苏云金芽孢杆菌HD-1伴孢晶体水解规律的研究

采用HCl将蛋白质彻底水解的方法对苏云金芽孢杆菌HD-1伴孢晶体的水解规律和酸水解条件下芳香族氨基酸的被破坏程度进行了研究,不经衍生HPLC法直接测定水解样中酪氨酸的含量。得出酸水解的最佳时间为24h、水解剂的用量为1．0mlHCl／mg伴孢晶体、水解最佳温度为110℃。该研究为Bt制剂毒力效价的测定奠定了基础。     

谷氨酸对苏云金杆菌的芽孢和伴孢晶体的影响

研究了不同浓度的谷氨酸对苏云金芽孢杆菌形态、菌体浓度及芽孢和件孢晶体的影响.研究表明,一定浓度的谷氨酸有利于菌体的生长并能够提高菌体的增殖速度,对芽孢和伴孢晶体的形态没有明显的影响,但对芽孢的裂解有明显地抑制作用.     

苏云金芽孢杆菌工程菌伴孢晶体的形态发生

苏云金芽孢杆菌在有帮助蛋白存在的情况下杀虫晶体蛋白获得了超量表达。通过透射电镜观察了Cry1Ac超量表达工程菌伴孢晶体的形态发生以及不同芽孢发育时期的晶体形态变化。结果表明,该工程菌的伴孢晶体在细胞不对称分裂的隔膜形成前就已出现,而且晶体发生的部位与芽孢无关。但晶体在形成初期往往靠近母细胞膜。观察结果还表明,大量表达的晶体蛋白不能马上参与到晶体合成,晶体形成的最佳时期是芽孢皮层形成期。母细胞大量液泡的产生与消失可能与晶体形成有关。此外,在超量表达工程菌中,Cry1Ac蛋白能在一个细胞内形成多个伴孢晶体,这在天然菌株中是罕见的。     

紫外线使苏云金芽孢杆菌伴孢晶体失活机理的研究

用电镜、电泳、生物鉴定等方法,研究了紫外线对苏云金芽孢杆菌库斯塔克变种的伴孢晶体的影响。结果表明,紫外线能破坏伴孢晶体的表面结构和形态,降低伴孢晶体在碱性液和蚕胃液中的溶解度,5小时以上的长时间照射,能导致伴孢晶体完全不溶,因而不能降解为具有杀虫活性的毒素蛋白而失活。     

昆虫中肠液性质对苏云金芽孢杆菌伴孢晶体毒力的影响

综述了昆虫中肠液性质对苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis伴孢晶体毒力的影响。中肠液的酸碱度和蛋白酶是影响伴孢晶体溶解与原毒素活化的两大因素。中肠液的酸碱度不仅影响到伴孢晶体的溶解速度,还影响到各种蛋白酶的活性表现;而蛋白酶则直接参与了原毒素的活化,其组成与活性影响着原毒素的活化速度和杀虫专一性。因中肠液蛋白水解能力过高而导致原毒素的过度降解是某些昆虫对苏云金芽孢杆菌低度敏感的主要原因,而中肠液对原毒素活化能力的降低则与昆虫抗性的形成有关。此外,中肠液的沉淀作用及其它生理生化特性也影响着原毒素毒力的正常发挥。     

干燥温度对苏云金芽孢杆菌伴孢晶体的结构及杀虫活性的影响

用电镜、电泳、生物鉴定等方法,研究了干燥温度对苏云金芽孢杆菌库斯塔克变种苏云金芽孢杆菌库斯塔克变种（ＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎＦｉｅｎｓｉｓｖａｒ．Ｋｕｒｓｔａｋｉ）ＨＤ－１的伴孢晶体的结构及杀虫活性的影响。结果表明,０℃冷冻干燥的效果最好,对伴抱晶体的电泳图谱、形态、结构及杀虫活性均无影响;７５Ｃ以下干燥对伴孢晶体的形态和结构略有影响,但对电泳图谱和杀虫活性尚无影响,生产上可以采用。但在７５℃下超过５小时的长时间干燥,对晶体蛋白的空间结构和杀虫活性也有影响,因此,要适当控制干燥时间。８０     

