基于16S-23S rDNA 间隔区序列（ITS）、REP序列的基因指纹图谱及UPGMA聚类法的拟诺卡菌属分类方法

拟诺卡菌属（Nocardiopsis）是拟诺卡菌科（Nocardiopsaceae） 的唯一属．该属内进行物种鉴别时通常是在多相分类方法基础上,以全基 因组杂交同源性在70%以下的为不同物种,此为国际公认的定种标准;但在 进行大量菌株的比对时操作比较复杂,于是多种基于DNA的基因图谱技术发 展起来．本实验利用适宜引物,对拟诺卡菌属15株基准株基因组DNA的16S -23S rDNA 间隔区序列（ITS）和REP序列进行了扩增,获得了两种基因指 纹图谱,同时根据UPGMA聚类法构建了相应的进化距离树图．结果表明,对 于拟诺卡菌属中不同物种的区分,两种基因图谱技术的分辨力相当,均可 以较好的呈现物种间差异,可以作为拟诺卡菌属菌株多相分类的组成部分 ,应用于物种水平的分类与鉴定．     

诺卡氏菌科的分类研究I．拟诺卡氏菌属中的一个新种

对4．215菌株进行形态、培养特征、生理生化特性等方面的研究结果表明,该菌株基丝有横隔,断裂,茉莉黄,风帆黄,无气丝,细胞壁化学组份III型,糖类型C(即无特征性糖),无诺卡氏菌特征性类脂A。因此,认为该菌株为拟诺卡氏菌属中的一个新种,定名为略黄拟诺卡氏菌 Nocardiopsis flavidus n. sp.。     

节丛孢属丝孢菌对松材线虫和拟松材线虫的捕食

利用节丛孢属捕食线虫真菌的8个种,11个菌株,对松材线虫（Bx）和拟松材线虫（Bm）进行了捕食力的测定。结果显示节丛孢属真菌对这两种线虫的捕食能力既存在种间差异,也存在同种不同菌株间的差异。指状节丛孢的3个菌株Ad－1,Ad－2,Ad－3菌株对两种线虫均表现出较高的捕食率,接川7d后对Bx和Bm的捕食率分别达到了98．08％,91．16％,86．3％和96．28％,90．45％,85．38％;同一菌株对松材线虫和拟松材线虫的捕食没有选择性。此外,通过对松材线虫和拟松材线虫繁殖真菌的筛选实验,肯定了利用拟松材线虫代替松材线虫进行生防菌株筛选的可行性。     

糖蜜草(Melinis minutiflora Beauv.)内生固氮菌分离鉴定

糖蜜草（Melinis minutiflora Beauv．）是热带地区的一种优良牧草。采用选择性培养基在厌氧和好氧两种培养条件下,从糖蜜草根、茎中都可分离得到具有较强固氮酶活性的菌株。通过SDS-PAGE全细胞蛋白电泳技术快速聚类分析表明,来源于糖蜜草中的菌株为同一类群。16S rDNA序列分析和总DNA的G＋c％含量进一步确定糖蜜草中所分离的菌株属于固氮螺菌属（Azospirillum）,与产脂固氮螺菌（Azospirillum lipoferum）亲缘关系较近。BIOLOG板测定结果显示,糖蜜草菌株TMCY243对多种碳源具有很强的适应性,与产脂固氮螺菌（A．lipoferum）的模式菌株DSM 1691存在着较大的差异。以上结果表明,糖蜜草内生固氮菌为固氮螺菌属的一个新类群。     

广西沿海地区红树林根系土壤中放线菌的分离与鉴定

本研究通过分离纯培养,从广西北海及防城港红树林根系土壤中分离出放线菌并提取其总DNA,用放线菌通用引物对获得菌株的16S rDNA进行PCR扩增,对获得的扩增产物进行DNA序列测定及菌株鉴定.研究结果表明,从红树林根系土壤样品中分离出15株典型放线菌菌株.16S rDNA测序比对鉴定结果显示,15株典型放线菌菌株中有12株属于链霉菌属(Streptomyces),是常见菌属;3株属于拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis),为稀有放线菌.本研究分离纯化获得15株典型放线菌,初步揭示了广西沿海地区红树林土壤中放线菌的多样性.     

