斜纹夜蛾普通气味结合蛋白GOBP1基因的表达定位分析

气味调控斜纹夜蛾Spodoptera litura（鳞翅目,夜蛾科）的交配和产卵行为,而嗅觉气味结合蛋白（OBP）是昆虫与外界环境进行化学信息交流中的一种重要蛋白。本研究基于已报道的斜纹夜蛾普通气味结合蛋白GOBP1基因cDNA序列（GenBank登录号为EF159978）设计引物,通过RT-PCR法分析了GOBP1 mRNA的组织特异性表达情况,并对GOBP1基因条带进行了克隆、测序和Blast比对。此外,再通过RNA原位杂交的方法进一步分析了GOBP1 mRNA在触角中的表达定位。结果表明:GOBP1只在斜纹夜蛾的触角组织中表达,而且GOBP1转录本较多分布于靠近嗅觉感受器即触角边缘部位。这些结果进一步说明GOBP1是斜纹夜蛾嗅觉过程中的重要蛋白,同时为深入研究GOBP1与其他蛋白的相互空间定位关系、GOBP1的功能等奠定了基础。     

二点委夜蛾非典型嗅觉受体AlepOrco的基因克隆、原核表达及多克隆抗体制备

【目的】非典型嗅觉受体(olfactory receptor co-receptor, Orco)与典型嗅觉受体共同形成离子通道,在昆虫嗅觉识别中具有至关重要的作用。本研究旨在克隆和表达二点委夜蛾Athetis lepigone Orco基因,明确其分子特性,为进一步研究该基因在二点委夜蛾中的功能奠定基础。【方法】将二点委夜蛾雌雄成虫触角转录组数据建立本地数据库,通过生物信息学分析获得二点委夜蛾Orco同源基因AlepOrco;利用RT-PCR方法克隆二点委夜蛾AlepOrco基因全长,并在pGEX-6P-1/BL21(DE3)系统中进行了该基因开放阅读框(ORF)的原核表达,制备多克隆抗体,用Western blot检测抗体特异性;利用qPCR技术检测该基因在二点委夜蛾雌雄成虫不同组织(喙、触角、去除触角和喙的头、胸、腹、足和翅)中的表达谱。【结果】获得了二点委夜蛾AlepOrco的cDNA(GenBank登录号:MN583125)全长序列,开放阅读框长1 422 bp,编码473个氨基酸,序列中有7个跨膜结构区,预测等电点为8.59,分子量为53.40 kD。SDS-PAGE和Western blot分析结果表明AlepOrco能够在大肠杆菌Escherichia coli中高效表达。利用制备的多克隆抗体对二点委夜蛾AlepOrco进行Western blot检测,其能够特异识别成虫触角中AlepOrco蛋白。qPCR结果表明,AlepOrco在二点委夜蛾雌雄成虫不同组织间具有相似的表达模式,都是在触角中的相对表达量最大,在翅中的表达量最小。【结论】克隆并原核表达了二点委夜蛾非典型嗅觉受体基因AlepOrco,制备的多克隆抗体能够特异识别二点委夜蛾成虫触角中的AlepOrco。结果为深入了解二点委夜蛾AlepOrco基因的结构和功能奠定了基础。     

