激光显微切割植物细胞的研究新趋势

2006年以来,激光显微切割技术(LM)逐渐发展成为植物及植物-微生物互作领域的常用技术.从激光技术方面,激光捕获显微切割(LCM)和激光显微切割及压力弹射(LMPC)成为两大主流技术.在材料准备方面,改良的石蜡包埋切片技术在植物成熟组织切割中应用日益广泛,而冰冻包埋切片则在幼嫩组织切割中十分有效。激光显微切割所得样品主要仍用于RNA水平的基因表达分析,而且能从全基因组规模上深度分析基因表达谱.此外,对激光显微切割所得细胞进行小分子代谢物的分析也取得了实质性成果。总之,激光显微切割技术作为从复杂背景中直接分离特定细胞(群)的一种有效工具,在植物分子生物学研究中的应用已经成熟,正为提高植物研究的精准度做出贡献.     

染色体微切割、微克隆技术及其研究进展

本文综述了染色体显微切割与微克隆技术的原理、方法、应用及研究进展,尤其对几种染色体显微切割的方法、染色体的体外扩增技术ＤＯＰ－ＰＣＲ、ＬＡ－ＰＣＲ等进行了比较分析。对染色体微切割、微克隆技术研究中存在的问题和应用前景进行了初步探讨。     

γ分泌酶结构和功能的研究进展

γ分泌酶是膜整合蛋白酶复合体,可以切割多种I型跨膜蛋白,近年来由于它与阿尔茨海默病发病密切相关而受到广泛关注。γ分泌酶介导的膜内切割是一个非常复杂的过程,这和它复杂的内部结构和作用机制有关。最新的研究表明γ分泌酶PS亚基的活性位点附近有一个GXGD结构域,它对于γ分泌酶的催化活性有重要作用;"含水腔隙"的发现使γ分泌酶在高度疏水的脂质双分子层内的底物切割成为可能。该文综述了近年来γ分泌酶结构和功能的研究进展,阐述了γ分泌酶切割淀粉样蛋白前体APP释放淀粉样蛋白Aβ的过程,并且指出了γ分泌酶结构功能的研究进展对阿尔茨海默病治疗的重要意义。     

结核分枝杆菌ICL mRNA特异性10-23脱氧核酶切割 活性的鉴定及其切割特点

为鉴定结核分枝杆菌异柠檬酸裂合梅(ICL)特异性的10-23DRz在无细胞体系切割ICL mRNA的活性,并探讨其在不同条件下以及联合应用时对靶mRNA的切割特点,采用计算机软件模拟ICL mRNA的二级结构,据此选择适合的待切割靶点并设计针对相应靶点的特异性10-23DRz（DZ1～DZ5）.PCR法扩增获得icl基因并克隆入质粒pET32a+.采用T7 RNA聚合酶体外转录法获取ICL全长mRNA后分别用DZ1～DZ5在无细胞体系中对ICL mRNA进行切割,切割产物经变性聚丙烯酰胺凝胺电泳后用银染法鉴定各DRzs的活性.选择切割活性最强的DZ4考察不同10-23DRz剂量、不同反应时间、不同镁离子浓度条件下及不同错配或突变10-23DRz的切割特点.联合应用DZ1、DZ4及DZ5在无细胞体系中对ICL mRNA进行切割,检测10-23DRz联合应用对切割效率的影响.结果表明,DZ1、DZ3、DZ4及DZ5可在无细胞体系中有效地切割ICL mRNA,其切割效率在30.8%～64.5%之间.对DZ4切割活性的检测发现,其对靶mRNA的切割具有剂量和时间的依赖性;在2～20 μmol/L范围内,DZ4的切割活性与Mg2＋浓度呈正相关;DZ4单侧底物结合臂上含一个不与靶mRNA配对的碱基时其切割效率大大降低,两侧底物结合臂上各含一个不配对的碱基或活性中心域第6位出现碱基突变（G→C）时,DZ4完全丧失切割活性.联合应用2种或2种以上10-23DRz可显著增强对底物RNA的切割效率.10-23 DRz特异、有效地切割结核分枝杆菌ICL全长mRNA并显示一定的叠加效应,有望用于抗结核分枝杆菌潜伏感染的基因治疗.     

丁型肝炎病毒核酶及其应用

丁型肝炎病毒（ＨＤＶ）核酶是ＤＨＶ前体ＲＮＡ分子中一段能自我切割的ＲＮＡ序列,具有独特的二级结构,为ＨＤＶ双滚环复制所必需,通过抑制其活性可以控制ＨＤＶ感染。它又存在分子间切割活性,即反式切割作用,因而有可能应用于切割异源ＲＮＡ分子。本文就这些方面的研究进展作一综述。     