松材线虫伴生菌中产纤维素酶细菌的筛选、鉴定及其相关基因的克隆

[目的]从松材线虫伴生菌中筛选出高效降解纤维素的细菌菌株,初步鉴定后,对其相应的纤维素酶基因尝试克隆.[方法]首先从河南南阳松材线虫病疫区采集到的木材样本中,分离获得松材线虫.采用刚果红平板初筛法,从松材线虫伴生菌中获得具有分泌较高活性纤维素酶的细菌菌株.基于该菌株的形态学、生理学及16 s rDNA序列特征等对高活性菌株进行分类鉴定.设计兼并引物,从高活性菌株中克隆该菌株的纤维素酶基因,并进行序列分析.[结果]获得7株具有分泌较高活性纤维素酶的细菌菌株,其中编号为C8的菌株酶活最高.经鉴定该菌株归为肠杆菌属,命名为Enterobacter sp.C8.进一步从C8菌株中成功克隆出该菌株的一个全长1104 bp的纤维素酶基因(GenBank JQ845065),在NCBI比对后发现该基因分别与产气肠杆菌( Enterobacter aerogenes) KCTC 2190的纤维素合成酶亚单位BcsC的核苷酸序列有97％的同源性,氨基酸序列有92％的同源性 ;与克雷白氏肺炎菌(Klebsiella pneumoniae)的endo-1,4-D-glucanase基因有82％的同源性,与不可培养的细菌内切纤维素酶基因有82％的同源性.[结论]本文首次从松材线虫伴生菌中筛选到了一株简单的产纤维素酶的细菌菌株并从中克隆出了一个新型纤维素酶基因,为下一步进行新能源的利用奠定了理论基础.     

一株高毒力致病杆菌CB6的鉴定

从北京郊区果园采集的小卷蛾斯氏线虫（Steinernema carpocapsae）肠道内分离到一株具有较强杀虫和抑菌活性的致病杆菌菌株CB6。形态特征及生理生化特征测定结果表明,CB6菌株与致病杆菌属（Xenorhabdus）中的嗜线虫致病杆菌（X. nematophila）种的特征基本一致。测定了该菌株的16S rRNA序列并根据16S rRNA序列构建了系统发育树;在系统发育树中,CB6菌株与嗜线虫致病杆菌其他4个菌株形成一个类群,序列同源性大于99%。但CB6菌株的酪氨酸酶、脂酶（蛋黄）的产生、核糖产酸等生化特征与嗜线虫致病杆菌种内的其他菌株存在一定的差异,且具有更强的杀虫和抑菌活性。因此认为CB6菌株是嗜线虫致病杆菌的一个变种,命名为嗜线虫致病杆菌北京变种（X. nematophila var. pekingensis）。     

仙居县儿童下呼吸道感染肺炎克雷伯菌耐药性分析

目的分析仙居人民医院住院下呼吸道感染患儿临床分离肺炎克雷伯菌的耐药特征,为临床合理用药提供依据。方法选择2012年7月至2013年7月该院下呼吸道感染肺炎克雷伯菌阳性患儿81例。对患儿的临床一般资料进行分析,对临床分离菌株进行细菌鉴定,用18种抗生素进行药敏试验,采用WHONET5．4分析软件进行统计。结果2012年7月至2013年7月共分离出81株肺炎克雷伯菌,ESBLs阳性42株,检出率为51．85％。所有菌株对亚胺培南、厄他培南、左旋氧氟沙星、丁胺卡那100％敏感。对氨苄西林耐药率为100％。ESBLs阴性菌株对氨曲南、头孢曲松、头孢他啶、头孢唑啉、头孢吡肟100％敏感,而ESBLs阳性菌株则100％耐药。ESBLs阴性菌株对其他抗生素的耐药率为氨苄西彬舒巴坦（12．82％）、环丙沙星（2．56％）、头孢替坦（O％）、呋喃妥因（20．51％）、庆大霉素（5．13％）、复方新诺明（17．85％）、妥布霉素（2．56％）、哌拉西林／他唑巴坦（2．56％）;ESBLs阳性菌株对其他抗生素的耐药率为氨苄西林／舒巴坦（73．80％）、环丙沙星（2．38％）、头孢替坦（16．67％）、呋喃妥因（61．90％）、庆大霉素（28．57％）、复方新诺明（54．76％）、妥布霉素（7．14％）、哌拉西林／他唑巴坦（7．14％）。结论本地区患儿中肺炎克雷伯菌耐药性较高,临床应重视病原菌的检测。     