苏云金芽孢杆菌蜡螟变种伴孢晶体蛋白基因的克隆及表达

用改进的碱解法分析基因供体菌苏云金芽孢杆菌蜡螟变种81-6(Bacillus thuringiensis var.galleriae 81-6)株有两种小质粒和一种大质粒。 将碱解法抽提到的质粒用Pstl完全酶解,与同样用PstI完全酶解的载体质粒pcAMPUC连接,以此重组质粒转化苏云金杆菌无晶体蛋白突变株 Bacillus thuringiensis var,kurstaki HD-1 Cry—B株的原生质体。用ELlSA法筛选到一株阳性转化菌落,分析了其质粒组成和插入片段的大小。毒性试验显示阳性转化子对昆虫幼虫有毒杀作用。     

杀鞘翅目苏云金芽孢杆菌新菌株及其杀虫剂的研究

从中国土壤中分离出2株杀鞘翅目昆虫的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis) YM03及SHQ11-10。YM03的血清型为H8a8b,SHQ1110的H血清型未知。二菌株皆产近菱形的薄扁伴孢晶体,分别含68～70kD和65kD的晶体蛋白质。毒力生物测定证明对柳蓝叶甲(Plagiodera versicolora)及马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)有高毒效。发酵性能良好。YM03粉剂田间防治马铃薯甲虫有高效。稀释400倍喷雾,防治效果达94.6%。     

抗生素类作为防腐剂对苏云金杆菌芽孢及伴胞晶体的影响

报道了14种抗生素作为防腐剂对苏云金杆菌CH菌株芽孢萌发的抑制作用和对伴胞晶体的影响。结果表明,红霉素,盐酸环丙沙星对CH菌株芽孢萌发有较强的抑制作用,在0.5μg/mL低剂量下可抑制芽孢的萌发;氧氟沙星和麦迪霉素抑制作用稍差,在5μg/mL的剂量下抑制作用随时间延长而减弱,96h后基本丧失抑制作用。其它几种抗生素对苏云金杆菌芽孢萌发的抑制终浓度均在30μg/mL以上;SDS-PAGE分析和生物测定表明,红霉素,盐酸环丙沙,氧氟沙星和麦迪霉素对伴胞晶体均无明显损伤作用。其中氧氟沙星45oC条件下放置4d,发酵液毒力保持率为96.2%。     

苏云金杆菌Z113菌株伴孢晶体特性及其杀虫活性

本文研究了苏云金芽孢杆菌Z113菌株在发酵过程中形成的伴孢晶体的形态及毒素蛋白的杀虫活性 ,并考察了该菌株的发育状况、OD值、pH值及不同发育时期毒素蛋白和杀虫活性的变化 ,确定了Z113菌株杀虫毒力与晶体蛋白之间的关系。     

苏云金杆菌伴孢晶体的溶解和降解作用对棉铃虫杀虫毒力的影响

SDS－PAGE的研究结果表明Bt原毒素的酶解速率大于晶体,即晶体蛋白溶解后更易于被棉铃虫中肠蛋白酶所降解。与棉铃虫中肠液、牛胰蛋白酶和牛胰凝乳蛋白酶在30℃孵育17h,随着缓冲液PH值由6．9增至10．5,晶体的降解程度也随之加重。在PH为10．5时,晶体蛋白完全降解,产生的活力片段分子量分别为60．5±1．26Kd,61．6±1,16Kd,61．7±2．0Kd。生物测定结果显示,晶体蛋白在碱性缓冲液中孵育后,可提高其对棉铃虫的杀虫毒力,而酶解作用对毒力影响不大。人工饲料的PH值直接影响伴孢晶体对棉铃虫的杀虫毒力。以pH为8．0的0．01mol·L-1Tris－HCl缓冲液及pH为10．0的0．01mol．L-1glycine－NaOH缓冲液配制饲料,晶体的毒力显著增高。     

农药助剂对苏云金杆菌毒力的影响及新液剂研制

研究了２０种化学物质对苏云金杆菌的毒力影响,分析了由乳化剂、湿润剂、防腐剂配制的几种不同农药助剂组合与该菌芽孢晶体混合物在不同贮存期的毒力变化及芽孢存活率。从供试的助剂组合中获得了一种最佳组合,其各项指标均优于中华人民共和国农业行业标准中所规定的各项要求,可发展成一种新的苏云金芽孢杆菌液剂。     

