人胚肝甲胎蛋白多聚核糖体的免疫沉淀分离法

作者用超离心法分离人胚肝的总polysome。通过免疫电镜的观察表明,总polysome中不仅含有合成人AFP的polysome,而且在AFP polysome的新生肽链上已具有AFP的免疫决定簇。用~(125)I体外标记的总polysome,按Shapiro法,Innis法和Schutz法进行免疫沉淀,来分离AFP polysome,所得产物的纯度约在30～40%之间。在进行免疫沉淀反应时,控制抗人AFP抗体的用量是很重要的。使用较低量的抗体不仅可以提高产物的纯度,而且AFPpolysome也沉淀得比较完全。     

重组人骨形态发生蛋白-2抗体的制备及纯化

骨形态发生蛋白-2是骨科研究领域的重要生物蛋白。用重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP₂)与BSA连接成复合物作为免疫原,免疫家兔制备出多克隆抗血清。分别用免疫沉淀法和Sepharose4B-BSA反向免疫亲和吸附法去除抗血清中载体BSA抗体。用盐析法和蛋白层析法纯化出抗rhBMP₂抗体。研究发现,家兔产生高效价抗体的最佳时间为14-16周,从rhBMP₂抗体的特异性、相对纯度及回收率综合分析,免疫沉淀法去除BSA抗体优于反相亲和吸附法。     

大鼠肝癌(BERH-2)细胞甲胎蛋白信使核糖核酸的分离与提纯

采用双抗体免疫沉淀合成AFP的聚核糖体并合Poly(U)-Sepharose亲和层析的方法分离和提纯了大鼠肝癌BERH-2细胞的AFPmRNA。这种纯的AFPmRNA在2％聚丙烯酰胺—0.5％琼脂糖凝胶中以单一的22S带移动。用双抗体免疫沉淀的方法,鉴定麦胚抽提液中由AFPmRNA直接合成的蛋白。在纯甲胎抗体所沉淀的多肽中,有95％的放射性在凝胶电泳中与载体AFP一起移动。在最佳条件下,AFPmRNA在麦胚系统中翻译产物比AFPpRNA高54倍。用AMV反转录酶合成互补于AFP-mRNA的DNA(AFP~3H-cDNA),用分析AFP-mRNA.AFP~3H-cDNA杂化物的热变性来测定AFPcDNA的真实性。高达89℃的Tm值,表明所反转录的cDNA是AFP-mRNA真实的拷贝。     

抗金黄色葡萄球菌IgY的酶解稳定性及活性研究

目的:考察抗金黄色葡萄球菌特异性IgY的酶解稳定性和酶解产物的活性。方法:以灭活的金黄色葡萄球菌免疫产蛋母鸡,抗体经水稀释及盐析分离纯化。抗体在不同条件下经胃蛋白酶或胰蛋白酶消化。抗体及酶解产物的特异性和活性分别用ELISA法和凝集法检测,酶解产物用SDS-PAGE和Western-blotting鉴定。结果:免疫产生的抗体具有特异性,能与金黄色葡萄球菌凝集而抑制其生长。分离纯化后抗体纯度与标准IgY相近。IgY在pH<4时完全酶解;pH等于4时部分酶解生成Fab片断,具有特异性和凝集活性;pH>4时,抗体稳定,不发生酶解。结论:抗金黄色葡萄球菌特异性IgY及其酶解生成的Fab片断,具有特异性和抑菌活性,有望代替抗生素用于细菌感染性疾病的治疗。     

人血浆LDL的分离纯化及兔抗人apoB-100抗体的制备

目的：为分离得到较高纯度的人血载脂蛋白B-100（apoB-100）及制备高效的兔抗人apoB-100抗体。方法：采用两步密度梯度离心分离人血浆得到LDL,产物经6％琼脂糖凝胶（Sepharose-6B）分子筛分离纯化后,再由透析浓缩获得纯化产物即apoB-100,同时用5％聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）电泳鉴定为一条带。用分离纯化得到的apoB-100与完全及不完全福氏佐剂混合,以此作为免疫原经4-3-2—2-1（周）免疫新西兰大白兔,随后心脏取血制备兔抗人apoB-100抗体。结论：分离纯化apoB-100浓度为1．4625mg／ml,制备的兔抗体经免疫双扩散测定其效价为1：32。     