斜纹夜蛾信息素结合蛋白SlitPBP4的分子克隆、组织表达谱及结合特性分析

【目的】鉴定斜纹夜蛾Spodoptera litura新的信息素结合蛋白(pheromone binding protein,PBP)基因,明确其在斜纹夜蛾不同组织中的表达水平并探讨其功能。【方法】基于已报道的烟草天蛾Manduca sexta、家蚕Bombyx mori、君主斑蝶Danaus plexippus和庆网蛱蝶Melitaea cinxia 4种非夜蛾科昆虫PBP4同源基因的序列特点及与其他PBP基因在染色体上的相邻关系,通过分析实验室先前克隆到的斜纹夜蛾PBP/GOBP基因序列,克隆斜纹夜蛾PBP4同源基因;通过RT-PCR和q PCR技术测定该基因在斜纹夜蛾雌雄成虫不同组织中的表达水平;利用体外表达和荧光竞争性结合实验测定斜纹夜蛾PBP4蛋白对性信息素组分和植物气味物质的结合能力。【结果】在夜蛾科昆虫斜纹夜蛾中鉴定到首个PBP4基因,命名为Slit PBP4(Gen Bank登录号:MG356847),c DNA编码210个氨基酸,具有N末端信号肽、疏水性气味分子结合域及6个保守半胱氨酸等PBP的典型序列特征,其基因组DNA在保守位置也含有2个内含子;但和已报道的斜纹夜蛾3个PBP相比,PBP4的C末端明显较长。Slit PBP4在雄成虫腹部(生殖系统)极高表达,在雌雄成虫触角及其他组织中仅微弱表达或不表达。荧光竞争性结合实验结果表明,Slit PBP4蛋白与被测定的信息素组分及植物气味物质均没有明显结合能力。【结论】报道了夜蛾科昆虫的首个PBP4基因,该基因可能主要参与雄虫生殖相关的生理过程而非嗅觉功能。     

草地贪夜蛾与斜纹夜蛾嗅觉味觉相关基因的比较分析

草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda,近期侵入中国并迅速扩张。与其近缘物种斜纹夜蛾Spodoptera litura不同,草地贪夜蛾主要偏好玉米、水稻、小麦等禾本科农作物,暴食危害重。此外两种害虫在交配、产卵频率等繁殖特征上也存在差异。这些差异可能与嗅觉、味觉相关蛋白的分歧密切相关。本研究对两种夜蛾科害虫的嗅觉、味觉相关基因进行了系统的鉴定及系统发育分析,并对部分嗅觉结合蛋白进行了选择信号与氨基酸差异位点分析。分别在草地贪夜蛾中鉴定到261个嗅觉相关基因,数目明显大于斜纹夜蛾(179个);鉴定到233个味觉相关基因,数目略大于斜纹夜蛾(217个)。嗅觉相关基因中气味结合蛋白(OBP)基因数目差异最为明显。系统发育分析显示该基因存在夜蛾科特异的分支,且该分支中草地贪夜蛾中基因数目远高于斜纹夜蛾;发现位于I类触角结合蛋白(ABPI)分支的一类OBP成员在草地贪夜蛾中拷贝数增加,其中两个基因拷贝受到正选择,且在草地贪夜蛾中特有的氨基酸替换还可能影响蛋白质功能。本研究为草地贪夜蛾食性特征的遗传机制解析提供线索,为草地贪夜蛾的生物防治提供参考依据和基因素材。     

疆夜蛾Plus-C气味结合蛋白PsauOBP7的组织表达谱及配体结合特性分析

【目的】明确疆夜蛾Peridroma saucia Plus-C气味结合蛋白PsauOBP7在不同化学感受器官中的表达谱，解析PsauOBP7重组蛋白的气味结合特异性。【方法】通过qRT-PCR检测PsauOBP7在疆夜蛾雌蛾和雄蛾的触角、口器、足和翅中的表达谱。原核表达并纯化PsauOBP7重组蛋白，利用Western blot检测PsauOBP7在疆夜蛾不同龄期幼虫头部及成虫不同组织中的表达情况；通过荧光竞争结合实验检测PsauOBP7重组蛋白对39种气味化合物的结合能力。【结果】成功表达并纯化PsauOBP7重组蛋白。qRT-PCR及Western blot检测显示PsauOBP7表达于4-6龄幼虫头部及雌雄成虫的触角、口器、足和翅中。荧光竞争结合实验显示PsauOBP7与反-2-己烯醛的结合能力最强，Ki=1.4 μmol/L。此外，PsauOBP7与5种酯类化合物乙酸月桂酯、顺-3-己烯乙酸酯、乙酸苯乙酯、苯甲酸己酯和肉桂酸甲酯有一定的结合能力，Ki值分别为5.7, 6.5, 8.9, 9.5和10.2 μmol/L。PsauOBP7与两种醇类化合物顺-3-己烯-1-醇和法尼醇也有较强的结合能力, Ki值分别为5.8和5.9 μmol/L。【结论】疆夜蛾Plus-C气味结合蛋白PsauOBP7表达于其幼虫和成虫的多种化学感受器官中，且能结合多种植物气味化合物，说明其在疆夜蛾寻找寄主植物过程中发挥重要作用。     