大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌ESBLs检测及耐药性分析

由细菌超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）引起的细菌耐药性一直是临床相关感染性疾病治疗中的棘手问题。从不同病区患者标本中分离了96株大肠埃希菌和80株肺炎克雷伯菌,分剐采用双纸片协同试验和药物敏感试验检测了上述菌株产生ESBLs情况及对17种抗生素的耐药性。结果发现,27．1％（26／96）的大肠埃希菌株和22．5％（18／80）肺炎克雷伯菌株产ESBLs。ICU病房分离的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌株ESBLs总阳性率（46．0％）与介入科病房和烧伤科病房分离菌株ESBLs总阳性率（28．6％和25．0％）无显著性差异（P〉0．05）,但明显高于呼吸科、骨科、其他病房及门诊部分离菌株ESBLs总阳性率（6．3％～14．3％,P〈0．01）。不产ESBLs大肠埃希菌株和肺炎克雷伯菌株对17种抗生素耐药率明显低于产ESBLs菌株。产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对氨曲南均敏感,对氨苄西林／舒巴坦、阿莫西林／棒酸、阿米卡星耐药率仅为15．8％-23．4％。上述实验结果提示,大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌临床菌株中有较高的ESBLs阳性率,不同病区患者感染的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌ESBLs阳性率有很大差异,氨曲南、氨苄西林／舒巴坦、阿莫西林／棒酸、阿米卡星可作为治疗产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌感染性疾病的首选药物。     

南极嗜冷假单胞菌7197 S- 腺苷同型半胱氨酸水解酶 ( SAHH) 基因的克隆与序列分析

从南极普利兹湾深海沉积物中筛选到一株耐冷菌株7197,其16S rDNA序列分析表明该菌株属于假单胞菌属（Pseudomonas）。作者通过设计引物,从该菌的全基因组DNA中克隆到编码S-腺苷-L-高半胱氨酸（SAHH）的完整ORF,全长为1424bp。使用DNAMAN（5,1）软件对全长ORF为1424bp的SAHH基因进行分析,SAHH基因编码一个由474AA残基组成、分子量预计为52523Da的SAHH蛋白质,与Psychrobacter sp．273—4的SAHH有96．84％的相似性;与Acinetobacter sp．ADP1的SAHH有79％的相似性;与Pseudomonas fluorescens Pf-5的SAHH有75％的相似性。     

<Emphasis Type="Italic">Nocardiopsis yanglingensis</Emphasis> sp. nov., a thermophilic strain isolated from a compost of button mushrooms

A strain named A18 was recovered from a compost of button mushrooms. It was characterized using a polyphasic approach. On the basis of 16S rRNA gene sequence comparison, it belonged to the genus Nocardiopsis and was most closely related to the type strains of Nocardiopsis flavescens (sequence similarity 98.0%), Nocardiopsis prasina (97.5%), Nocardiopsis metallicus (97.4%), Nocardiopsis alba (97.3%). The combination of phylogenetic analysis, DNA–DNA hybridization, phenotypic characteristics and chemotaxonomic data supported the proposal that strain A18 represents a new species of the genus Nocardiopsis, for which the name Nocardiopsis yanglingensis sp. nov. was proposed (type strain A18^T = KCTC 19723^T = CCTCC 209063^T).     

新疆泥火山产酶嗜盐放线菌的筛选及多样性

[目的]了解新疆乌苏泥火山嗜盐放线菌及其产酶功能多样性.[方法]分别采用含有5%与10%NaCl的5种分离培养基,稀释平板涂布法对泥火山土壤样品进行分离;利用五种筛选培养基定性检测酶活性;在形态特征、耐盐性实验及16S rDNA基因测序的基础上进行系统发育学分析.[结果]获得嗜盐放线菌43株,极端嗜盐放线菌3株.4株嗜盐放线菌产脂肪酶,30株产半乳糖苷酶,27株产淀粉酶,6株产酯酶,4株产纤维素酶,1株同时产4种酶.系统发育学分析结果表明其中24株为拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis),1株为链霉菌属(Streptomyces).产两种酶的菌株10006与Nocardiopsis exhalans(AY03600)相似性为96.64%(小于97%),可能是潜在的新种.[结论]本研究表明新疆乌苏泥火山中存在大量的产半乳糖苷酶及淀粉酶的嗜盐放线菌,所分离到的拟诺卡氏菌属产酶多样性比较高,并且潜藏着新的微生物资源.     

Isolation of toxigenic Nocardiopsis strains from indoor environments and description of two new Nocardiopsis Species, N. exhalans sp. nov. and N. umidischolae sp. nov

Nocardiopsis strains were isolated from water-damaged indoor environments. Two strains (N. alba subsp. alba 704a and a strain representing a novel species, ES10.1) as well as strains of N. prasina, N. lucentensis, and N. tropica produced methanol-soluble toxins that paralyzed the motility of boar spermatozoa at <30 microg of crude extract (dry weight) x ml(-1). N. prasina, N. lucentensis, N. tropica, and strain ES10.1 caused cessation of motility by dissipating the mitochondrial membrane potential, Deltapsi, of the boar spermatozoa. Indoor strain 704a produced a substance that destroyed cell membrane barrier function and depleted the sperm cells of ATP. Indoor strain 64/93 was antagonistic towards Corynebacterium renale. Two indoor Nocardiopsis strains were xerotolerant, and all five utilized a wide range of substrates. This combined with the production of toxic substances suggests good survival and potential hazard to human health in water-damaged indoor environments. Two new species, Nocardiopsis exhalans sp. nov. (ES10.1T) and Nocardiopsis umidischolae sp. nov. (66/93T), are proposed based on morphology, chemotaxonomic and physiological characters, phylogenetic analysis, and DNA-DNA reassociations.     