采用杆状病毒/昆虫表达系统纯化蛋白制备抗hUTP14a多克隆抗体

为制备兔抗人hUTP14a多克隆抗体并鉴定其抗体的特异性,本研究通过杆状病毒/昆虫表达系统制备并纯化Flag-hUTP14a-his蛋白,免疫新西兰家兔。ELISA方法检测免疫兔的抗血清滴度达到1∶10~5(体积比)时取血清,并通过Protein A免疫亲和层析柱纯化抗体。在人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)中过表达Flag-hUTP14a,或用小干扰RNA(small interference RNA, siRNA)沉默内源的hUTP14a蛋白表达后,提取细胞总蛋白质。经Western印迹分析制备的多克隆抗体的特异性;通过细胞免疫化学染色、细胞免疫荧光、免疫组织化学染色和免疫沉淀(immunoprecipitation, IP)实验对hUTP14a抗体的特异性进行鉴定。研究证实,制备的抗hUTP14a多克隆抗体能够特异性识别内源及外源表达的hUTP14a蛋白。该抗体可以用于细胞免疫荧光、细胞免疫化学染色、免疫组织化学染色、Western印迹及免疫沉淀等技术,为进一步研究hUTP14a的生物学功能提供了特异性抗体。     

抗甲型流感鸡卵黄抗体的制备及效价测定

目的:研究抗甲型流感卵黄抗体的制备与纯化,并探讨其效价随免疫时间的变化关系。方法:用灭活甲型流感病毒复合抗原免疫蛋鸡,用PEG6000对卵黄抗体进行分离提取,SDS-PAGE法对其进行分子量测定,考马斯亮蓝法对其含量和纯度进行测定,用微量凝集法检测蛋鸡血清抗体和卵黄抗体的效价。结果:提取得到的卵黄抗体重链分子量为66 kDa、轻链分子量分26 kDa,每毫升卵黄液可得到纯度为95.80%的卵黄抗体9.98mg,回收率93.01%;高效价持续时间90 d以上;免疫蛋鸡血清和卵黄中3种特异性抗体的消长规律基本相似,但抗体水平之间存在明显的差异。结论:采用灭活甲型流感病毒复合抗原免疫蛋鸡可制备高效价、高纯度抗甲型流感卵黄抗体,为卵黄抗体在甲型流感防治中的应用研究奠定了基础。     

兔抗人热激蛋白70样蛋白1多克隆抗体的制备与初步鉴定

目的：制备兔抗人热激蛋白70样蛋白1（HSP70L1）的多克隆抗体并进行初步鉴定。方法：在大肠杆菌中重组表达融合蛋白GST-HSP70L1和His-HSP70L1并纯化;将GST-HSP70L1融合蛋白用于免疫新西兰大耳白兔获得多克隆抗体,用His-HSP70L1对抗血清进行分离纯化,得到抗HSP70L1多克隆抗体,用Western印迹、免疫沉淀对其进行初步鉴定。结果：获得了高表达的GST-HSP70L1和His-HSP70L1重组融合蛋白;纯化获得抗HSP70L1抗体,此抗体可用于Western印迹和免疫沉淀实验。结论：获得了兔抗人HSP70L1的多克隆抗体,为进一步研究HSP70L1的生物功能提供了有用的工具。     