苏芸金杆菌广谱杀虫Tm13－14菌株晶体毒素及毒力特性

以新筛选的对鞘翅目、鳞翅目、双翅目均具毒性的Ｂ．ｔ．Ｔｍ１３－１４菌株为材料,用ＨＤ－１、３３７０－１为参考菌株,比较了伴孢晶体蛋白的多肽组成,以及经三种昆虫肠道酶降解产生的抗酶多肽组分。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明：Ｔｍ１３－１４晶体蛋白含１３８ｋＤ、１３２ｋＤ主要成分和６５ｋＤ次要成分。其晶体分别由三种昆虫肠道酶消化产生绚毒性多肽,经生物测定,杀家蚕的毒性成分为６８．５ｋＤ、５９ｋＤ多肽;杀斜纹夜蛾毒性成分为７１ｋＤ,６７ｋＤ和５９．６ｋＤ多肽杀马铃薯瓢虫毒性成分为６９ｋＤ、６５ｋＤ多肽。它与ＨＤ－１、３３７０－１晶体均有明显差异。     

苏云金芽孢杆菌发酵上清中增效物质生成的相关研究

利用BIOSTAT ^?-CL1 5L全自动发酵罐和 2 0t不锈钢发酵罐 ,对苏云金芽孢杆菌不同菌株 (GC-91 ,MP342 ,HD-1 )发酵上清液中增效物质的生成进行了研究 ,发现增效物质于对数生长期前期开始产生并积累 ,至对数生长期末期达到高峰 ,并保持稳定 ;不同菌株的发酵上清中增效物质生成量不同 ,其中GC-91最强 (增效倍数f=6.0 ) ,MP342次之 (f=3.7) ,HD 1最弱 (f=1.5 ) ;GC-91菌株上清液中增效物质生成曲线与晶体含量 ,效价代     

中国苏云金芽孢杆菌的分布与cry基因的多样性

采集全中国27个省、自治区及4个直辖市昆虫孳生地粉尘、土壤等样品1080份,在其中的406份中分离到苏云金芽孢杆菌965株.镜检可观察到大菱形、小菱形、方形、长方形、圆形、椭圆形、镶嵌形和不规则形等8种主要形态的伴孢晶体;采用cryⅠ、cryⅡ、cryⅢ、cryⅣ和cryⅤ基因的通用引物对221株Bt分离株进行的PCR检测结果表明各类基因的含量依次为cryⅠ＞cryⅡ＞cryⅤ＞cryⅢ基因,分别占被检菌株的75.6%、67.9%、58.4%和14.5%,没有检测到cryⅣ基因,共得到10种基因组合类型.对其中含有cryⅠ基因的菌株分别以cryIAc、cryIC和cryIE基因的特异性引物进行PCR检测,得到20株同时含有cryIAc、cryIC、cryⅡ和cryⅤ优良基因组合的Bt分离株,其中菌株Bt-15A3对棉铃虫、甜菜夜蛾及小菜蛾均表现出高毒力,具有生产开发潜力.     

我国森林土壤中苏云金芽孢杆菌生态分布的研究

从我国8个森林立地带(寒温带、中温带、暖温带、北亚热带、中亚热带、南亚热带、高原亚热带、热带)所属的13个自然保护区,采集了0—5cm土层林下土壤样品384个.测定了土壤pH、水分和养分.从中分离观察芽孢杆菌菌落1873个,分离出苏云金芽孢杆菌79株,并对其所属亚种进行了初步鉴定.其平均出土率和分离率分别为14.32%和4.21%.研究了芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌在森林土壤中生态分布的规律及苏云金芽孢杆菌对6种昆虫的室内毒力测定,从中筛选出不少的高效菌株.为研究苏云金芽孢杆菌在我国森林生态系中资源的保护、开发和利用,具有重要意义.     

苏芸金杆菌高毒力菌株筛选方法研究

通过对36株苏芸金杆菌(Bacillus thuringiensis)菌株孢晶混合物的蛋白图谱和其对小菜蛾(Plutella xylostella)。致倦库蚊(culex pipens)二十八星瓢虫(Epjlachna vigintioctopunctata)三种昆虫幼虫的致死率研究,我们建立了一套快速高效的苏芸金杆菌内毒素高毒力菌株筛选程序。该程序是将蛋白电泳方法引入苏芸金杆菌菌株筛选,经过一个简单的苏芸金杆菌孢品混合物的蛋白电泳后,可以迅速辩别出对所有试虫毒力均很低的菌株,这一类菌株在苏芸金杆菌分离物中的比例可高达80％以上。除此之外,根据电泳的结果还可以预测该菌株大概的宿主范围和发现新的杀虫晶体蛋白类型。运用该方法,可以大大提高苏芸金杆菌菌株筛选的效率并降低筛选所需的费用。