一种新型巴斯德毕赤酵母表达载体的构建及甘露聚糖酶的表达

目的:构建以带自身启动子的蔗糖转化酶基因(suc2)为选择标记的载体,用于外源基因在巴斯德毕赤酵母中的正确分泌表达。方法:根据已发表的蔗糖转化酶基因序列设计并合成1对引物,应用PCR技术,以啤酒酵母INVSC1总DNA为模板,扩增出包含自身启动子和终止区序列的suc2基因。将该基因与毕赤酵母表达载体pPIC9K连接,构建了以suc2为选择标记的表达载体pPIC12K。将甘露聚糖酶基因man克隆入载体pPIC12K,用PEG/LiCl法转化毕赤酵母GS115菌株。以蔗糖为惟一碳源筛选转化子,利用底物平板检测筛选到的转化子中man基因的表达,并对重组表达菌株进行连续传代实验。结果:部分转化子周围产生明显的水解圈,证明甘露聚糖酶已经得到分泌表达;对重组表达菌株的连续传代实验证实了该表达载体具有良好的遗传稳定性。结论:以带自身启动子的suc2基因为选择标记的表达载体构建成功,并且这个新型表达载体能够对外源基因进行稳定有效的分泌表达。     

苦瓜MAP30基因的毕赤酵母表达载体构建及重组菌株的筛选

目的:从苦瓜中克隆MAP30全长基因,并将该基因连接至表达载体pPIC9中,建立酵母菌落PCR筛选方法。方法采用改良SDS法从苦瓜表皮中提取基因组DNA,设计特异性的引物,通过PCR技术扩增出全长861bp的MAP30基因。该基因经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切,连接至毕赤酵母表达载体pPIC9中。重组载体转化GS115菌株,运用菌落PCR鉴定重组菌株。结果:基因测序表明,该基因已成功插入酵母表达载体pPIC9α-factor分泌信号下游,同源性分析表明该基因与GeneBank(AF284811)的核苷酸同源性达99.9%,氨基酸同源性达100%。菌落PCR显示外源基因已整合入酵母GS115菌株中。结论:成功地克隆了MAP30全长基因,并构建了含MAP30基因的重组毕赤酵母表达载体,并获得了整合菌株,为下一步研究奠定了基础。     

小鼠IL-35基因毕赤酵母表达载体的构建及表达

目的构建真核酵母表达载体pPIC9K与小鼠IL-35基因的重组质粒pPIC9K-mIL-35-His,在毕赤酵母GS115菌株中诱导表达,并对其进行鉴定。方法以pET-30a-mIL-35为模板,用PCR扩增出IL-35去信号肽基因全序列,并在3'端引入His标签,构建重组质粒pPIC9K-mIL-35-His,经SalⅠ线性化重组质粒后,用电穿孔方法将该基因转染毕赤酵母细胞内。经G418梯度筛选高拷贝转化子,筛选Mut+表型后经PCR进一步鉴定IL-35基因与酵母染色体是否整合。小量诱导表达筛选出高表达菌株,大量甲醇诱导表达,以SDS-PAGE及免疫印迹(Western blot)鉴定蛋白表达。结果小鼠IL-35基因真核酵母表达载体pPIC9K-mIL-35-His构建成功,并且在GS115中通过甲醇诱导表达,经SDS-PAGE及Western blot分析,可见相对分子质量约为65 000的目的蛋白。结论实验所构建的重组质粒pPIC9K-mIL-35-His可在毕赤酵母GS115中正确的表达小鼠IL-35基因。     

人三叶因子1大肠杆菌及毕赤酵母表达载体的构建与鉴定

目的:构建人三叶因子1(hTFF1)的大肠杆菌及毕赤酵母表达载体。方法:从人胃窦部提取总RNA,经RT-PCR得到hTFF1 cDNA,用PCR方法扩增hTFF1基因,并将其分别克隆到大肠杆菌的表达载体pET32α及毕赤酵母的表达载体pCAPZαA中,构建原核及真核重组表达质粒pET32α-hTFF1和pGAPZαA-hTFF1。结果:通过双酶切和基因序列分析确定插入pET32α和pGAPZαA中的片段为hTFF1基因片段。结论:重组质粒pET32α-hTFF1和pGAPZαA-hTFF1成功构建,为在比较原核和真核细胞中hTFF1高效表达的情况及下一步的功能研究奠定了基础。     