疆夜蛾Plus-C气味结合蛋白PsauOBP7的组织表达谱及配体结合特性分析

【目的】明确疆夜蛾Peridroma saucia Plus-C气味结合蛋白PsauOBP7在不同化学感受器官中的表达谱,解析PsauOBP7重组蛋白的气味结合特异性。【方法】通过qRT-PCR检测PsauOBP7在疆夜蛾雌蛾和雄蛾的触角、口器、足和翅中的表达谱。原核表达并纯化PsauOBP7重组蛋白,利用Western blot检测PsauOBP7在疆夜蛾不同龄期幼虫头部及成虫不同组织中的表达情况;通过荧光竞争结合实验检测PsauOBP7重组蛋白对39种气味化合物的结合能力。【结果】成功表达并纯化PsauOBP7重组蛋白。qRT-PCR及Western blot检测显示PsauOBP7表达于4-6龄幼虫头部及雌雄成虫的触角、口器、足和翅中。荧光竞争结合实验显示PsauOBP7与反-2-己烯醛的结合能力最强,K_i=1.4μmol/L。此外,PsauOBP7与5种酯类化合物乙酸月桂酯、顺-3-己烯乙酸酯、乙酸苯乙酯、苯甲酸己酯和肉桂酸甲酯有一定的结合能力,K_i值分别为5.7, 6.5, 8.9, 9.5和10.2μmol/L。PsauOBP7与两种醇类化合物顺-3-己烯-1-醇和法尼醇也有较强的结合能力, K_i值分别为5.8和5.9μmol/L。【结论】疆夜蛾Plus-C气味结合蛋白PsauOBP7表达于其幼虫和成虫的多种化学感受器官中,且能结合多种植物气味化合物,说明其在疆夜蛾寻找寄主植物过程中发挥重要作用。     

苦瓜素Ⅰ对斜纹夜蛾几丁质酶基因(SlCht)和几丁质合成酶基因(SlCHS-A)表达及其生长发育的影响

【目的】几丁质酶和几丁质合成酶对昆虫的变态发育极其重要。本研究旨在阐明苦瓜素Ⅰ对斜纹夜蛾Spodoptera litura几丁质酶和几丁质合成酶基因表达及其生长发育的影响。【方法】利用RT-qPCR检测斜纹夜蛾几丁质酶基因(SlCht)和几丁质合成酶基因(SlCHS-A)在斜纹夜蛾不同发育阶段(卵、幼虫、预蛹、蛹和成虫)和4-6龄幼虫不同组织(体壁、中肠、脂肪体、血细胞、头部和马氏管)中的表达水平以及注射苦瓜素Ⅰ溶液(4 μg/头) 24, 48和72 h时斜纹夜蛾SlCht和SlCHS-A在6龄幼虫各组织中的表达水平。分析在斜纹夜蛾4龄幼虫中注射不同浓度(31.25, 62.5, 125, 250和500 ng/头)的苦瓜素Ⅰ溶液对幼虫和蛹历期、幼虫增重、蛹重、蛹长度、化蛹率、羽化率和存活率的影响,并利用体视显微镜观察斜纹夜蛾幼虫的表型变化。【结果】SlCht和SlCHS-A在斜纹夜蛾中的表达具有发育阶段特异性。SlCht和SlCHS-A在卵期表达量最高,幼虫期和预蛹期的表达量较低;在各幼虫期又表现为6龄幼虫期表达量最高,在其他龄期的表达量低。SlCht和SlCHS-A在斜纹夜蛾6龄幼虫中也显示出组织特异性表达,在血细胞和体壁中高表达,在头部、中肠和脂肪体中低表达。在斜纹夜蛾6龄幼虫中注射苦瓜素Ⅰ能诱导SlCht和SlCHS-A在其各组织中表达量降低;在4龄幼虫中注射苦瓜素Ⅰ后,斜纹夜蛾的生长发育受到抑制,幼虫增重延缓,发育历期延长,化蛹率下降甚至化蛹失败,幼虫及蛹出现较高的畸形率。【结论】苦瓜素Ⅰ可通过诱导SlCht和SlCHS-A表达量的降低来实现对斜纹夜蛾生长发育的抑制作用。本研究为进一步阐明苦瓜素对斜纹夜蛾生长发育的抑制机制提供了新的理论基础,并为进一步应用苦瓜素Ⅰ进行防控奠定了基础。     