1株抗根结线虫红树林放线菌的筛选与鉴定

从红树林底泥中分离筛选具有抗线虫活性的放线菌,并对活性菌株进行分类鉴定。采用稀释平板法分离放线菌,采用24孔板液体筛选模型筛选具有抗线虫活性的菌株,并对活性菌株进行形态学和生理生化特征研究,测定其16S rDNA序列并进行系统发育分析。筛选得到1株具有杀线虫活性的菌株,编号为HA11090,该菌株发酵液在稀释20倍和40倍后,抗根结线虫校正死亡率分别为70.5%和65.0%。菌株HA11090的16S rDNA序列与Saccharopolyspora hirsuta subsp.kobensis和Saccharopolyspora jiangxiensis的相似性最高,分别为99.35%和99.27%,三者在系统发育树上聚为一个分支,形态和生理生化特征分析显示,菌株HA11090与Saccharopolyspora jiangxiensis基本一致,而与S.hirsuta subsp.kobensis差异较大。鉴定菌株HA11090为Saccharopolyspora jiangxiensis,其发酵液具有较强的抗根结线虫活性,值得进一步研究。     

广西山口红树林内生放线菌的分离、筛选及初步鉴定

从广西山口国家红树林生态自然保护区采集8种真红树植物和5种半红树植物的根、茎、叶及胚轴等组织样品共计41份。经过表面消毒后粉碎,分别以几丁质、腐殖酸、木聚糖等作为主要营养及能量来源设计了8种分离培养基,从植物组织中分离得到118株放线菌。使用6种新药筛选模型对分离菌株进行了生理活性筛选,77株放线菌的发酵液样品在一个或多个药物筛选模型中显示为阳性,初筛阳性率为65.3%。对77株筛选阳性菌株进行的初步分类研究结果显示,其中44株属于链霉菌属,25株为小单孢属的菌株,3株属于糖丝菌属,3株为诺卡氏属菌株,1株是拟诺卡氏属菌株,1株是伦茨氏菌属的菌株。对一株在抗多重耐药检定菌HH22和降血脂模型上都显示出良好活性的菌株I07A-01824进行表型和基因型分析,确定I07A-01824为黄白链霉菌(Streptomyces albidoflavus)菌株。该研究显示,红树植物内生环境不仅仅孕育了丰富多样的内生放线菌,而且红树植物内生放线菌也是新型天然生理活性次级代谢产物的有效来源。     

Haemagglutination activity of toxigenic and non-toxigenic strains of Clostridium difficile

Abstract Cell extract of Clostridium difficile strains was fractionated by ammonium sulfate precipitation and sulfated cellulofine column chromatography to detect haemagglutination (HA) activity. HA activity without cytotoxicity was detected in fractions eluted at 0.79–0.91 M NaCl in sulfated cellulofine column chromatography of the cell extract in both toxigenic strain VPI 10463 and non-toxigenic strain KZ 1678, while toxin A was detected in fractions eluted at 0.27–0.29 M NaCl. Antisera were prepared with HA substance-containing fractions of the chromatography. Antiserum to the HA substances(s) of strain VPI 10463 neutralised the HA activity of the fractions of strains VPI 10463 and KZ 1678 at nearly the same titres. Antiserum to the HA substance(s) of strain KZ 1678 also neutralised the HA activity of both strains at nearly the same titres as above. These findings suggest that haemagglutinin(s) is commonly produced by C. difficile strains irrespective of toxin A-producing ability.     

Development of a vector and host system and characterization of replication of plasmid pSQ10 in moderately halophilic Nocardiopsis

The genus of Nocardiopsis is a new source of antibiotics, chemicals, and enzymes. Here we reported the development of a vector and host system in moderately halophilic Nocardiopsis via an oriT-mediated conjugation. By screening about 80 Nocardiopsis strains, 6 of them harbored 8 plasmids (18-80 kb). The complete nucleotide sequence of pSQ10 consisted of 18,219 bp, with 71.9% G + C content, encoding 17 open reading frames, 5 of them resembled those of Streptomyces plasmids. A rep locus (iteron within the gene) was identified for replication in Nocardiopsis sp. YIM 90083, and rep protein bound to its iteron sequence. This system may be useful for gene cloning and expression in Nocardiopsis.     

