家蚕微孢子虫感染对家蚕BmN细胞凋亡以及凋亡蛋白抑制因子IAPs表达的影响

【目的】在无任何外界凋亡因素诱导条件下,探究家蚕微孢子虫感染对家蚕卵巢细胞-BmN凋亡的影响,以及凋亡蛋白抑制因子IAPs实相表达的变化情况。【方法】显微镜下观察家蚕微孢子虫感染BmN细胞后不同时间段宿主细胞的变化情况,以及利用荧光定量PCR方法检测家蚕促凋亡基因——细胞色素C(BmCyt c)表达水平的变化,随后检索家蚕基因组与蛋白质家族数据库搜寻家蚕凋亡蛋白抑制因子IAPs基因信息,并通过荧光定量PCR方法对这些基因的实相表达情况进行定量分析。【结果】家蚕微孢子虫感染BmN细胞的前5 d,细胞状态未见明显变化。感染后7 d,BmN细胞的生长受到了一定程度的影响。第12天时,对照组中几乎所有细胞出现空泡化或细胞死亡的现象,而感染家蚕微孢子虫的BmN细胞未见空泡的出现,并且大量细胞形态完整,细胞核清晰可见。同时,BmCyt c基因的表达几乎一直处于被抑制状态,特别是感染后的第10天与第12天,该基因的表达量显著性降低(P0.01)。通过数据库检索共得到4个家蚕凋亡蛋白抑制因子:BmIAP-1、BmIAP-2、BmSurvivin-1与BmSurvivin-2。荧光定量PCR结果表明:BmIAP-1和BmSurvivin-1基因在感染后期(10 d与12 d)表达量有上升趋势,尤其是感染后的12 d,表达量显著上升(P0.01)。然而,BmIAP-2与BmSurvivin-2基因的表达在大多数时间段均处于下调状态。【结论】当无任何外界凋亡因素诱导条件下,家蚕微孢子虫感染BmN细胞后可影响宿主细胞的生长,并可抑制细胞的正常生理凋亡。依据荧光定量PCR结果,我们推测在家蚕微孢子虫感染BmN细胞时,BmIAP-1和BmSurvivin-1蛋白可能在调节细胞凋亡的过程中起一定作用。     

家蚕质型多角体病毒荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank报道的家蚕质型多角体蛋白基因的保守序列设计特异性引物扩增118bp核苷酸片段,使用含有目的基因片段的重组质粒标准品绘制标准曲线,建立家蚕质型多角体病毒的实时荧光定量PCR检测方法。结果表明,标准曲线中模板拷贝数(X)与Ct值(Y)关系为Y=-3.582lgX+38.748,相关系数R2=0.999,构建的实时荧光定量PCR检测方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,可用于家蚕质型多角体病毒病的快速检验及该病的流行性调查研究。     

古DNA实时荧光定量PCR实验中标准品的制备

实时荧光定量PCR技术通过对PCR每一循环扩增产物的实时检测,可对模板的精确拷贝数进行绝对定量,从而用于古DNA实验中提取和扩增条件的比较和优化.本研究采用异硫氰酸胍碱裂解-SiO2吸附的方法,从采自黑龙江省的晚更新世斑鬣狗化石材料中提取得到了斑鬣狗线粒体基因组古DNA.经常规PCR扩增后,将纯化的扩增产物克隆到微生物体内使其大量复制,再用M13通用引物扩增出含少量外源DNA的古DNA目标片段,从而建立了适用于古DNA荧光定量PCR扩增的标准品的制备方法.经检测分析,运用该方法制备的标准品性质稳定,能够准确地指示反应体系中较为精确的古DNA模板拷贝数,从而反映古DNA的提取和扩增效率,用于比较并优化古DNA提取和扩增条件.     