茶谷蛾触角气味结合蛋白基因分析

茶谷蛾(Agriophara rhombata Meyr.)触角上表达的嗅觉相关基因是其交配、寻找食物来源、寻找产卵地、避免有害化合物等行为的重要分子基础。为了研究茶谷蛾触角的嗅觉机制,分析了雌雄蛾触角功能差异,并筛选触角气味结合蛋白基因,本研究采用转录组测序和实时定量PCR技术,对茶谷蛾雌、雄蛾触角的基因表达情况进行了分析,共注释到37 666个基因,其中雌、雄蛾共有的表达基因数目为34 720个,雌蛾特有表达基因有1 739个,雄蛾特有表达基因有1 207个。在雌、雄蛾触角中共鉴定到170个化学感受相关基因,包括33个气味结合蛋白基因(odorant binding protein genes,OBPs), 42个味觉受体基因(gustatory receptor genes,GRs), 12个化学感受蛋白基因(chemosensory protein genes,CSPs), 52个嗅觉受体基因(olfactory receptor genes,ORs), 27个离子型受体基因(ionotropic receptor genes,IRs), 4个感觉神经元膜蛋白基因(sensor...     

斜纹夜蛾触角叶神经元及其对植物气味和性信息素的反应

【目的】探索斜纹夜蛾Spodoptera litura触角叶结构及其神经元对植物气味和性信息素的神经识别机制。【方法】利用共聚焦激光技术扫描斜纹夜蛾成虫触角叶结构,同时采用多通道电生理技术(multi-unit recording,MR)记录斜纹夜蛾触角叶对6种寄主植物气味化合物(苯甲醛、苯甲醇、苯乙醛、水杨醛、乙酸叶醇酯和己烯醛)及性信息素顺9反11十四碳二烯乙酸酯和顺9反12十四碳二烯乙酸酯的反应;并在风洞中测定分析斜纹夜蛾对上述化合物的定向行为反应。【结果】共聚焦激光扫描结果显示,雄性和雌性斜纹夜蛾触角叶内分别密集地分布有67和66个神经纤维球;而雌性斜纹夜蛾触角叶内的纤维球总体积和平均体积都高于雄性。负责识别和追踪性信息素的扩大型纤维球复合体(macroglomerular complex,MGC)只在雄性斜纹夜蛾触角叶内发现。MR试验结果显示斜纹夜蛾触角叶内神经元具有3种自发放电模式:稀疏放电(不规则的放电频率)、温和放电(宽而慢的放电频率)和密集放电(暴发性的放电频率)。同时,斜纹夜蛾触角叶神经元对所有刺激的气味表现出3种反应类型:兴奋性、抑制性和无反应。神经元对气味的兴奋性和抑制性反应以及无反应取决于刺激化合物的结构和浓度。雌虫的触角叶神经元对性信息素和单一的植物气味表现出很小的反应,而雄虫对两种性信息素以及苯甲醛、苯甲醇、苯乙醛和水杨醛具有很强的兴奋性反应。斜纹夜蛾风洞试验也显示绝大部分的斜纹夜蛾雄虫都选择停留在性信息素和芳香族化合物上,这与MR的结果一致。【结论】神经元的反应强度和刺激化合物浓度之间的关系根据不同的神经元和刺激化合物而有所不同。在测试的浓度范围内,雄虫触角叶神经元对性信息素的反应强度随着浓度的增加而加强,但是除乙酸叶醇酯外,对其他植物气味的反应强度在测试的浓度范围内没有显著的变化。     

