昆虫杆状病毒多角体基因在原核细胞中的表达

昆虫杆状病毒的多角体基因(ocu)主要用于构建转移载体。目前,已有许多利用此类载体表达外源基因的报道,但尚未见到ocu基因本身在原核细胞中表达的资料。 从大尺蠖核型多角体病毒(BsNPV)DNA获得含有ocu基因的BamH I—H片段(2.3kb),将其与表达载体pDR540重组,从被检的转化菌落中发现两个阳性重组体(pBS7d和pBS31d),它们能在大肠杆菌细胞中表达多角体蛋白。     

葡萄白藜芦醇合成酶基因的克隆

为了构建白藜芦醇合成酶(RS)基因的克隆载体,用PCR技术从葡萄叶片总DNA中扩增出RS基因全长,然后将其重组到克隆载体中。通过酶切对重组质粒进行了鉴定和测序,结果表明,RS基因已经正确克隆至pUC19中,将重组质粒转入大肠杆菌里,使RS基因能够在大肠杆菌里保存并且大量扩增,为RS基因构建表达载体表达白藜芦醇合成酶奠定了基础。     

重组人脑源性神经营养因子在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化

按照人脑源性神经营养因子(hBDNF)基因成熟肽编码序列设计合成引物,从人基因组DNA中扩增出360bp的片段,插入到改构载体pTIG-trx上,获得了pTIG-trx—BDNF原核表达重组质粒,限制性酶切分析和DNA序列测定均证实该克隆插入片段为hBDNF基因成熟肽编码序列。将该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,在大肠杆菌表达系统中获得了高效可溶表达,并对表达产物进行了分离纯化,得到纯度大于83％的样品,Western杂交证实该蛋白具有hBDNF抗原活性。     

抗马铃薯晚疫病质粒的分子克隆及其体外PCR扩增

从一株假单胞菌中分离其质粒DNA，并将其转化到大肠杆菌DH5α中。通过晚疫病抑菌实验证明此菌对马铃薯晚疫病有很强的抑制作用，对该质粒进行纯化和限制性酶切位点分析，将此质粒重组到含有绿色发光蛋白基因的质粒载体中。获得的重组质粒在体外经PCR扩增证明抗晚疫病的重组质粒已克隆到含有绿色光蛋白基因的质粒载体中。     

生物工程技术讲座[八]

应用微细胞检测基因产物的方法由于质粒和噬菌体等的DAN分子能在细胞内进行自我复制,以及DNA重组技术的普及,质粒DNA做为异源性DNA分子的载体,在基因工程中目前已被广泛应用。在克隆或分析真核生物或原核生物的多种不同基因时,常用检测基因表达来确定其存在。把含有某一目的基因的DNA片段和载体质粒的DNA进行重组,再通过重组DNA在受体细胞中的转录、翻译、     

胡萝卜软腐欧文氏菌中信号分子合成酶expI基因的克隆、表达及其分析

用PCR方法从胡萝卜软腐欧文氏菌的基因组DNA中扩增出信号分子合成酶expI基因,将其克隆到大肠杆菌表达载体pET-28α(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3),获得高效表达expI基因的重组大肠杆菌BL21(pET28α-expI).重组菌经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测表达蛋白相对分子质量约为24.8kD,与预期分子量相符.经薄层层析和高效液相色谱分析发现该重组菌产生的信号分子种类为N-3-羰基己酰高丝氨酸内酯和N-己酰高丝氨酸内酯与胡萝卜软腐欧文氏菌产生的一致.     

小鼠Nanog基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

按照nanog基因编码序列设计合成引物,利用RT-PCB从小鼠的囊胚期胚胎中扩增得到该 基因,并将该基因克隆到pET-28b(+)载体上,获得pET-28b(+)-nanog原核表达重组质粒,限制 性酶分析和DNA序列测定均证实该克隆插入片段为nanog基因编码序列。重组质粒转化大肠杆 菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,在大肠杆菌表达系统中获得了高效表达,western杂交证实该 蛋白具有6-His抗原活性,从而证实目的蛋白为Nanog蛋白。     

S-腺苷甲硫氨酸合成酶在大肠杆菌中的克隆与表达

目的:克隆与表达大肠杆菌S-腺苷甲硫氨酸合成酶的基因。方法:应用PCR技术从E.coliBL21(DE3)的总DNA中扩增出1.1kb的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因,将其连接到PGEMT载体上,测序证明正确后再将目的基因插入大肠杆菌高表达载体PET28a中,含有目的基因的重组质粒在大肠杆菌中进行表达与分析。结果:SAM合成酶在E.coliBL21(DE3)中的表达量达到23.6%,酶活达到4.17μmol/h.ml。结论:大肠杆菌表达出了具有生物活性的S-腺苷甲硫氨酸合成酶。     