核酸切割酶在病原微生物检测中的研究进展

DNA是遗传信息的重要载体,其空间构象折叠性质使其具有很多的功能。利用核酸切割酶(cleaving DNAzyme)识别特定单链DNA分子并能够切割其中某条单链的性质来构建传感器,将特异性识别过程转化为凝胶电泳表征、释放荧光、比色现象的信号输出,同时能很好的和扩增反应结合来实现信号放大。核酸切割酶通过体外筛选技术获得,可以与靶物质(小分子、蛋白质,甚至整个细胞)特异性结合。由于具有制备简单,易于修饰和良好稳定性等优点,核酸切割酶被用于构建生物传感器以检测病原微生物,已应用到现场检测甚至医疗中的体内检测,结合已经成熟的检测设备血糖仪、横流层析试纸条带进行微生物检测,并广泛地应用到生物传感、食品安全、医疗在内的重要领域中。综述了近年来核酸切割酶在微生物检测中的应用,讨论了核酸切割酶在微生物检测中的切割机理和产物、靶标以及表征手段,探索核酸切割酶在微生物实际检测中的意义。对该技术的发展前景及其面临的问题进行展望,以期核酸切割酶在微生物检测领域能够更好的发展。     

Hemojuvelin在铁稳态平衡中的关键作用

铁调素（hepcidin）是由肝脏分泌的一种肽类激素,它通过改变细胞膜上ferroportin的水平而调节全身铁代谢。Ferroportin是唯一已知的哺乳动物中的铁外排通道,它表达在小肠细胞的基底外侧膜和巨噬细胞的质膜上。铁调素结合ferroportin导致其在溶酶体内降解,从而减少铁从饮食的吸收和巨噬细胞铁的释放。Hemojuvelin（HJV）是一种glycosylphosphatidylinositol（GPI）相连的膜蛋白,它作为骨形态发生蛋白（BMP）的共受体可以激活肝细胞Smad信号通路和铁调素表达。除了表达在细胞膜上,hemojuvelin还可以被切割并分泌到胞外,形成可溶性蛋白。由furin切割产生的可溶性HJV可以选择性地结合到BMP配体,抑制内源性BMP诱导的铁调素表达。TMPRSS6也被认为可以切割细胞膜上HJV并影响铁调素的表达。最近的研究表明,HJV还可能参与脂肪组织对铁代谢的调控。综述了近期对细胞膜HJV和可溶性HJV如何调节铁调素的表达与铁代谢的研究结果,并对这一研究领域需要填补的空白进行了初步探讨。     

染色体核型分析及染色体显微分离技术研究进展

染色体核型分析是遗传学研究的重要手段,也是物种分类和鏊定的基本依据.染色体显微切割技术是细胞遗传学和分子遗传学相结合的一种技术,应用前景广阔.重点综述了染色体核型分析和单染色体显微切割技术的操作规程.     

分子生物学技术讲座（二）——分子克隆中所用的酶

限制性内切酶及其它DNA与RNA修饰酶是分子克隆技术的基本工具。1限制性内切醉和DNA甲基化酶限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性内切酶识别序列的特定的DNA序列或附近的序列,并在此切割DNA双链。它可以分成3类：Ⅰ类和Ⅲ类在同一蛋白分子中兼有修饰（甲基化）作用及依赖于ATP的限制（切割）活性。Ⅰ类酶结合于识别序列,但随机切割DNA;Ⅲ类酶能在识别序列位点切割DNA。在分子克隆中1类和皿类酶都不常用。D类限制一修饰系统限制性内切醇和修饰（甲基化）酶不在同一蛋白分子中,限制性内切酶能专一地切割识别序列,并不依…     

小麦染色体的显微激光分离

探讨了应用氩离子激光进行植物染色体显微激光切割,分离的可行性,应用该技术对普通小麦的体细胞及特定染色体（１Ｂ染色体）实施切割,分离,并且以分离到的单细胞核或单条染色体为模板进行了ＰＣＲ ＤＮＡ扩增。该技术比玻璃针切割分离染色体技术,具有操作方便,容易掌握,且可对整个细胞核进行分离等优点,有利于促进染色体显微操作技术的普及应用。同时,探讨了染色体显微操作技术在细胞遗传学及分子生物学研究领域的应用前景     

脱氧核酶的研究进展

具有RNA裂解活性的DNA分子称为脱氧核酶,它是经过体外选择技术经多次筛选获得的。脱氧核酶在切割与其互补的RNA底物分子时具有极高的特异性和切割效率,有望成为新的RNA灭活工具。     

前导肽切割位点对Ⅱ类羊毛硫细菌素切割酶活性的影响

【背景】Ⅱ类羊毛硫细菌素大多是由革兰氏阳性菌的核糖体合成并经过翻译后修饰产生的小肽,其生物合成的最后一步是由转运蛋白LanTN端的肽酶结构域对前导肽进行切割,释放出有活性的羊毛硫细菌素,但目前关于该类羊毛硫细菌素前导肽的切割机制尚不清楚。【目的】考察前导肽切割位点对不同链球菌来源的肽酶结构域BovT150和SboT150酶切活性的影响。【方法】运用不依赖连接酶的定点突变技术构建前导肽切割位点突变的前体蛋白表达载体,在大肠杆菌(Escherichia coli)中分别表达纯化野生型前体(Bov Am和Sbo Am)、突变型前体及对应的切割酶(Bov T150和Sbo T150),构建体外酶切体系,利用HPLC、抑菌活性分析和MALDI-TOF MS检测前导肽的切除情况。【结果】BovT150不仅能够切割Bov Am的GG和GA位点,也能切割Sbo Am的GG和GA位点,并且对切割位点为Gly的前体切割活性较高;Sbo T150仅能切割Sbo Am的GG和GA位点,而对切割位点为Ala的活性较高。【结论】II类羊毛硫细菌素前导肽切割位点氨基酸残基的改变不同程度地影响切割酶的切割效率。     