棉铃虫嗅觉受体基因的克隆及组织特异性表达

昆虫嗅觉受体是一个高度变异的蛋白家族,但是其中一类嗅觉受体很特殊,它们在不同昆虫体内高度保守。该文作者从棉铃虫Helicoverpa armigera体内克隆得到了这类受体基因,命名为ORHarm。ORHarm编码473个氨基酸残基,序列中有7个跨膜区,是典型的G蛋白偶联的受体。ORHarm与已经报道的昆虫同类嗅觉受体的同源性在60％以上,与近缘种烟芽夜蛾Heliothis virescens嗅觉受体的同源性高达99.4％。半定量RT-PCR研究表明,ORHarm主要在棉铃虫成虫触角中表达,在喙中也有表达,但表达量较低,在成虫其他的部位不表达;在棉铃虫发育的各个时期,如卵、幼虫、蛹和成虫体内,也都有表达。ORHarm不仅在感受挥发性气味物质的过程中起着重要的作用,而且也参与液态化学刺激的识别过程。     

染料标记对斜纹夜蛾生长发育及成虫飞行能力的影响

以斜纹夜蛾Spodoptera litura为研究对象,将染料添加到半人工饲料中饲喂幼虫,评价其对该虫生长发育和成虫飞行能力的影响,以期为开展该虫的田间诱集和扩散行为研究提供标记方法。结果表明,添加不同浓度苏丹红7B、苏丹蓝Ⅱ和龙胆紫的半人工饲料饲养斜纹夜蛾幼虫,含0.006%苏丹红7B的半人工饲料幼虫存活率高,成虫标记效果好。进一步研究显示,取食含0.006%苏丹红7B半人工饲料的斜纹夜蛾幼虫发育历期、蛹重以及成虫寿命、体长、翅展及飞行能力等与对照相比均无显著差异。含0.006%苏丹红7B半人工饲料饲料对斜纹夜蛾的生物学无显著影响,标记效果显著,操作简单,适合于大规模标记斜纹夜蛾成虫。     

斜纹夜蛾多角体病毒包埋型病毒受体的鉴定

蔗糖密度梯度离心法提纯斜纹夜蛾核多角体病毒(Spodoptera litura multinucleocapsid nucleopolyhdrovirus,SpltMNPV)包埋型病毒粒子(polyhedra-denved virus,PDV),以此病毒粒子作抗原,免疫家兔获得抗血清;用SDS裂解缓冲液提取斜纹夜蛾幼虫中肠组织细胞总蛋白.采用病毒铺覆蛋白印迹技术(VOPBA),利用抗PVD抗血清对病毒受体进行检测,结果表明斜纹夜蛾中肠细胞总蛋白中40kD、73kD、85kD的三种蛋白能够结合PDV.     

中华按蚊气味结合蛋白基因AsinOBP1的克隆和表达分析

【目的】蚊虫的行为在很大程度上依赖于嗅觉系统, 例如寻找宿主和产卵场所等。中华按蚊Anopheles sinensis是我国最重要的传疟媒介之一, 但有关中华按蚊嗅觉信号传递过程的研究甚少。本研究旨在克隆和表达分析中华按蚊的气味结合蛋白（odorant binding proteins, OBPs）基因, 为进一步研究中华按蚊嗅觉传递的分子机制奠定基础。【方法】通过分析中华按蚊的转录组数据克隆气味结合蛋白基因, 采用RT-PCR和实时定量PCR技术分析该基因在成虫不同组织和在吸血前后的表达模式。【结果】克隆到一个气味结合蛋白基因, 命名为AsinOBP1 (GenBank登录号为KJ958382)。AsinOBP1基因开放阅读框长435 bp, 编码144个氨基酸, 具有典型的6个半胱氨酸位点。RT-PCR组织表达谱分析发现, AsinOBP1在检测的所有成虫触角、下颚须、喙和头部组织中都有表达, 而在足和去掉头部以外的躯体组织中不表达。定量分析发现AsinOBP1在雌蚊触角中的表达水平最高, 吸食血液后, AsinOBP1的表达水平显著下降; 仅用小鼠气味处理后, AsinOBP1的表达水平也显著下降。【结论】研究结果说明AsinOBP1可能是嗅觉组织特异性表达的基因, 与雌蚊寻找宿主等行为有关, 其功能还需深入研究。     

