红火蚁病原真菌分离鉴定及致病性研究

红火蚁Solenopsis invicta是世界上最具破坏力和威胁性的入侵检疫害虫之一,对农林业生产安全、公共设施以及人体健康都造成了巨大影响。为筛选对红火蚁有致病性的病原真菌,本研究通过组织分离法对自然罹病的红火蚁进行致病菌分离,结合病原形态学及分子生物学的方法对病原真菌进行鉴定并采用喷雾法测定了病原真菌对红火蚁的致病力。结果表明：从罹病红火蚁上分离出3株病原真菌HHYSFJ01、HHYSFJ02和HHYSFJ05,分别为红绶曲霉Aspergillus nomius、淡紫拟青霉Purpureocillium lilacinum和球孢白僵菌Beauveria bassiana。致病性测定,这3株病原菌对红火蚁均具有较强的致病性,且3株病原菌致病性间差异显著。经1.0×10^8孢子/mL孢子悬浮液喷雾处理红火蚁10 d后,球孢白僵菌菌株HHYSFJ05的致病性最强,红火蚁工蚁的校正死亡率为84.71%,LT50为4.67 d;红绶曲霉菌株HHYSFJ01和淡紫拟青霉菌株HHYSFJ02次之,红火蚁工蚁的校正死亡率分别为78.82%和73.29%,LT50分别为4.99 d和5.20 d。     

三株金龟子绿僵菌对红火蚁的致病力测定

本研究在实验室条件下测定了金龟子绿僵菌M09、CQMa117和CQMa128三个菌株对红火蚁的侵染能力。结果表明在1.0×10~8孢子/mL浓度下M09、CQMa128和CQMa117菌株处理后10 d红火蚁的工蚁累计死亡率分别为73.3%、14.6%和55.5%;M09菌株对工蚁的LC50为3.50×106孢子/mL,8.0×107孢子/mL浓度处理LT50为4.35 d。对M09菌株侵染红火蚁幼虫和蛹的能力测定结果显示,1.0×10~8孢子/mL浓度处理后10 d该菌株对幼虫和蛹的累计侵染率为98.9%和100%,对幼虫和蛹LC50分别为6.34×10~4孢子/mL、1.01×10~4孢子/mL。以上研究证实金龟子绿僵菌M09菌株对红火蚁具较强的致病力,致死速度较快,可作为该蚁生物防治的候选菌株。     

红火蚁Toll受体家族免疫响应绿僵菌表达模式的研究

为探究红火蚁Solenopsis invicta Buren Toll受体家族基因如何免疫响应绿僵菌Metarhizium的侵染。本研究采用浸渍法测定了不同浓度下绿僵菌对红火蚁大中小3种不同大小工蚁的致病力,并用显微镜观察了绿僵菌侵染后红火蚁3种工蚁的表型变化。利用生物信息学筛选Toll受体基因,并对Toll受体家族基因的理化性质、结构域、染色体位置、系统进化进行分析鉴定。运用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测了红火蚁大中小型工蚁中Toll受体家族的发育历期和绿僵菌侵染后的表达模式。结果表明,绿僵菌在96 h对红火蚁大中小型工蚁的致死中浓度（LC50）分别为5.8×10^7孢子/mL、3.1×10^7孢子/mL、1.5×10^7孢子/mL;绿僵菌侵染红火蚁第3天,显微镜下观察到红火蚁体壁细小的菌丝,虫体僵硬,寄主死亡后菌丝迅速蔓延并逐渐长成橄榄绿色分生孢子;RT-qPCR结果表明Toll受体基因在红火蚁不同发育阶段中的mRNA表达水平存在显著差异,且Toll受体基因在雌性生殖蚁表达水平显著高于雄性生殖蚁;RT-qPCR结果表明红火蚁大中小型工蚁Toll受体免疫响应绿僵菌不一样。在大型工蚁中,绿僵菌侵染后,Toll受体家族基因能显著上调表达,6 h是一个诱导高峰期,Toll2-1和LRR转录水平最高,响应绿僵菌最强;在中型工蚁中,绿僵菌不能刺激Toll2-2基因的表达,却能强烈诱导Toll1,Toll2-1,Toll6,Toll7和LRR基因的上调表达,Toll1和Toll2-1响应绿僵菌最强。在小型工蚁中,绿僵菌能显著诱导Toll受体家族基因基因的上调表达,在24 h时,LRR基因表达量最高,相比于对照,LRR基因表达提高25倍,LRR在6 h和24 h响应绿僵菌最强。以上研究表明Toll受体可以免疫响应入侵的绿僵菌,且不同的Toll对绿僵菌可能具有不同的响应机制。本研究为进一步阐明Toll受体的功能奠定基础,为进一步利用绿僵菌控制红火蚁提供技术指导。     