脱氧核酶的研究进展

具有RNA裂解活性的DNA分子称为脱氧核酶。它是经过体外选择技术经多次筛选获得的。脱氧核酶在切割与其互补的RNA底物分子时具有极高的特异性和切割效率,有望成为新的RNA灭活工具。     

Deoxyribozymes的研究进展

具有RNA裂解活性的DNA分子称为脱氧核酶,它是经过体外选择技术经多次筛选获得的。脱氧核酶在切割与其互补的RNA底物分子时具有极高的特异性和切割效率,有望成为新的RNA灭活工具。     

改良手工显微切割法获取特定细胞提取高质量RNA

探讨显微切割过程中有效保持RNA完整性的组织固定方法,建立一种简易的手工显微切割法.应用自制“T形板”辅助冰冻切片,100％无水乙醇一次性脱水固定,“排除切割法”获取目的细胞,用TRIzol提取RNA,琼脂糖凝胶电泳和RT-PCR分析RNA质量.“一步法”固定可长时间保存RNA的完整性;从食管癌标本5个特定阶段的细胞中提取的RNA,经电泳和RT-PCR分析均具有较高的质量.无水乙醇“一步法”固定,在显微切割的过程中可有效保持RNA的完整性;T形板和“排除切割法”简化了手工显微切割的操作,提取的RNA质、量均可满足后续分子水平研究的需要.     

显微外科切割家兔胚泡产生同卵双胎

本文介绍外科切割家兔胚泡产生同卵双胎。各期胚泡是从自然排卵的家兔采得的。移植切割早期胚泡的8只受体母兔,2只妊娠,怀孕率为25％;移植切割中期胚泡的7只母兔,3只妊娠,怀孕率47％;移植切割晚期胚泡的6只母兔,3只妊娠,怀孕率50％,共产仔兔七窝。总共移植83对同卵半胚,获仔兔24只,其中7对同卵双胎。实践证明,应用胚泡切割获得家兔同卵双胎的途径是可行的。     

染色体显微切割与微克隆技术的研究进展

介绍了染色体显微切割及微克隆技术的原理和主要方法,综述了显微切割及微克隆的研究进展,并讨论了其在植物中的应用.     

专一切割苹果锈果类病毒多体自切割核酶的克隆和转录物的体外活性测定

将苹果锈果类病毒的1个14nt的靶序列连接在锤头型核酶的3′末端,构成自切割核酶。经人工合成和PCR扩增,克隆在转录载体pGEM7zf（＋）的XhoⅠ-Hind Ⅲ位点。利用限制酶Xho I与SalI的连接,消失其识别位点序列,将自切割核酶片段插入到重组质粒中,经连续5次亚克隆,分别获得2、4、6、8、10和12拷贝的多体自切割核酶。在T7RNA聚合酶作用下,线性化重组质粒转录的多体自切割核酶通过内部的顺式切割释放出较多数量的核酶分子,提示在转录水平能够提高核酶转录物的浓度。用相同摩尔浓度的单体和12体自切割核酶分别对32P标记的靶ASSVd进行反式切割,核酶与靶RNA摩尔浓度比为1：1。放射自显影结果表明：多体自切割核酶对靶ASSVd的切割效率明显高于单体自切割核酶。我们推测多体自切割核酶在体内系统中可能具有更好的应用价值。     

SPEXIN生物学功能研究进展

Spexin(SPX)是一种多向性功能肽类物质,它包括信号肽序列、成熟肽片段及两侧的切割位点,广泛表达于多种器官和组织中。SPX在机体能量代谢、食欲、排便、痛觉、水盐平衡等生理功能中发挥重要作用。SPX还可作为循环系统中的内分泌信号和中枢神经系统中的神经递质发挥生物学作用,其潜在的临床应用价值亟待进一步探索。本文就SPX的结构及生物学功能进行综述。     

奈瑟氏淋球菌IgA蛋白酶基因的克隆

IgA蛋白酶(IgA protease)可由多种病原微生物产生并分泌,例如肺炎双球菌(Haemophilus),奈瑟氏菌(Neisseria)等。其中奈瑟氏菌的IgA蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶类,其切割底物的核心序列为—ProPro/XxxPro,其中Xxx可以是Thr、Ala和Ser三个氨基酸中任何一种。IgA蛋白酶的切割具有特异、高效的特点,另一突出优点是它可用重组大肠杆菌进行表达制备,因此非常适用于基因工程中融