mNUDC基因在巴斯德毕赤酵母中表达载体的构建及表达

目的:探索小鼠核迁移蛋白C(mNUDC)在毕赤酵母分泌表达的方法.方法:应用PCR扩增本实验室所构建的重组质粒PET28b-his-mNUDC中的mNUDC基因,使用基因重组方法构建毕赤酵母真核表达栽体pPICZaA-his-mNUDC,电击转化酵母茵株KM71后,经摇瓶发酵和甲醇诱导,SDS-PAGE和Westernblot分析鉴定上清中重组mNUDC蛋白表达量.结果:经过PCR方法,有效扩增了mNUDC基因,构建了pPICZα A-his-mNUDC酵母表达质粒,序列分析表明所构建的含mNUDC基因的质粒与设计相同,mNUDC蛋白得到正确表达.使用SDS-PAGE和Western blot方法可以检测到mNUDC的稳定、高效地分泌表达.结论:成功地构建了mNUDC基因的毕赤酵母表达载体pPICZα A-his-mNUDC,并在毕赤酵母中实现分泌型离表达,为进一步研究mNUDC蛋白对小鼠的生物活性奠定了实验基础.     

aiiA基因表达载体的构建及其在毕赤酵母中的表达

构建携带N-酰基高丝氨酸内酯酶基因(aiiA)的重组毕赤酵母表达载体pPIC3.5K-aiiA,采用电转化方法转入毕赤酵母GS115,经营养缺陷型培养基、表型鉴定和高G418浓度筛选获得高拷贝表达盒的酵母转化子,用0.5%甲醇诱导表达,RT-PCR鉴定可检测到重组酵母中编码目的基因成熟肽的mRNA,SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,aiiA基因在毕赤酵母中成功表达,用指示菌紫色杆菌CV026检测发现目的蛋白具有降解N-酰基高丝氨酸内酯的活性。     

毕赤酵母菌高效表达乙肝表面抗原的研究

目的:筛选高效表达HBsAg的毕赤酵母茵,制备目的蛋白.方法:从已确诊的乙肝病人血清中提取DNA,PCR扩增HBVS基因,将其分别克隆入毕赤酵母胞内表达栽体pPICZA中.构建重组质粒pPICZA-S和pPICZA-SH,经Sac I线性化后,LiCI化学法转化入酵母茵株GS115、X-33、KM71H和SMD1168.结果:诱导表达后的GS115工程茼单位体积的培养基所得的抗原含量最高,诱导培养基中加入0.1%酪蛋氨基酸后,可抑制目的蛋白的水解,有利于目的蛋白的表达,粗略估算表达量为15.3mg/L,最佳收获时间为72 h.结论:经SDS-PAGE和Westcrn-blot分析表明,所得产物为乙肝表面抗原S蛋白.     

草鱼生长激素基因在毕赤酵母中的表达

将草鱼生长激素基因（cGH）的cDNA亚克隆到酵母表达载体pPIC9K中,经电击转化导入毕赤巴斯德酵母GS115菌株,获得转化子。菌落PCR技术筛选证实cGH已经整合到了酵母染色体上。对重组酵母进行诱导表达,SDS-PAGE和Western印迹分析,结果表明cGH的毕赤巴斯德酵母GS115菌株中获得了高效表达。     

草鱼生长激素在毕赤酵母中的高效分泌表达

为大量获得具有生物学活性的草鱼生长激素,对草鱼生长激素cDNA在毕赤酵母中的表达进行了研究。将草鱼生长激素cDNA克隆入毕赤酵母表达载体pGAPZ-α-B,构建表达载体pGAPZ-α-B-GH。在三磷酸甘油醛脱氢酶（GAP）启动子的调控作用下,一个类似于天然生长激素大小、分子量约22kD的蛋白获得表达,其表达量约50mg/L。Western杂交表明：表达的蛋白与兔抗草鱼生长激素的多克隆抗体特异结合,证实该表达蛋白为草鱼生长激素;受体夹心式ELISA检测表明：表达的草鱼生长激素具生物学活性,能与不同种鱼来源的肝膜受体特异结合。     