棉铃虫P450基因HarmCYP9A33的克隆、 序列分析及原核表达

夜间活动昆虫如夜蛾类主要通过嗅觉来寻找配偶、 寄主植物和产卵场所, 是研究昆虫嗅觉分子机制的理想材料。P450为多功能单加氧酶, 在昆虫对各种内源与外源物质的代谢中起重要作用。为研究P450在昆虫嗅觉中的作用, 本研究采用RT-PCR和RACE技术, 从夜蛾科昆虫棉铃虫Helicoverpa armigera (Hübner)雄蛾触角中扩增得到一条全长1 772 bp的P450基因, 命名为HarmCYP9A33 (GenBank登录号为JX486677)。序列分析表明, HarmCYP9A33开放阅读框全长1 590 bp, 编码529个氨基酸残基, 预测蛋白质分子量和等电点分别为61. 62 kD和7. 97; HarmCYP9A33与甘蓝夜蛾Mamestra brassicae触角毛形感器中高表达的MbraCYP9A13蛋白的氨基酸序列一致性最高, 达75%, 蛋白二级结构相似, 6个底物识别位点(substrate recognition sites, SRSs)序列一致性达61%, 其中底物与酶结合通道开关Ⅰ螺旋中SRS4序列完全相同, 与棉铃虫CYP9A亚家族蛋白有一定的结构相似性。Real-time PCR检测表明, HarmCYP9A33在雌、 雄蛾各组织中均有表达, 以腹部表达量最高, 其次为头部; 在卵至成虫各个时期也均表达, 以蛹中表达量最高; 在触角中的表达量随羽化时间而变化, 且多高于卵和幼虫中的表达量。SDS-PAGE检测和Western blot鉴定表明HarmCYP9A33体外融合表达成功。本研究为深入探讨该基因在棉铃虫触角感器细胞中的定位及其生物学功能奠定了基础。     

性信息素对斜纹夜蛾雄蛾嗅觉相关基因 abp,pbp 和 or 表达的影响

【目的】信息素是个体之间传递信息的重要分子,研究性信息素对斜纹夜蛾 Spodoptera litura 嗅觉相关基因表达的影响对于增加性信息素作用机理的认识及其应用有重要的意义。【方法】本研究通过实时定量PCR（qRT-PCR）技术探究在性信息素刺激处理条件下,斜纹夜蛾成虫嗅觉相关基因 abp, pbp 和 or 表达水平的变化;利用性信息素在田间诱捕斜纹夜蛾雄蛾,并通过自动计数器记录每小时诱虫量,从而间接显示其交配行为的节律性。【结果】斜纹夜蛾雄虫触角中嗅觉相关基因abp, pbp 和 or 的表达具有节律特性。经性信息素化合物(Z9, Z11-14:OAc+Z9, Z12-14:OAc)刺激处理后,abp, pbp 和 or 表达量也发生了显著的改变。通过记录田间性信息素诱捕器在一天中不同时间段内诱捕的雄蛾数量,发现诱捕到的斜纹夜蛾也具有节律特性。【结论】基因表达水平上的节律特性可能与雄虫交配活动的节律相关联,说明性信息素处理也在一定程度上改变了其节律及其对性信息素的神经反应。这一结果也首次从基因水平证明性信息素的刺激处理提高了周缘神经系统对性信息素反应的敏感性,有助于我们理解性信息素作用的分子机理,对迷向及性诱和测报应用具有指导意义。     