里氏木霉半纤维素酶基因的克隆

通过PCR技术从里氏木霉基因组中扩增出基因xyn I,把基因与大肠杆菌质粒相连接,再把重组的质粒转入到感受态的Top10大肠杆菌中,待Top10大肠杆菌产生大量的重组质粒后,用中量制备质粒DNA方法把重组的质粒提取出来,再用双酶切方法检验重组质粒。实验结果显示,已经得到含有重组质粒的大肠杆菌菌落,完成了xyn I基因的克隆。     

酵母脯氨酸合成酶基因(Pro2)的分离及Leu~+ Pro~+表型共转导

酵母7209-1 A(a)DNA,用pHC79为载体,以BamHⅠ、PstⅠ和Hind Ⅲ酶切,经体外重组和包装后,转导至大肠杆菌HB101和SC294中。在我们的实验条件下(对酵母DNA适度酶解,F/V值为15,连接时DNA总浓度为200—250微克/微升以及BHB 2688/BHB2690比值为5),重组建库效率达到10~6CFU/微克载体DNA,重组子双抗值降低到10％或5％以下。 大肠杆菌HB101和SC 294的10~6个重组体克隆中,观察到酵母基因对leuB 6及proA2(在HB101中),leu6,metB1,argG,his1(在SC294中)等营养缺陷型的互补(校正)效应。由于互补频率(10~(-3)—10~(-4))比上述基因突变自发回复率高2—3个数量级,因此可以说,酵母的上述基因在大肠杆菌中获得了功能表达。对pYeleu5和pYeleu7单克隆DNA的再次包装转导和再次互补测试表明,我们已使酵母leu~+的互补效率提高10~4倍。本文还报道了在HB101中的酵母基因文库Leu~+ Pro~+的表型共转导现象,频率为30％以上。     

应用Red重组工程技术建立asd基因缺失的大肠杆菌DH10B菌株

目的:建立一株新遗传表型的大肠杆菌DH10BΔasd菌株。方法:应用pKD46介导的重组系统、kan/kil选择反选择系统、双链线性DNA重组技术和重叠引物介导的DNA重组技术,在菌株DH10B体内,对其染色体上的asd基因进行了基因敲除。结果:建立了一株二氨基庚二酸(DAP)营养缺陷型重组大肠杆菌DH10BΔasd。结论:为进一步建立以大肠杆菌DH10B为载体的DNA疫苗或基因治疗载体奠定了基础。     

大肠杆菌glgC基因的克隆及原核表达

以大肠杆菌BL21染色体DNA为模板,根据glgC基因的全序列设计了1对引物,在优化的PCR反应条件下扩增出了glgC基因片段,测序结果显示该片段大小为1296 bp,编码432个氨基酸残基。将该基因克隆到原核表达载体pET-28a-c( )中,重组载体pET-glgC转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳鉴定,得到了与理论推算的glgC基因表达产物分子质量(约53 kD)相符的特异蛋白条带。     

遗传工程的成就和展望

遗传工程一般是指将外源基因与DNA载体结合,形成重组DNA,然后引入到受体细胞,使外源基因复制并产生相应基因产物的技术,亦称为基因工程或重组DNA技术。也有人把细胞融合和染色体工程包括在遗传工程的范畴之内。 五十年代和六十年代分子遗传学的蓬勃发展,使人们搞清了基因的本质以及遗传信息复制和传递的机制,再加上七十年代初限制性内切酶的发现,基因分离技术的进展和细胞转化方法的建立,使遗传工程这门定向改造生物的新技术应运而生。1973年,Cohen等使大肠杆菌的抗四环素质粒和抗链霉素质粒在试管中重组,并在大肠杆菌中表达,进行了第一项遗传工程实验。     

小拟南芥chitinase基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

以野生资源小拟南芥(Arabidopsis pumila)chitinase基因的cDNA为基础,采用基因重组技术,将该基因按正确的阋读框架定向克隆于原核表达载体pET-30a( )中,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE分析.结果表明:重组小拟南芥chitinase基因在大肠杆菌中获得高效表达,其分子量约为40 KD.小拟南芥chitinase基因原核表达载体的成功构建和重组小拟南芥chitinase蛋白在大肠杆菌中的高效表达,为进一步研究其生物学功能奠定了基础.     