乙型肝炎病毒全长PreS蛋白基因在酵母中的表达

应用直接提取法从武汉地区乙型肝炎病人患者阳性血清中提取HBV基因组,以此作为模板,用引物PCR方法获得全长preS基因,该片段的DNA大小1203bp-克隆到pUCm-T载体中,应用M13通用引物进行序列测定,与中国HBV标准株序列比较,证实基因型为Adr亚型。有24个核苷酸不同,preS基因包含3个起始密码ATG分别为preS1,preS2,和S的翻译起点。然后将preS基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,将Sal Ⅰ线性化的pPIC9K—preS质粒用电击法导入巴斯德一毕赤酵母GS115His中。通过MD—G418平板筛选和5‘‘‘‘‘‘‘‘AOXI和3’AOXI引物PCR鉴定获得稳定重组HBV全长严preS基因的His^ Mut^ 酵母工程菌株。此酵母菌株在合适的培养条件和甲醇诱导下高效表达产生全长preS蛋白并可分泌到培养液中,SDS—PAGE显示培养液中含有分子量约为48kDa的带;微孔ELISIA法证实表达并分泌到培养液中的preS蛋白能够与HBV抗体阳性血清发生特异性反应。     

带有PreS的重组乙肝表面抗原在毕赤酵母中的表达

带有ＰｒｅＳ区的乙肝表面抗原（ＨＢｓＡｇ）有望成为新一代更高效的乙肝疫苗。利用毕赤属酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）表达系统,表达了带有ＰｒｅＳ区免疫决定簇的理组乙肝表面抗原Ｓ１Ｓ、ＳＳ１和Ｓ２Ｓ。对表达产物的性质鉴定表明,产物可以形成２具有相应的Ｓ、ＰｒｅＳ１或ＰｒｅＳ２抗原性的颗粒,表达水平高于啤酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）表达系统。     

毕赤酵母表达的重组乙肝表面抗原SS1的纯化及性质鉴定

对毕赤酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）表达的重组乙肝表面抗原ＳＳ１的纯化以及蛋白质的理化性质及免疫原性进行了进一步的研究。采用单抗亲和层析的方法,一步纯化即可得到纯度为９５％的纯化蛋白质。ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹鉴定表明,纯化的ＳＳ１融合蛋白同时具有良好的Ｓ和ＰｒｃＳ１抗原性。ＣｓＣ１密度梯度离心和电镜检测的结果则表明,这一重组抗原可以形成与ＨＢＶ亚病毒颗粒类似的颗粒结构。在ＢＡＬＢ／     

分泌型乙型肝炎病毒包膜M蛋白在毕赤酵母中的表达

将乙肝病毒包膜中蛋白M基因插入酵母整合型表达质粒pAO818的醇氧化酶 (AOX1)启动子下游 ,构建携带 8拷贝M表达盒的重组载体 ,经电穿孔转化SMD116 8菌株和G4 18筛选 ,得到了高效分泌表达M蛋白的毕赤酵母菌株 ,表达量超过 5 0mg L .经初步纯化 ,对表达产物的性质鉴定表明 ,重组蛋白具有preS2和S抗原性 ,可以形成颗粒 ,并具有一定程度的糖基化 .所构建的稳定重组菌株和所得到的重组蛋白颗粒 ,为进一步研究新一代的疫苗提供了必要的材料 .     

毕赤酵母发酵生产颗粒性乙肝表面抗原的条件优化

乙型肝炎病毒的流行对人们的生命健康造成了极大的威胁, 而有效准确的诊断和预防性疫苗是阻止其流行的主要手段, 乙肝表面抗原是诊断试剂和疫苗的主要成分。本试验在构建稳定表达HBsAg的毕赤酵母菌株后, 对其发酵条件进行了研究。采用摇瓶分批培养方法, 探讨了不同培养基、溶解氧、诱导物甲醇的浓度以及pH值等因素对菌体生长与重组蛋白表达的影响。在10 L发酵罐上采用分批补料培养的方法研究了进行扩大培养生产重组HBsAg。结果表明, FBS无机盐合成培养基是理想的工业发酵培养基, 溶解氧对菌体的生长与表达有显著的影响, 甲醇诱导最佳终浓度为1% (V/V), 发酵的最适pH值为5.4~6.0。发酵罐放大培养后, ELISA和 SDS-PAGE分析表明重组HBsAg获得了高效表达, 最终菌体生物量达到310 OD600, 表达量达到27 mg/L。电子显微镜观察表达重组乙肝抗原可以自组装为22 nm类病毒颗粒, 为HBV的新一代早期血清学诊断和疫苗的大规模生产提供了一定的参考。     

前列腺特异膜抗原在Pichia pastoris酵母中的表达及鉴定

前列腺特异膜抗原是一种具有高度前列腺特异性的糖蛋白 ,其表达的增高与肿瘤的术后复发、激素抵抗及较差的预后正相关 ,在前列腺癌的诊断和治疗中有广泛的应用前景 .从前列腺癌组织提取总RNA ,利用RT PCR技术获得PSMA基因的全长序列 ,构建了重组酵母表达载体pPIC3.5K PSMA .电击法转化Pichiapastoris酵母 ,通过表型筛选和PCR鉴定证实该基因已稳定整合入Pichiapastoris酵母基因组中 .SDS PAGE显示 ,获得的PSMA蛋白分子量约 10 0kD ,表达产物经West ern印迹证实可特异地与PSMA单克隆抗体 4G5结合 .结果表明 ,成功地获得PSMA编码的cDNA并在酵母细胞中获得表达 .     