实时荧光定量PCR的数据分析方法

实时荧光定量PCR是目前检测目的核酸拷贝数及分析靶基因在mRNA表达水平相对变化的主流技术。研究表明,分析结果的准确性依赖于数据分析方法的可靠性。我们简要综述实时荧光定量PCR的数据分析方法。     

定量PCR的荧光技术

荧光定量PCR是在普通PCR基础上,利用荧光技术对核酸进行绝对定量的一项新兴技术,其灵敏度高、特异性高、操作简便和定量准确,已被广泛应用于临床和科研中。为更好地发挥荧光定量PCR的优点,荧光技术领域的研发工作十分活跃。     

木糖葡萄球菌实时荧光定量PCR检测方法的建立及其应用

目的 本研究拟建立一种灵敏快速的实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR, qPCR)方法,用于检测大、小鼠木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus,S.xylosus)。方法 本研究选择特异性gehM基因片段作为靶标合成了一套引物,建立了木糖葡萄球菌检测的qPCR方法。对木糖葡萄球菌标准菌株和其他非目标菌进行特异性分析。将木糖葡萄球菌的DNA进行10倍稀释测定其灵敏度。用送检的样本进行了临床应用并测序验证,同时与培养法进行比较。结果 仅木糖葡萄球菌出现特异性扩增曲线,而其他非目标菌未出现,表明设计的引物对木糖葡萄球菌具有特异性,灵敏度为100 fg/μL,组内和组间重复性均小于3%。共检测60份临床样品,有5份样品扩增曲线为典型的S曲线,将该qPCR产物克隆测序并进行同源性比对,该序列与木糖葡萄球菌的同源性为99.63%,表明该样本木糖葡萄球菌核酸阳性,所检测样本阳性率为8.3%,而培养法的阳性率为6.7%,qPCR方法阳性检出率比培养法略高。结论 建立的木糖葡萄球菌qPCR方法,具有快速、灵敏度高、特异性强和重复性好的优点,可用于实...     

荧光定量PCR检测土拨鼠肝炎病毒核酸方法的建立

目的建立土拨鼠肝炎病毒（woodchuck hepatitis virus,WHV）核酸的荧光定量PCR（Real-time PCR）检测方法,应用于土拨鼠肝炎病毒模型的研究。方法分别根据土拨鼠肝炎病毒核心抗原（WHcAg）和表面抗原（WHsAg）的DNA序列设计13对扩增引物,从中筛选无非特异性扩增及引物二聚体且灵敏度高的引物,用于土拨鼠血清中WHV DNA的Real-time PCR检测。建立感染土拨鼠肝炎病毒的土拨鼠血清中WHV核酸的Real-timePCR检测方法。结果根据WHsAg基因的5＇端设计的一对引物WHVSF1与WHVSR1,检测灵敏度可达1×101拷贝/μL,病毒拷贝数与Real-time PCR Ct值的标准曲线的R2值为0.997,且电泳未见明显非特异性条带及引物二聚体。结论建立了土拨鼠血清中WHV DNA的Real-time PCR检测方法,该方法为进一步研究土拨鼠肝炎病毒模型奠定了基础。     

实时荧光定量PCR方法快速检测转基因大豆

针对转基因大豆中普遍含有的35S启动子进行引物设计,以双链DNA染料SYBR GreenⅠ为荧光标记物,利用实时荧光定量PCR方法对大豆样品进行检测。该法检测转基因大豆的检测低限为0.005 nmol/L的35S启动子,线性范围达3个数量级,可快速区分转基因大豆和非转基因大豆,具有快速、简便、灵敏、安全、高通量、低成本等优点,可推广用于转基因植物产品的快速定量检测。     

实时荧光定量PCR相对定量法检测循环miRNA的内参选择

microRNA(miRNA)是一类内源性非编码微小RNA,在调控细胞增殖、分化、凋亡等方面发挥重要作用。研究发现,miRNA能够稳定存在于细胞外液,被称为循环miRNA。在多种疾病状态下循环miRNA表达谱改变,具有成为非创伤性新型生物标志物的潜能。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)是检测miRNA表达变化的确证实验,其中内参的选择关系到相对定量结果是否真实可靠。我们简要综述国内外实验室常用的RT-qPCR内参及其特点。     