不同土壤类型和含水量下金龟子绿僵菌对红火蚁的致病力

【背景】红火蚁是一种危险性入侵生物,虫生真菌对其防治效果会受到外界环境因子的影响。【方法】应用致病力测定的方法研究了不同剂量金龟子绿僵菌M09对红火蚁的毒力,同时研究了含水量和土壤类型对绿僵菌毒力的影响。【结果】红火蚁的死亡率与金龟子绿僵菌的剂量呈正相关,处理4 d后LC50为0.37 g。金龟子绿僵菌在砂土、壤土和粘土中对红火蚁的致死率均与对照差异显著,其中在砂土中的毒力最强。此外,在不同含水量的土壤中,金龟子绿僵菌的致死率也不相同(P0.01)。【结论与意义】土壤类型和土壤湿度会显著影响金龟子绿僵菌M09对红火蚁的防治效果。选择高湿和砂土类型的土壤施用金龟子绿僵菌M09可以达到较好的效果。     

不同土壤类型和含水量下金龟子绿僵菌对红火蚁的致病力

[背景]红火蚁是一种危险性入侵生物,虫生真菌对其防治效果会受到外界环境因子的影响。[方法]应用致病力测定的方法研究了不同剂量金龟子绿僵菌M09对红火蚁的毒力,同时研究了含水量和土壤类型对绿僵菌毒力的影响。[结果]红火蚁的死亡率与金龟子绿僵菌的剂量呈正相关,处理4d后LG50为0．37g。金龟子绿僵菌在砂土、壤土和粘土中对红火蚁的致死率均与对照差异显著,其中在砂土中的毒力最强。此外,在不同含水量的土壤中,金龟子绿僵菌的致死率也不相同（P〈0．01）。[结论与意义]土壤类型和土壤湿度会显著影响金龟子绿僵菌M09对红火蚁的防治效果。选择高湿和砂土类型的土壤施用金龟子绿僵菌M09可以达到较好的效果。     

红火蚁Serpin家族基因鉴定及其在绿僵菌侵染下的表达模式分析

丝氨酸蛋白酶抑制剂（Serine protease inhibitor, Serpin）在昆虫Toll通路和PPO级联反应的防御机制中起着至关重要的作用。本研究利用现代生物信息学工具预测和分析了红火蚁Solenopsis invicta中Serpin家族的结构和功能多样性。染色体定位表明,红火蚁基因组中7个Serpin基因家族成员不均匀的分布在4条染色体上。结构域分析表明,SiSerpin蛋白具有Serpin基因的保守结构,即典型的反应中心环（Reactive central loop, RCL）结构与Serpin结构域,不同成员蛋白拥有多样化的基序。系统进化分析表明,红火蚁Serpin蛋白与其他的昆虫Serpin蛋白有较高亲缘关系,SiSerpin7与烟草天蛾Manduca sexta的Serpin3a亲缘关系最近,SiSerpin12与黄粉虫Tenebrio molitor Serpin55亲缘关系最近,SiSerpin13与烟草天蛾Serpin6亲缘关系最近,SiSerpin4与家蚕Serpin27亲缘关系最近。为了进一步明确红火蚁Serpin家族在绿僵菌Metarhizium侵染后的表达模式,用绿僵菌侵染不同体型的工蚁,荧光定量PCR（RT-qPCR）分析表明,红火蚁Serpin基因家族成员能在早期响应绿僵菌的侵染;除SiSerpin7基因外,大型和小型两种工蚁的表达模式存在较大的差异。结果表明红火蚁Serpin家族作为免疫调控蛋白,能够响应绿僵菌的侵染,且在红火蚁不同体型工蚁之间存在着不同的免疫调控模式。这些发现不仅为Serpins的功能分析提供了理论基础,而且有可能有助于绿僵菌作为一种有效的生防剂的开发。     