斜纹夜蛾普通气味结合蛋白ⅡcDNA的克隆及在原核细胞中的表达

采用同源克隆结合RACE的方法克隆了斜纹夜蛾的普通气味结合蛋白Ⅱ（S1GOBPⅡ）的cDNA序列（GenBank登录号为EU086371）。序列分析表明,S1GOBPⅡ可读框序列为489bp,编码162个氨基酸,分子量为18.2kD,等电点为5.72。S1GOBPⅡ具有昆虫气味结合蛋白的典型特征,即氨基酸序列中具有6个保守的半胱氨酸残基,呈酸性。S1GOBPⅡ氨基酸序列与草地贪夜蛾（S.frugiperda）和甜菜夜蛾（S.exigua）气味结合蛋白具有较高的同源性。RT-PCR和Northem blot检测表明,SIGOBPⅡ具有触角组织表达特异性。将S1GOBPⅡ,克隆到表达载体pET-32a上,阳性重组子转化表达宿主菌BL21（DE3）中,在IPTG诱导下进行了高效表达。SDS-PAGE检测表明S1GOBPⅡ在大肠杆菌中可表达相对分子质量（Mr）为32.0kD的可溶性融合蛋白,Westem blot分析表明表达产物能与Ni-NTA螯合物特异性结合,表明表达的S1GOBPⅡ为N端带有6His标签的融合蛋白。利用Ni^2＋-NTA亲和柱进一步纯化了S1GOBPⅡ,以该融合蛋白免疫新西兰大白兔制备了抗S1GOBPⅡ的抗血清,ELISA滴度为1：12800,Western印迹检测结果显示,S1GOBPⅡ抗血清与表达的融合蛋白呈阳性反应,表明所表达的融合蛋白仍保持原有蛋白的免疫原性。     

斜纹夜蛾抗菌肽基因Moricin和Cecropin时空表达模式及微生物敏感性的分析

抗菌肽是一类具有广谱抗菌活性的小分子多肽, 包括抗细菌、 病毒和真菌。本研究以斜纹夜蛾Spodoptera litura (Fabricius)为研究对象, 利用Real-time PCR和半定量RT-PCR检测了其体内两个重要抗菌肽基因Cecropin和Moricin的时空表达模式及其对微生物的敏感性。Real-time PCR检测结果表明, 抗菌肽基因Cecropin和Moricin在斜纹夜蛾各个龄期（1, 2, 3, 4, 5和6龄幼虫、 蛹、 成虫）都有表达, 随着龄期的增长, 表达量逐渐增加, 6龄幼虫中表达量达到最高。 半定量RT-PCR检测表明, 抗菌肽基因Cecropin和Moricin在7个不同组织（气管、 卵巢、 马氏管、 体壁、 中肠、 脂肪体和血细胞）中都有表达, Cecropin在脂肪体中表达量最高, 而Moricin在血细胞中表达量相对较高; RT-PCR检测表明, Cecropin和Moricin的表达在大肠杆菌Escherichia coli诱导后迅速上升, 其中诱导后8 h达到高峰期, 一直持续到48 h。不同病原微生物（大肠杆菌E. coli、 金黄色葡萄球菌Staphyloccocus aureus和白僵菌Beauveria bassiana）分别诱导后, Real-time PCR 检测表明, 斜纹夜蛾抗菌肽基因Cecropin和Moricin对大肠杆菌的刺激最为敏感。本研究结果为进一步研究斜纹夜蛾抗菌肽基因Cecropin和Moricin的功能奠定基础。     