抗肿瘤海绵放线菌的分离及菌株HA01184的鉴定

目的：对采自海南、湛江等海域的海绵样品进行放线菌选择性分离,采用其发酵液进行抗肿瘤活性筛选,并对活性较好的菌株进行鉴定。方法：用含50μg／mL重铬酸钾为抑制剂的海水高氏一号合成培养基分离培养海绵放线菌;以MTT法进行菌株的抗肿瘤活性筛选;通过培养特征、形态特征、生理生化特征、16S rDNA序列测定及系统发育分析,对菌株HA01184进行鉴定。结果与结论：海水高氏一号合成培养基用于海绵放线菌分离培养具有很好的选择性,从海绵样品中共分离得到放线菌165株,细胞毒活性达80％以上的阳性菌株有10株,其中菌株HA01184的发酵液细胞毒活性为90％。结合形态观察、生理生化特征和16S rDNA序列比对分析,将HA01184归于链霉菌属,可能是来自海洋环境的一个潜在新种。     

Protein homology modeling and structure-function relationship of 2009 swine influenza virus hemagglutinin (HA1): more human than swine

The virulence and transmissibility of viruses are highly associated with their binding specificity to the host cell receptor. In influenza, this initial event of viral pathogenesis is mediated by a glycoprotein known as hemagglutinin (HA). In the present study we constructed homology models of the chain A of hemagglutinin (HA1) of 2009 swine influenza strain. The modeled proteins were compared with atomic coordinates of 1918 (Spanish flu strain) and 1930 HA1 (swine influenza strain). HA1 of recent swine influenza strain showed 84.83% and 93.14% homology with the same versions of 1918 and 1930 strains, respectively. Discrepancies in multiple sequence alignment particularly at the ligand-binding residues notified its receptor specificity to α-2,6 sialic acids in 1918 and 2009 viral strains in contrast to α-2,3 sialic acids as found in 1930 swine flu strain. This implicated the relatively closer relationship of 2009 strain with 1918 strain rather than swine origin strain of 1930. Similarly, the spatial orientations of receptor-binding residues, located in 190-helix, 130-loop and 220-loop, were found more aligned in 1918 and 2009 (RMSD 0.98 Å) than in 1930 and 2009 (RMSD 1.06 Å) strains HA1. More similarities were established between both human origin influenza viruses (1918 and 2009 strains) by the receptor-binding cavity architecture and the orientation of protease cleavage site (Arg327). Briefly, the present finding is expected to show molecular discrepancies and congruencies among the recent and past pandemic influenza strains and may also potentially illustrate the drug targets to rein the infection at earlier stages.     

广东地区流感H3N2毒株血凝素基因特征、进化和变异分析

为揭示广东地区2007～2010年甲型H3N2毒株血凝素(HA)基因特征和变异,采用时空抽样方法抽样,检测广东2007～2010年甲型H3N2毒株HA基因核苷酸序列,同时检索全球HA基因序列作为对照,采用Lasergene 7.1和Mega 5.05软件对HA基因核苷酸序列进行比对和分析;并结合流行病学资料,对变异毒株进行进化速度分析;同时进行抗原分析。结果发现,广东2007～2010年H3N2毒株HA基因同义进化(Ks)和错义进化(Ka)速度分别为2.06×1E-3～2.23×1E-3核苷酸/年和1.05×1E-3～1.21×1E-3核苷酸/年,HA1较HA2的错义突变速率要高3.13倍。与疫苗株A/Perth/16/2009的HA基因比较,2009年广东毒株同源性达到98.8%～99.7%、2010年同源性达到98.0%～98.4%。在广东2007～2010年毒株中,HA1五个抗原表位均有氨基酸位点变异,尤其是2010年毒株B区(N160K)和D区(K174R/N)的变异;此外,广东2010年毒株受体结合部位(RBS)还发生K189E/N/Q和T228A置换变异;两个糖基化位点变异影响到抗原性;目前使用的H3N2疫苗株与目前流行毒株的抗原性有差异。广东地区2007～2010年的毒株中,血凝抑制抗体的抗原分析结果有差异。结果提示,目前广东乃至全球甲型H3N2毒株HA1B区和D区均有氨基酸位点变异,RBS的两个位点发生置换,糖基化位点变异影响到表位A区和B区抗原性;与WHO推荐2011年流感H3N2毒株疫苗株比较,目前流行毒株HA基因有抗原位点变异。