红火蚁活性真菌菌株的室内筛选研究

在实验室条件下采用浸渍法测定了15株白僵菌Beauveria spp.,15株绿僵菌Metarhizium spp.和4株淡紫紫孢菌Purpureocillium lilacinum (Thom)对红火蚁Solenopsis invicta Buren工蚁的活性,并测定分析了高活性菌株对红火蚁工蚁的毒力。结果表明,以1.0×10^8孢子mL的浓度处理红火蚁工蚁后第10天,白僵菌HHY-B、LCM1、ZYSYE-Y2、Bb034、ZG5、Bb720、Bb040、CP728和淡紫紫孢菌LYC1菌株的活性较强,红火蚁工蚁的校正死亡率为84.70%~98.79%,僵虫率为70.61%~90.38%。红火蚁工蚁在接种不同浓度的高活性菌株后,随着孢子浓度的升高,红火蚁的累积校正死亡率和僵虫率增大,致死中时(LT50)缩短,第10天白僵菌ZYSYE-Y2、CP728、HHY-B、LCM1、ZG5、Bb040、Bb720、Bb034和淡紫紫孢菌LCM1菌株对红火蚁工蚁的LC50分别为1.16×10^5、1.49×10^5、2.27×10^5、2.28×10^5、2.32×10^5、3.79×10^5、4.94×10^5、8.47×10^5和3.90×10^6孢子/mL。当孢子浓度为1.0×10^7孢子/mL时,白僵菌HHY-B、CP728、ZG5和Bb040菌株处理的最终校正死亡率分别为91.54%、94.60%、91.23%和94.65%,僵虫率为82.51%、91.74%、85.43%和80.60%,致死中时(LT50)为4.22 d、4.07 d、3.72 d和3.68 d。综合分析表明,白僵菌HHY-B、CP728、ZG5和Bb040菌株对红火蚁工蚁具有较强的活性,可作为红火蚁生物防治的候选菌株     

一株产紫杉醇中国红豆杉内生真菌的分离和鉴定

从秦巴山区中国红豆杉茎和根中分离得到一批内生真菌,其中一株内生真菌LB-10的发酵液经紫外分光光度法、HPLC和HPLC-MS分析,表明其代谢产物中存在紫杉醇,含量为846.1μg/L。通过形态学研究、ITS序列分析,确定该菌株为绿僵菌。     