柑橘大实蝇气味结合蛋白基因BminOBP25的克隆、原核表达及组织表达分析

【目的】昆虫的气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)与嗅觉识别密切相关,在触角感受器淋巴液内运输外界的脂溶性气味分子顺利到达嗅觉受体过程中起着关键的作用。本研究对柑橘大实蝇Bactrocera minax的气味结合蛋白基因进行了克隆和表达分析,旨在更好地了解气味结合蛋白在柑橘大实蝇嗅觉识别中的作用及为进一步研究柑橘大实蝇嗅觉传递的分子机制奠定基础。【方法】利用RT-PCR和RACE技术克隆柑橘大实蝇的气味结合蛋白基因,并进行生物信息学分析;构建重组表达载体p ET28a(+)-Bmin OBP25,转化到大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中,SDS-PAGE及Western blotting鉴定重组表达蛋白;采用荧光定量PCR检测该基因在柑橘大实蝇成虫不同组织中的表达。【结果】克隆获得柑橘大实蝇气味结合蛋白基因的c DNA全长序列,命名为Bmin OBP25(Gen Bank登录号:MH181875)。测序结果表明,Bmin OBP25开放阅读框全长447 bp,编码148个氨基酸,预测分子量为17.5 k D,编码序列具有OBPs典型的6个保守半胱氨酸和6个α螺旋区域特征。在IPTG诱导下目标蛋白以6×His标签融合蛋白的形式在宿主菌中得到稳定表达。荧光定量PCR分析表明,Bmin OBP25 mRNA在成虫触角、头(去除触角)、胸、腹、足、翅和产卵器中均有表达,其中在触角、头(去除触角)、足和产卵器中表达量较高。【结论】Bmin OBP25在柑橘大实蝇成虫触角、头、足和产卵器中具有高转录活性,提示该基因在非嗅觉组织中可能也具有生理功能,特别是可能在昆虫的取食与产卵地选择过程中起重要作用,其功能还需深入研究。本研究实现了Bmin OBP25基因的原核表达,为深入研究Bmin OBP25基因的功能奠定基础。     

斜纹夜蛾线粒体复合物ⅢFe-S蛋白基因克隆、序列分析及在不同发育阶段的表达特征

Fe-S蛋白(rieske iron-sulfur protein, RISP)是线粒体复合物Ⅲ的关键蛋白亚基之一, 在呼吸链电子传递中起着重要作用。本文利用RT-PCR技术和RACE方法获得了斜纹夜蛾Spodoptera litura (Fab.)线粒体复合物ⅢRISP基因, 该基因序列全长4 413 bp, 含有3个内含子; 开放阅读框长816 bp, 编码271个氨基酸。经氨基酸序列比对, 与鳞翅目家蚕Bombyx mori和小菜蛾Plutella xylostella的Fe-S蛋白一致性较高, 分别为83%和79%, 与其他目昆虫的RISP一致性较低。qRT-PCR分析结果表明, SlitRISP基因在斜纹夜蛾不同发育阶段的表达水平存在显著差异, 即幼虫期和成虫期的表达量显著高于卵期和蛹期, 其中幼虫期又以第4和5龄幼虫表达水平显著高于初孵幼虫以及第1, 2, 3和6龄幼虫。斜纹夜蛾SlitRISP基因的克隆成功为今后对其功能研究以及作为靶标设计新型高效杀虫剂提供了基础。     

果蝇嗅觉分子机理研究进展

黑腹果蝇Drosophila melanogaster是生物学研究的重要模式生物,也是探索研究生物体嗅觉奥秘的理想材料。近年来,由于分子生物学技术在神经科学领域的广泛应用,黑腹果蝇嗅觉机理研究取得了许多重大突破, 对气味分子受体及其识别机理、 嗅觉神经电信号的产生和传递、嗅觉信息的加工、编码以及记忆等方面都有了深入的了解。研究表明, 果蝇约1 300个嗅神经元(olfactory receptor neurons, ORNs)共表达62种不同的气味受体蛋白（olfactory receptor proteins, ORs）, 用以检测和识别其所感受的所有化学气味分子。许多OR所识别的气味分子配体已鉴定出来,普通的气味（如水果的气味）由数种不同的OR组合来识别,而信息素（pheromone）分子则由单种特定的OR来检测。气味信息在嗅神经元内转换成神经电信号,嗅觉电信号沿嗅神经元的轴突传递到触角叶, 再经投射神经元（projection neurons, PNs）将信息送至高级中枢如蘑菇体（mushroom body, MB）和侧角（lateral horn, LH）,最终引发行为反应。在黑腹果蝇嗅觉信息传递通路中,某些蛋白如Dock,N-cadherin,Fruitless等起着重要作用,缺失这些蛋白会导致嗅觉异常。本文对这些研究进展作一综述。