人肝癌细胞BEL-7402中热休克蛋白70相伴甲胎蛋白的实验研究

为研究人肝癌细胞BEL-7402中热休克蛋白70(HSP70)与甲胎蛋白(AFP)的相互作用,采用免疫化学和免疫荧光检测HSP70和AFP在肝癌细胞中的表达和定位.HSP70与AFP的相互关系通过免疫共沉淀和蛋白印迹杂交进行分析.结果免疫化学显示人肝癌细胞BEL-7402中存在高水平的HSP70和AFP共表达,均定位于细胞浆.AFP存在于HSP70单抗的免疫沉淀中,而HSP70则存在于AFP单抗的免疫沉淀中.结果表明人肝癌细胞BEL-7402中HSP70与AFP相伴.两者之间的相互关系研究将成为探讨肝癌的发生和免疫治疗的新途径.     

牙鲆甲状腺激素受体TRaA的原核表达和多克隆抗体的制备及应用

为研究牙鲆甲状腺激素受体TRαA在牙鲆变态发育过程中的调控作用,将TRαA基因克隆插入融合表达载体pET30a,并在大肠杆菌Escherichia coli DE3(BL21)中进行诱导表达。表达菌株经1mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导4h后,重组蛋白TRαA表达并形成包涵体。SDS-PAGE和Western blotting检测鉴定表达产物。包涵体经变性后在His-Bind树脂进行亲和层析纯化,柱上复性法对重组蛋白复性,获得纯度较高的目的蛋白,蛋白复性的效果良好。用纯化后的目的蛋白免疫新西兰家兔制备多克隆抗体。Dotblotting检测抗体效价达1:200000,检测证明抗体特异性良好。此外,通过染色质免疫沉淀技术鉴定了在活体细胞中多克隆抗体与TRαA的特异性结合,表明了甲状腺激素通过其受体在体内参与碱性磷酸酶(ALP)基因的转录调控。     

牙鲆甲状腺激素受体TRαA的原核表达和多克隆抗体的制备及应用

为研究牙鲆甲状腺激素受体TRαA在牙鲆变态发育过程中的调控作用,将TRαA基因克隆插入融合表达栽体pET30a,并在大肠杆菌Escherichia coli DE3(BL21)中进行诱导表达.表达菌株经1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导4 h后,重组蛋白TRaA表达并形成包涵体.SDS-PAGE和Western blotting检测鉴定表达产物.包涵体经变性后在His-Bind树脂进行亲和层析纯化,柱上复性法对重组蛋白复性,获得纯度较高的目的蛋白,蛋白复性的效果良好.用纯化后的目的蛋白免疫新西兰家兔制备多克隆抗体.Dot blotting检测抗体效价达1:200 000,检测证明抗体特异性良好.此外,通过染色质免疫沉淀技术鉴定了在活体细胞中多克隆抗体与TRαA的特异性结合.表明了甲状腺激素通过其受体在体内参与碱性磷酸酶(ALP)基因的转录调控.     

采用双抗体免疫沉淀技术分离和提纯大鼠肝细胞白蛋白mRNA

采用双抗体技术和Poly(U)-Sepha-rose 亲和层析法,分离和纯化出为均一的大鼠肝细胞白蛋白mRNA。把酸乙醇—硫酸铵分部和Sephadex G-150柱层析得到均一的大鼠血清白蛋白,免疫家兔得到抗血清,上白蛋白-Sepharose 柱,得到了纯的抗白蛋白抗体。用它与肝聚核糖体一起温育,得到合成白蛋白的聚核糖体。它们之间的结合是高度专一的,似乎是通过核糖体上的初生白蛋白多肽的免疫识别作用所致。反应的免疫复合物用第二抗体追踪,然后把聚核糖体—第一抗体—第二抗体复合物,通过一个不连续的蔗糖梯度,除去未反应的聚核糖体和抗体。用苯酚—氯仿—异戊醇(50∶48∶2)从免疫沉淀中分离出白蛋白聚核糖体RNA,上poly(U)-Sepharose 柱,得到大鼠肝细胞白蛋白mRNA。所分离白蛋白mRNA,在2%聚丙烯酰胺—0.5%琼脂糖凝胶电泳时为一条带。在依赖于mRNA 的麦胚无细胞蛋白合成系统中,所有的翻译产物由第一抗体识别,第二抗体追踪,用凝胶电泳法鉴定为真正的白蛋白——约有70—80%新生白蛋白多肽与天然白蛋白一起移动。麦胚抽提物的翻译分析表明,提纯的白蛋白mRNA 的活力可高达白蛋白pRNA 的53倍。     