乙型肝炎病毒X基因真核表达载体的构建及其在巴斯德毕赤酵母中的表达

目的：在巴斯德毕赤酵母中表达乙型肝炎病毒（HBV）X蛋白,为探讨HBVX蛋白与慢性乙型肝炎及肝细胞癌发生的关系奠定基础。方法：用PCR方法扩增X基因序列,并分别在上下游引入XhoⅠ和XbaⅠ酶切位点,插入pPICZαA载体,转化大肠杆菌TOP10,筛选阳性克隆,对其进行PCR和双酶切及测序鉴定,构建HBVX蛋白毕赤酵母表达质粒pPICZαA-HBx;电击转化毕赤酵母GS115,对阳性克隆进行诱导表达后经SDS-PAGE和Western blotting鉴定目的蛋白。结果：双酶切pPICZαA-HBx后,琼脂糖电泳可分别见到大小约为3.1kb和465bp的片段,表明目的片段已插入载体中,序列测定表明其含有完整的X基因片段,Western blotting结果显示含有pPICZαA-HBx的毕赤酵母GS115能分泌表达X蛋白。结论：构建了毕赤酵母表达载体pPICZαA-HBx,并能在毕赤酵母GS115中分泌表达X蛋白。     

纳豆激酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

纳豆激酶纳是从日本传统食品纳豆中发现的一类具有溶栓效果的蛋白酶,由于其具有安全,高效,作用时间长,易吸收,廉价等优点,现在正成为一个开发治疗血栓类疾病药物的研究热点。从本实验室保存的一株高溶栓的纳豆杆菌N07出发,提取总基因组DNA,利用PCR手段扩增获得了纳豆激酶长为825bp的成熟肽基因片段。构建重组表达质粒pPICZaA-NK,经EcoR I、Xba I双酶切、PCR、测序验证得出重组表达质粒上的外源基因即为825bp的目的片段;将重组质粒pPICZaA-NK用内切酶Sac I线性化后电击导入毕赤酵母X33,通过含Zeocin的YPDS平板筛选获得重组酵母。重组酵母在BMMY培养基中发酵培养,用1%甲醇诱导目的蛋白表达。用纤维蛋白平板法检测发现发酵上清具有纤溶活性,经硫酸铵盐析、透析、Sephadex-G50过柱等步骤分离得到纳豆激酶蛋白,进行SDS-PAGE鉴定表明,表达的纳豆激酶蛋白分子量为27KD。以尿激酶为标准,实验所得纳豆激酶发酵上清液溶栓活性约为195U/mL。成功的将纳豆激酶成熟肽基因在毕赤酵母X33中表达,为纳豆激酶基因工程进一步研究奠定基础。     

乙型肝炎病毒全长PreS蛋白基因在酵母中的表达

应用直接提取法从武汉地区乙型肝炎病人患者阳性血清中提取HBV基因组,以此作为模板,用引物PCR方法获得全长preS基因,该片段的DNA大小1 203bp.克隆到pUCm-T载体中,应用M13通用引物进行序列测定,与中国HBV标准株序列比较,证实基因型为Adr亚型.有24个核苷酸不同,preS基因包含3个起始密码ATG分别为preS1,preS2,和S的翻译起点.然后将preS基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,将Sal I线性化的pPIC9K-preS质粒用电击法导入巴斯德-毕赤酵母GS115His-中.通过MD-G418平板筛选和5'AOX1和3'AOX1引物PCR鉴定获得稳定重组HBV全长preS基因的His+Mut+酵母工程菌株.此酵母菌株在合适的培养条件和甲醇诱导下高效表达产生全长PreS蛋白并可分泌到培养液中,SDS-PAGE显示培养液中含有分子量约为48kDa的带;微孔ELISIA法证实表达并分泌到培养液中的PreS蛋白能够与HBV抗体阳性血清发生特异性反应.