不同DNA提取法对腺病毒和细小病毒PCR检测效果评估

分别利用硫氰酸胍(Guanidine thiocyanate,GuScN)抽提法、螯合树脂处理法和蛋白酶K-酚/氯仿抽提法从粪便样品中制备腺病毒DNA(dsDNA)或细小病毒DNA(ssDNA)然后进行PCR检测。结果显示硫氰酸胍抽提法、螯合树脂处理法能有效地去除粪便中影响PCR扩增的抑制物,提高PCR检测的敏感性,而传统蛋白酶K-酚/氯仿抽提法不能有效地去除PCR扩增的抑制物,影响PCR检测结果。在检测粪便中腺病毒时,硫氰酸胍、螯合树脂和蛋白酶-酚/氯仿抽提法分别允许检测5TCID_{50相似文献}   

线粒体型蛋白frataxin在家蚕微孢子虫中的鉴定与分析

[目的]Frataxin是铁硫簇相关蛋白,在线粒体代谢中起着重要作用.分析家蚕微孢子中该蛋白的结构特征,系统进化关系以及在孢子体内的转录翻译活性.[方法]基于家蚕微孢子全基因组序列,同源序列搜索获得该基因序列.进行蛋白二级结构比较,近缘物种共线性特征分析及系统进化树构建.此外构建pGEX-4T-1-Nbfra原核重组表达载体,转化E coli BL21(DE3)进行目的蛋白表达纯化,以此为抗原免疫小鼠,制备抗体,并与家蚕微孢子总蛋白进行Western免疫杂交.[结果]Nbfra蛋白缺乏进入线粒体的信号序列,功能区缺乏部分α-螺旋;frataxin基因在不同微孢子基因组中的分布具有共线性特征,表明其在基因组进化中非常保守.系统进化分析显示微孢子形成独立进化支,并且与高等真核生物近缘,说明微孢子在进化地位上比其它原虫更加高等,支持了微孢子虫是真菌的姊妹枝的进化地位假说.[结论]免疫杂交结果表明Nbfra基因家蚕微孢子虫中能正常表达与翻译.本研究为微孢子的分类地位及线体假说提供了重要的补充依据.     

不同消毒方法对家蚕微粒子的存活和侵染力影响

家蚕微粒子病是家蚕Bombyx mori的重要病害,探索其消毒杀灭方法对蚕业生产具有重要意义。本研究采用微粒子染色法和添食家蚕侵染法测试了温度、紫外线和消毒剂处理108个/mL家蚕微粒子后对家蚕微粒子的消杀作用,结果表明：温度对家蚕微粒子虫灭活温度为60℃处理30 min以上;使用20 wx功率紫外灯距离50 cm照射12 min及以上时,微粒子死亡率为47.70%,对家蚕侵染率为0;三氯异氰脲酸800 mg/L及以上浓度处理6 min以上家蚕微粒子死亡率为100%,对家蚕的侵染率为0;戊二醛癸甲溴铵200 mg/L及以上浓度处理6 min以上家蚕微粒子死亡率为100%,对家蚕的侵染率为0。3种消毒方法中温度法主要用于小型蚕具消杀微粒子;紫外线用于蚕业辅助设施的表面微粒子的消杀;三氯异氰脲酸和戊二醛癸甲溴铵均表现出较好的消杀效果,其中戊二醛癸甲溴铵较含氯的消毒剂三氯异氰脲酸稳定性强,刺激性小,对养蚕的金属腐蚀性小,可作为含氯消毒剂的部分替代使用。本研究结果可为蚕业生产中消杀微粒子提供参考。     