母体外周血中胎儿有核红细胞的分离和富集方法的研究进展

母体外周血中分离的胎儿有核红细胞（fNRBCs）包含胎儿完整的遗传信息,可用于无创产前诊断。fNRBCs的分离和富集方法主要分为三类：物理分选法、抗原-抗体结合分离法和增殖法。不同的方法获得的fNRBCs的数量和纯度不同,多种方法联合使用可以提高富集产物中fNRBCs的纯度和数量。本文就母体外周血中fNRBCs的分离和富集方法进行综述。     

人可溶性CD14基因克隆表达及功能研究

利用反转录PCR技术,从U937细胞总RNA中,扩增编码人可溶性CD14的基因序列,构建了重组表达质粒pEF1/HisC/sCD14^348aa;用脂质体转染法,实现了在真核细胞中的高效表达;用免疫亲和层析纯化表达产物,纯度达90％以上;PLS刺激U937细胞产生CD14的变化,证明了表达产物具有结合LPS的功能。     

水稻谷氨酰胺合成酶同工酶免疫学性质比较研究

用纯化的水后（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．）根部存在的两种谷氨酰胺合成酶（ＧＳ）同工酶ＧＳｒａ和ＣＳｒｂ分别免疫兔子,得到相应的抗体。免疫扩散和免疫印迹实验表明,ＣＳｒａ、ＧＳｒｂ的抗体对ＧＳ及其同工酶是的。免疫沉淀试验表明,ＧＳｒａ、ＧＳｒｂ不仅识别它的相应的抗原,而且也能很好地识别彼此的抗原。这两种抗体也能较好地识别水稻叶片胞液型的ＧＳＴ,但对水稻叶片和菠菜（Ｓｐｉｎａｃｉａ ｏｌｅｒａｃｅ     

红笛鲷仔鱼体内特异性母源抗体降解动力学研究

应用山羊IgG免疫红笛鲷亲鱼,人工催产孵化出仔鱼后,用双抗体夹心法检测仔鱼特异性抗体的降解过程,发现抗体水平随时间变化呈下降趋势且可以持续7d,每尾仔鱼特异性抗体降解量约0.001μg,最低检测限为0.482μg/mL。采用饱和硫酸铵分步盐析与亲和层析等方法纯化红笛鲷仔鱼特异性抗体,结果显示,盐析仔鱼特异性抗体最理想的硫酸铵饱和度为40%－50%;亲和层析分离到两个明显独立的层析峰。SDS-PAGE证明纯化的抗体具有极高纯度,其L、H链分子量分别为29 kD和77.5 kD,抗体分子量约为852 kD。该抗体不仅能够与山羊IgG产生特异性免疫反应,而且能与兔抗红笛鲷IgM抗血清产生免疫反应,因而认为红笛鲷母源抗体可以垂直转移至仔鱼。     

虎血清免疫球蛋白（IgG）的纯化及纯度、活性鉴定

目的 建立高纯度、高活性的虎血清IgG纯化方法。方法 用饱和硫酸铵沉淀虎血清得到IgG粗品;结合Hitrap Protein A亲和层析预装柱及阴离子交换层析法对粗品IgG进一步分离纯化,采用PAGE电泳和Western-Blot免疫印迹法鉴定IgG纯度和免疫活性。结果 80 mL虎血清亲和纯化得到84 mg IgG,阴离子交换层析纯化得到30 mg虎的IgG纯品。结论 建立了简便快速、纯度高、活性好的虎血清IgG的分离纯化方法,为虎血清IgG二级抗体的制备提供了高纯度、活性好的一级抗体免疫原。     