绿僵菌属的修订

本文报道绿僵菌属的修订和修订后本属区分种的主要标准。这对于自然界本属复杂类群的研究将起到新的推动和助益。     

红火蚁雌蚁生殖发育的研究

通过解剖多后型红火蚁Solenopsis invicta Buren雌蛹、有翅雌蚁和脱翅雌蚁,观察了雌蚁内生殖系统的结构和发育进度。结果表明,多后型雌蚁内生殖系统形成于蛹期,其结构与单后型雌蚁存在一定差异。从发育进度来看,虽然雌蚁羽化后其卵巢大小和卵巢管数量仍有一定增长,但蛹期是卵巢大小、卵巢管数量快速增长的阶段;卵子发生始见于羽化后第4d,且卵量随个体发育而快速增加,直至脱翅后第10d达到高峰,随后开始下降;生殖系统的其它结构的变化较小。雌蛹、有翅雌蚁和脱翅雌蚁发育后期的卵巢平均大小分别为1149．23×712．42、1594．88×834．26和1975．60×1303．57μm;而卵巢管数量则分别为62．67、81．33和86．33条。至雌蚁脱翅后10d,卵巢中成熟卵和总卵量分别为20．00±4．62粒和34．00±2．31粒。     

Pathogenicity of individual isolates of entomopathogenic fungi affects feeding preference of red imported fire ants Solenopsis invicta

Seven isolates of entomopathogenic fungi, Isaria fumosorosea (IFCF-H and IFCF-L), Beauveria bassiana s.l. (Bb02 and Bb04) and Metarhizium anisopliae s.l. (Ma01, SM076 and M09), were selected for their pathogenicity against Solenopsis invicta as well as feeding preference of S. invicta. When ants were treated with a conidial suspension at a concentration of 1 × 10⁸ conidia/ml, the median lethal times (LT₅₀) of IFCF-H, IFCF-L, Bb02, Bb04, Ma01, SM076 and M09 were 3.4, 162.6, 7.3, 2.8, 3.8, 7.3 and 2.7 days, respectively, after 10 days. The median lethal concentrations (LC₅₀) on the 10th day after inoculation were 1.20 × 10⁷, 1.56 × 10¹⁰, 4.23 × 10⁷, 3.04 × 10⁶, 6.13 × 10⁶, 2.90 × 10⁷ and 9.90 × 10⁵ conidia/ml, respectively. Furthermore, S. invicta consumed significantly less solution flavoured with Bb04 conidia than the control, which was demonstrated by the lowest preference index (PREF = 0.09). S. invicta did not have a significant feeding preference for other fungal isolates. The pathogenicity (LC₅₀) of fungal isolates was not significantly correlated (R² = 0.013) with the PREF of S. invicta. However, in the paired-choice experiments between different virulent isolates belonging to the same genera, S. invicta tended to select the solution flavoured with conidia of relatively lower pathogenic isolates such as IFCF-L, Bb02 and SM076. We conclude that the pathogenicity of congeneric fungi may affect the feeding preference of S. invicta. Red imported fire ants might adjust their feeding response to entomopathogenic fungi based on the profile of microbial volatile organic compounds.     

Diversity and virulence of soil-dwelling fungi Isaria spp. and Paecilomyces spp. against Solenopsis invicta (Hymenoptera: Formicidae)

To comprehend the diversity and potential control of soil-dwelling fungi, Isaria and Paecilomyces, against the red imported fire ant Solenopsis invicta (Hymenoptera, Formicidae), an investigation was carried out between 2004 and 2008. From 258 soil samples collected from 16 central and southern provinces and cities in China, a total of 171 isolates of the genra Isaria and Paecilomyce were isolated, and the species I. javanicus, P. marquandii and I. fumosoroseus were found more abundant than I. cateniobliquus, P. carneus, P. inflatus and P. lilacinus. Geographic differences of isolating rates were observed as well. Samples from the southern areas had higher fungal isolating rates than those from the central areas. Subsequently, 47 isolates were further tested for pathogencity against the red imported fire ant. All isolates except P115 showed certain pathogenic potential (the mean is 52.3% at 4000 conidiospores/mL) to the ant. I. javanicus was the most effective species with a mean pathogenicity of 80.6%, while pathogenicities of P. marquandii, P. gunni and I. fumosoroseus were 44, 21 and 49%, respectively. Furthermore, the more effective isolates P028 of I. javanicus and P003 of I. fumosoroseus were tested in a virulence experiment. The LD₅₀ values of P028 and P003 against major and miner workers were determined as 412,280 and 854,451 conidiospores/cm², respectively. Meanwhile, the LT₅₀ values at 1000 conidiospores/cm² were 7.1 and 6.6 d in isolate P003 and 6.8 and 6.6 d in isolate P028.     