家蚕微孢子虫中小RNAs的全基因组鉴定与分析

【目的】家蚕Bombyx mori微粒子病是蚕业生产上的毁灭性病害,家蚕微孢子虫Nosema bombycis是该病的病原,可经卵垂直传播和经口水平传播。为了探索家蚕微孢子虫中对重复元件的抵御以及对基因转录调控的潜在方式,本研究拟在基因组水平上对该物种的小RNAs进行全面系统的分析,鉴定与转座子相关的小RNAs和潜在的miRNAs。【方法】从感染家蚕微孢子虫的家蚕中肠中提取总RNA,分离小片段RNA并反转录后,进行Solexa高通量测序。通过生物信息学方法对小RNAs进行分类及功能注释,鉴定起源于家蚕微孢子虫不同类型转座子的小RNAs,并对潜在的miRNA进行预测分析。【结果】家蚕微孢子虫小RNAs的长度主要是24和25 nt,其中大部分序列表现出5′末端的尿嘧啶偏好性。家蚕微孢子虫中存在丰富的与转座子相关联的小RNAs,并且与转座子标准序列匹配的反义小RNAs明显多于正义小RNAs。同时,鉴定获得了31个候选miRNAs,部分为Nosema属的其他孢子虫中所共有,暗示其在微孢子虫基因组进化上具有保守性。【结论】首次鉴定到家蚕微孢子虫的转座子相关性小RNAs,暗示小RNAs在家蚕微孢子虫基因组对转座子防御过程中起到作用,31个潜在的miRNAs为家蚕微孢子虫miRNAs的功能验证提供了后续靶标。     

家蚕微孢子虫在家蚕胚胎细胞系BmE-SWU1中的极丝弹出情况

本文借助扫描电镜(Scanning Electron Microscope,SEM)对在家蚕胚胎细胞(Bombyx mori-SWU1Embryoniccell line,BmE-SWU1)中增殖的家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)进行了观察;同时,利用间接免疫荧光试验(Indirect Immunofluorescence Test,IFAT)对家蚕微孢子虫极丝弹出情况进行了研究。结果发现:在家蚕微孢子虫体外培养体系中观察到了二型孢子、发芽后的孢子空壳以及未成熟孢子等;此外,在接种后10d的细胞爬片中,发现了大量孢子弹出极丝的情况,其极丝的长度在58μm-120μm之间,其中100μm以上的居多,且其极丝的扭曲程度、方向性、粗细也大都不同。本研究表明了微孢子虫在培养细胞体系中自动发芽可以以长极丝孢子的形式来完成。     

A complete Sec61 complex in Nosema bombycis and its comparative genomics analyses

We characterized a complete Sec61 complex in Nosema bombycis, which has been shown to consist of Sec61alpha, Sec61beta, and Sec61gamma genes. Comparing the genomic regions that harbor the respective subunit genes between N. bombycis, Encephalitozoon cuniculi, and Antonospora locustae, we found that microsporidian genomes have high degree of synteny in short genomic fragment, and that this gene synteny in general might exist throughout microsporidian genomes.     

Calcofluor White M2R荧光染色法识别家蚕微孢子虫

本研究探讨应用荧光染色试剂Calcofluor White M2R染色鉴别家蚕微孢子虫Nosema bombycis。结果表明：在荧光显微镜下可见家蚕微孢子虫孢子被染上强烈的青蓝色荧光, 而寄主组织碎片、病毒、细菌等不被染色。该法是一种快速有效鉴别微孢子虫的方法。     

Action of carbendazim on the development of Nosema bombycis Naegeli in silkworm Bombyx mori L.

Abstract:  Carbendazim, a benzimidazole compound is effective in curing pebrine disease in silkworm, Bombyx mori , caused by Nosema bombycis , if treatment is given within 48 h post-infection or before the parasite establishes itself in the host tissue. Ultrastructural evidence of the action of carbendazim showed an adverse effect of the drug on both merogonic and sporogonic stages of the parasite in the midgut and silk gland of the silkworm. The drug caused elongation, vacuolation and depletion of cytoplasmic contents of the meront, sporont, sporoblast and spore stages of N. bombycis .     

Evaluation of rapid DNA extraction methods for the quantitative detection of fungi using real-time PCR analysis

Three comparatively rapid methods for the extraction of DNA from fungal conidia and yeast cells in environmental (air, water and dust) samples were evaluated for use in real-time PCR (TaqMan™) analyses. A simple bead milling method was developed to provide sensitive, accurate and precise quantification of target organisms in air and water (tap and surface) samples. However, quantitative analysis of dust samples required further purification of the extracted DNA by a streamlined silica adsorption procedure.