重组猪卵透明带抗原pZP3a在毕赤酵母中的分泌表达

为制备rpZP3a蛋白供发展避孕疫苗研究,将编码天然提取pZP3a上的DNA序列（446—1423）插入至毕赤酵母分泌型表达载体pPICZaA上,重组质粒pPICZaA—pZP3a线性化后通过电穿孔转入毕赤酵母GS115,经抗生素Zeoein筛选获得工程菌。在2L发酵罐中,用甲醇诱导工程菌进行高密度发酵生产rpZP3a。分离浓缩发酵上清液,通过螯合铜离子的亲和柱纯化rpZP3a,用SDS-PAGE和Westernblot进行鉴定,以Quantity One软件对rpZP3a进行定量分析并计算纯度和回收率。用rpZP3a免疫家兔,以ELISA法和间接免疫荧光法检测抗血清对rpZP3a和猪卵透明带的抗体反应。获得了分泌表达rpZP3a的工程菌,其高密度发酵产物经分离纯化后获得能与抗pZP3抗体反应的46kD成分,命名为rpZP3a,平均产量为8mg／L,纯度达92％。回收率为63％。用其免疫家兔获得抗rpZP3a抗血清,ELISA测定显示能与rpZP3a和天然提取pZP3反应。间接免疫荧光法分析显示抗rpZP3a抗血清能与猪卵透明带反应,产生亮绿荧光。用酵母表达系统成功表达了rpZP3a,该蛋白保留有天然pZP3的免疫活性。     

重组猪卵透明带抗原pZP3α在毕赤酵母中的分泌表达

为制备rpZP3α蛋白供发展避孕疫苗研究,将编码天然提取pZP3α上的DNA序列(446~1423)插入至毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA上,重组质粒pPICZαA-pZP3α线性化后通过电穿孔转入毕赤酵母GS115,经抗生素Zeocin筛选获得工程菌。在2L发酵罐中,用甲醇诱导工程菌进行高密度发酵生产rpZP3α。分离浓缩发酵上清液,通过螯合铜离子的亲和柱纯化rpZP3α,用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定,以Quantity One软件对rpZP3α进行定量分析并计算纯度和回收率。用rpZP3α免疫家兔,以ELISA法和间接免疫荧光法检测抗血清对rpZP3α和猪卵透明带的抗体反应。获得了分泌表达rpZP3α的工程菌,其高密度发酵产物经分离纯化后获得能与抗pZP3抗体反应的46kD成分,命名为rpZP3α,平均产量为8mg/L,纯度达92%,回收率为63%。用其免疫家兔获得抗rpZP3α抗血清,ELISA测定显示能与rpZP3α和天然提取pZP3反应。间接免疫荧光法分析显示抗rpZP3α抗血清能与猪卵透明带反应,产生亮绿荧光。用酵母表达系统成功表达了rpZP3α,该蛋白保留有天然pZP3的免疫活性。     

抗生殖器疱疹病毒卵黄免疫球蛋白(IgY)的研究

检测了鸡卵黄中抗生殖器疱疹病毒(HSV-2)抗体的产量、纯度、来源及稳定性。采用生殖器疱疹病毒(HSV-2)作为抗原免疫广州黄村鸡。通过改良水稀释法提取卵黄中的IgY。双紫外光波长测定抗体含量,SDS-PAGE电泳检测抗体纯度。Western blot免疫印迹法测定该抗体来源。ELISA检测IgY对温度、酸碱度的稳定性。结果,蛋黄液中抗体质量浓度13.6g.L-1,抗体纯度达96.2%。免疫印迹证明IgY与鸡血清中的IgG具有相同的分子量和抗原性。IgY具有良好的热稳定性,对酸碱具有一定的耐受力。WD水稀释法能得到高产量、高纯度的特异性IgY,而且有良好的生物学活性。