红霉素链霉菌聚酮合成酶基因eryAIII的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的:在大肠杆菌中异源表达红霉素链霉菌聚酮合成酶eryAIII基因。方法:构建表达载体pET-m28a,PCR扩增高GC含量长片段基因eryAIII及分子伴侣GroELS的基因,并插入该载体,每个基因都能够独立启动和终止表达;将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达。结果:NdeⅠ、HindⅢ分别酶切质粒pET-m28a/eryAIII-GroELS,琼脂糖凝胶电泳显示获得与预期大小相同的DNA片段;SDS-PAGE结果表明,重组大肠杆菌表达了由eryAIII编码的相对分子质量为348×103的蛋白;与GroELS共表达后,目的蛋白在上清中的表达量明显增加。结论:GroELS提高了eryAIII编码蛋白的可溶性,为红霉素合成通路在大肠杆菌中的重建奠定了基础。     

小鼠c-Myc基因的克隆表达及其纯化

目的:克隆小鼠c-Myc基因,构建原核表达载体并对其进行蛋白表达及纯化。方法:以TetO-FUW-OSKM质粒为模板经PCR扩增c-Myc基因,再通过基因重组技术与pET-3C载体相连转化大肠杆菌DH5α。经抗性筛选,PCR鉴定阳性重组子,测序正确后,重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE对重组蛋白进行鉴定分析。结果:DNA电泳结果证实PCR扩增产物与预期大小一致,DNA测序结果显示与GenBank公布的c-Myc基因序列一致,IPTG诱导SDS-PAGE电泳后,在分子量64kDa左右出现诱导后蛋白新增条带,与预测的c-Myc分子量大小一致。结论:成功地构建了pET3C-Myc原核表达载体,表达并纯化出了c-Myc蛋白,为今后研究c-Myc蛋白及相关蛋白诱导体细胞成多能干细胞打下基础。     

酿酒酵母HAL1基因的克隆及植物表达载体的构建

HAL1基因是酵母中重要的耐盐基因。以酿酒酵母AS2.375菌株的DNA为模板,根据已发表的序列设计引物,经PCR扩增得到约900 bp的HAL1基因片段,连接到pMD18-T载体上,转化大肠杆菌JM109,筛选重组质粒进行酶切分析和序列测定,结果显示已克隆到完整的可读框,该基因的序列与已知序列同源性达99%。将HAL1基因从T-载体上切下连接到pAM194载体上构建了HAL 1基因的植物表达载体,用于烟草的转化获得了耐盐性提高的转化植株。     

炭疽芽孢杆菌保护性抗原在大肠杆菌中的表达及纯化

按照炭疽芽孢杆菌保护性抗原（PA）基因成熟肽编码序列设计引物,从炭疽杆菌pOX1质粒中扩增出PA基因片段,将该片段定向插入到原核表达载体pET-28a中,获得了pET-PA原核表达重组质粒,限制性酶切分析和DNA序列测定均证实该克隆插入片段为PA基因的成熟呔编码序列。将该重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导,重组蛋白在大肠杆菌表达系统中获得了高效表达;Western印迹分析表明表达产物具有良好的免疫学活性。     

白喉毒素无毒突变体CRM197基因的克隆与表达

目的构建白喉毒素(Diphtheria toxin)无毒突变体CRM197(Cross-reacting materials 197)的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达重组蛋白。方法以白喉杆菌(ATCC39255)基因组DNA为模版,采用聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)扩增CRM197基因,插入表达载体pET11b中,构建重组原核表达质粒pET11b-CRM197。经双酶切及测序鉴定正确后,重组质粒被转化入大肠杆菌Rosetta 2(DE3)pLysS,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果重组表达质粒经双酶切及测序鉴定,结果表明与预期一致;表达的重组蛋白相对分子质量约58 000,并可与鼠抗CRM197单克隆抗体特异性结合。结论已成功构建了重组原核表达载体pET11b-CRM197,重组的CRM197蛋白在大肠杆菌中得到了表达,为以该重组突变体作蛋白载体制备结合疫苗奠定了基础。     

应用Red重组工程技术建立asd基因缺失的大肠杆菌DH108菌株

目的：建立一株新遗传表型的大肠杆菌DH10BAasd菌株。方法：应用pKD46介导的重组系统、kan／kil选择反选择系统、双链线性DNA重组技术和重叠引物介导的DNA重组技术,在菌株DH10B体内,对其染色体上的asd基因进行了基因敲除。结果：建立了一株二氨基庚二酸（DAP）营养缺陷型重组大肠杆菌DH10BAasd。结论：为进一步建立以大肠杆菌DH10B为载体的DNA疫苗或基因治疗载体奠定了基础。