浑球红假单胞菌（Rhodobacter sphaeroides）谷氨酸合酶的纯化及性质

浑球红假单胞菌菌株601经超声击碎,粗提液通过Triton处理,硫酸铵沉淀,DE—52和DEAE—sephadex A—50柱层析及 Seqhadex G—200凝胶过滤等步骤,将谷氨酸合酶(GOGAT)分离纯化,在聚丙烯酰胺凝胶电泳上呈现一条带。GOGAT表观分子量约为138 kD。该酶最大光吸收在278,375,450 nm和475 nm处,表明GOGAT可能是一种黄素蛋白。纯化的GOGAT对其底物 Gln,α—酮戊二酸和NADPH的表观K_m值分别为830,150和6μmol/L。反应产物Gln和NADP,几种氨基酸对GOGAT活力有不同程度的抑制作用,Gln类似物DON对GOGAT活力有强烈的抑制作用。     

氨和谷氨酰胺对浑球红假单胞菌（Rhodobacter sphaeroides）固氮酶...

浑球红假单胞菌菌株601具有迅速对外源氨作出“关闭”固氮酶活性的反应。氨对固氮酶的抑制作用,可被谷氨酰胺合成酶(GS)抑制剂MSX所解除。反之,加入Glu代谢抑制剂DON,可延长氨抑制的持续时间。Gln对固氮酶也有抑制作用。在脱腺苷化GS的透性细胞中,加入Gln可抑制固氮酶活性,同时,GS腺苷化状态提高。然而,氨则对透性细胞的固氮酶活性和GS腺苷化状态没有影响。     

镍在浑球红假单胞菌氢酶合成中的作用（简报）

在固氮酶能表达的生长条件下,镍可促进浑球红假单胞菌菌株601的氢酶合成,而在含氨培养基上则没有影响。镍促进氢酶合成的最适浓度为10μmol/L,并具有金属专一性,其他二价金属离子对氢酶合成没有作用。镍在促进氢酶吸氢的同时,抑制菌体的放氢,但对固氮酶的乙炔还原活性则几乎没有影响。     

类产碱假单胞菌谷氨酸脱氢酶的纯化和性质

谷氨酸脱氢酶（Ｇｌｕｔａｍａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ,ＧＤＨ）可逆催化谷氨酸脱氨生成α酮戊二酸和氨,是一种依赖ＮＡＤ（Ｐ）的脱氢酶。其分子形式主要为六聚体或四聚体,大多数ＧＤＨ为六聚体［１］。该酶广泛存在于原核生物和真核生物,在氮、碳代谢的联系方面发挥重要作用。至今已有很多细菌ＧＤＨ得到详细研究［２～４］,但未见类产碱假单胞菌ＧＤＨ的研究报道。本文通过研究类产碱假单胞菌ＧＤＨ的纯化和性质,为揭示该菌的氮、碳代谢机制奠定基础。１　材料和方法１－１　细菌培养液体培养基为含柠檬酸和氯化铵的微量…     

浑球红假单胞菌及其谷氨酸合成酶突变株氢酶活性和合成

浑球红假单胞菌野生型菌株的氢酶表达被有机碳、氮底物所抑制。在光照和黑暗时,氧浓度变化对氢酶的作用不同,但高氧浓度都阻遏氢酶的表达。微量Ni~(2+)能专一性地促进氢酶活性,固氮酶的产氢也可以调节氢酶的表达水平。该野生菌株的GOGAT突变株缺乏固氮酶和氢酶活性,在加入谷氨酰胺合成酶抑制剂MSX后,固氮酶和氢酶以相关联的方式合成出来,固氮酶产生的氢看来诱导了氢酶的合成。然而在固氮酶不表达的情况下,外源氢也可诱导氢酶的合成。     

假单胞菌碱性木聚糖酶的纯化及性质

假单胞菌(Pseudomonas)G62可产生两种胞外木聚糖酶,即XynA和XynB。经过硫酸铵沉淀、阴离子和阳离子交换层析、分子筛色谱,最终得到 两种电泳纯酶。XynA的分子量及等电点分别为42kD和91,XynB的分子量和等电点分别是 20kD和88。经薄层色谱分析证明,两酶以不同的方式水解木聚糖,但都不产生木糖,即 两酶都为内切酶,它们的最适作用温度均为50℃。XynA的最适作用pH为7.0～9.8,而XynB的为7.0～7.5。在65℃时的半寿期XynA为6 min,XynB为140 min。XynA的Km和Vmax分别是5.56 mg·ml-1和543μmol·min-1·mg-1,XynB的Km和Vmax分别是7.72 mg·ml-1和819μmol·min-1·mg-1。两酶受Cu2+、Fe3+、Pb2+、Zn2+和Hg2+强烈抑制。化学修饰的初步结果表明,两酶的活性位点氨基酸均含有色氨酸和羧基氨基酸。     

