34,其CMC酶活分别为亲本绿色木霉N6的2．2倍、1．4倍、1．2倍。并对其进行制霉菌素抗性试验和可溶性蛋白质凝胶电泳分析鉴定。试验结果证明了AT23、AT16、AT34是基因发生了重组的融合子且具有杂种优势。     

啤酒酵母融合子QSB-Ⅺ_6遗传学和生理学特征的研究

利用生物工程技术获得了一株QSB－Ⅺ6啤酒酵母融合子,其发酵力、凝絮性均较双亲有提高,口味也明显改善,小试、中试、生产试验效果很好。为全面开发和利用该工程菌株,以啤酒酵母融合子QSB－Ⅺ6及其亲本LQ16和QSB7为对象,进行细胞体积测定,生物量测定,遗传型鉴定和DNA含量等测定,确定其主要遗传学和生理学特征,从而证实菌株QSB－Ⅺ6是融合子．     

香菇原生质体融合及融合子的鉴定

以香菇（Ｌｅｎｔｉｎｕｓｅｄｏｄｅｓ）种内不同株一对亲和的单核菌丝（７４０２〈２〉和９１０１〈１２〉）为亲本,以碘乙酰胺失活７４０２〈２〉作为筛选标记,经过原生质体制备、ＰＥＧ融合及融合子再生等步骤,选育得融合子。融合子与双亲无拮抗性,在菌丝形态,核数目及可溶性蛋白质图谱、酯酶同工酶谱和过氧化物酶谱上均与双亲单核菌丝及担孢子杂交子有区别。将Ｋｎｏｗｌｔｏｎ等于１９８４年建立的一种分离高频再生衍生株的方法首次运用至食用菌中,使原生质体再生率提高２－３倍,为融合操作提供了方便。     

耐温酵母与酿酒酵母的属间融合及融合株的高温乙醇发酵

利用原生质体融合技术进行耐温的克鲁维酵母（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ Ｙ０３４）与酿酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｕｉｓｉａｅ Ａ００１） 的属间融合,获得属间隔合子ＡＹ０６８。该融合株在４５℃下进行高温乙酵发酵,结果表明融合株表达了双亲耐温和产酒率高的特性。通过正交试验优化培养基成分,表明蛋东用量对菌体热抗性差异显著。比较了不同温度条件下,菌体生物量、糖利用率、ｐＨ因素与酒精产率的