5种有机溶剂对红火蚁的毒力

红火蚁Solenopsis invicta Buren是一种重要的入侵害虫,可对农林生产、人体健康等造成严重威胁.毒饵诱杀是红火蚁防治的重要措施,高效的红火蚁毒饵有效成分需要通过胃毒测试筛选获得,而用于测试的胃毒药剂的配制则需借助对红火蚁微毒或无毒性的助溶剂.本文通过糖水饲喂法研究了不同剂量丙酮、吐温20、吐温80、二...     

球孢白僵菌在红火蚁体表侵染的扫描电镜观察

利用扫描电镜观察了球孢白僵菌Beauveria bassiana Bb04菌株分生孢子对红火蚁Beauveria bassiana 工蚁体壁的侵染过程。结果表明: 分生孢子多分布在红火蚁工蚁节间膜、胸部的褶皱、气门、体壁的凹陷部位、刚毛窝附近, 以及着生较密刚毛的足上。萌发的分生孢子在节间膜以及体表缝隙、刚毛窝及刚毛稀少的凹陷部位、胸部褶皱和足胫节处入侵。分生孢子在附着12 h后开始萌发, 接种后18 h附着在节间膜处的孢子首先侵入成功, 接种后24 h刚毛窝附近孢子萌发入侵, 接种后60 h胸、腹和足等部位的孢子均成功穿透侵入表皮。分生孢子可以直接以芽管侵入表皮, 也可以产生附着胞再侵入。     

深圳市红火蚁婚飞规律研究

本研究利用自制红火蚁Solenopsis invicta Buren收集装置对红火蚁婚飞规律进行研究,结果表明:本试验过程中共观察到婚飞273次,无论大、中、小蚁巢均有有翅蚁婚飞现象;共收集到有翅蚁10 618头,雌雄比为2.1:1;单次婚飞有翅蚁均为雌虫的有167次,均为雄虫的有25次,单次婚飞有翅蚊既有雌虫又有雄虫(雌虫+雄虫)的共81次;同一蚁巢可以发生多次婚飞,同一蚁巢不同次婚飞的有翅蚁性别比也会发生变化;除2009年11月和2010年2月未收集到有翅蚁,其余各月均可观察到有翅蚁婚飞,婚飞最高峰期为2010年4月和5月,其次是2009年6-9月,婚飞次数和收集到的有翅蚁数量成明显的正向相关关系;8:30-15:00均有有翅蚁婚飞,而婚飞高峰期为11:30-13:30,婚飞一般持续30～150 min.婚飞一般发生在雨后晴天或相对低温后气温快速回升以后.     

绿僵菌破坏素合成缺失株中分离鉴定pseurotin A

真菌次级代谢产物是医药活性成分的重要来源之一。就真菌基因组编码的次级代谢基因簇数量而言,由于普遍存在的基因沉默现象,常规培养中能够分离鉴定的化合物种类一般很有限。广谱杀虫的罗伯茨绿僵菌在液体培养基中的主要代谢产物为非核糖体环肽类的破坏素,本研究在对破坏素合成缺失突变株ΔdtxS1进行液体培养时获得了新的产物峰,对其中一个产物峰进行分离、纯化及结构鉴定,确定该化合物为螺环类的pseurotin A。结合在烟曲霉菌中解析的pseurotin A合成途径,推测获得了罗伯茨绿僵菌中的潜在合成基因簇,并推测了pseurotin A在绿僵菌中的合成途径。本研究首次在绿僵菌中鉴定获得pseurotin A,并揭示了在真菌中通过对主要次级代谢产物缺失的方法可以鉴定获得新型的化合物。