丙酮酸对浑球红假单胞菌突变株(GOGAT~-Nif~-)固氮酶活性的调节

固氮无效的浑球红假单胞菌GOGAT突变株经丙酮酸诱导产生固氮酶活性。固氮酶比活随丙酮酸浓度增加而提高,同时依赖于蛋白质合成的菌体生长。丙酮酸产生固氮酶时氮源Glu的浓度高达60 mmol/L。液相色谱分析表明,丙酮酸诱导固氮酶活性的形成与胞内Gln耗竭有关而与Asn无关。用丙酮酸代替苹果酸诱导,突变株向胞外分泌的游离氨大大减少。丙酮酸诱导时变种谷氨酰胺酶比活较高,它可能参与胞内Gln的分解。     

假单胞杆菌D-海因酶的纯化及酶学性质

D-海因酶是工业上生产D-型氨基酸的关键酶,用热变性,硫酸铵沉淀及Sepharose Q fast flow,Phenyl-Sepharose fast flow,Superose 12等柱层析步骤从pseudomonas2262菌体中分离纯化了该酶,纯化倍数约为60,活力回收约为16%.该酶为同源二聚体,分子量约为109kD,亚基分子量约为53.7kD,反应最适pH为8.0,最适温度为70℃,在pH6.0～10.0和温度60℃以下稳定,该酶对巯基试剂敏感,大多数二价金属离子如镁、锰离子等能促使酶活提高,但高浓度锌离子能抑制酶活,以二氢尿嘧啶为底物的米氏常数Km=2.5×10-2mol/L.该酶的N末端10个氨基酸残基依次为MDKLIKNGTI.     

假单胞杆菌D-海因酶的纯化及酶学性质

D 海因酶是工业上生产D 型氨基酸的关键酶 ,用热变性 ,硫酸铵沉淀及SepharoseQfastflow ,Phenyl Sepharosefastflow ,Superose 1 2等柱层析步骤从Pseudomonas 2 2 62菌体中分离纯化了该酶 ,纯化倍数约为 60 ,活力回收约为 1 6%。该酶为同源二聚体 ,分子量约为 1 0 9kD ,亚基分子量约为 53 7kD ,反应最适pH为 8 0 ,最适温度为 70℃ ,在pH6.0～ 1 0 0和温度 60℃以下稳定 ,该酶对巯基试剂敏感 ,大多数二价金属离子如镁、锰离子等能促使酶活提高 ,但高浓度锌离子能抑制酶活 ,以二氢尿嘧啶为底物的米氏常数Km =2 .5× 1 0 - 2 mol L。该酶的N末端1 0个氨基酸残基依次为MDKLIKNGTI     

沼泽红假单胞菌的研究进展

概述了沼泽红假单胞菌菌株的分离纯化,主要特性及应用研究方面的进展。     

缺乏固氮活性的浑球红假单孢菌谷氨酸合成酶突变株

光合细菌浑球红假单孢菌601菌株,经过NlG诱变获得谷氨酸缺陷型204菌株。生化分析表明,突变株204缺乏谷氨酸合成酶活性(GoGAT),谷氨酰胺合成酶话性比亲株低,用放氢和乙蛱还原法未测出固氮酶活性。此外,突变株204不能在多种氮源上生长,例如：氨、尿素、组氨酸、丝氨酸、精氨酸和腺嘌呤,表现出氮素代谢上多效缺陷的表型。从含氨基础培养基或充氮气的低限培养基上分离回复子,自发回复突变频率均为2×10一·回复子的固氮酶和GS活性恢复到亲株的水平,同时重新获得利用上述各种氮源的能力。胞内游离氨基酸库分析表明,突变株的谷氨酰胺含量是亲株的16倍,外源谷氨酰胺加入培养基也抑制固氮活性。从上述结果推论,浑球红假单胞菌具有对固氮酶调节高度敏感的反馈系统,它随代谢中间产物而变化,胞内谷氨酰胺的含量是固氮酶活性反馈调节的关键成份。     

林肯链霉菌谷氨酸合酶的纯化和性质

采用硫酸铵分级沉淀、离子交换层析、凝胶过滤和吸附层析等方法 ,分离纯化了林肯链霉菌谷氨酸合酶 ,电泳鉴定为单一组分 .这是链霉菌中的第 1例 .谷氨酸合酶很不稳定 ,向酶缓冲液中加入α -KG ,PMSF ,EDTA ,β 巯基乙醇和甘油可以大大提高其稳定性 .测得全酶分子量为 1 38ku ,亚基分子量为 81和 5 7ku ,表明该酶由2个不相同的亚基构成 .吸收光谱在 380和 440nm附近没有吸收峰 ,表明该酶是不含铁的非黄素蛋白质 .该酶反应的最适 pH为 7 .2 ,最适温度为 30℃ .该酶对NADH ,α KG和L -Gln的表观Km 值分别为 5. 2 1× 1 0 ^-5 ,4. 1 7× 1 0 ^-4 和 4. 35× 1 0 ^-4 mol/L .以NADPH代替NADH作电子供体 ,该酶仍表现出部分活力 .反应产物Glu和NAD⁺,部分金属离子、氨基酸及三羧酸循环中间物对该酶活力有不同程度的抑制作用 .     

铜绿假单胞菌LexA蛋白的纯化及免疫活性分析

目的：对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)的LexA蛋白进行表达、纯化,并检测其免疫活性。方法： lexA基因片段插入表达载体pET32a(+),在E.coli BL21(DE3)中表达。包涵体经洗涤并用8M尿素溶解,镍离子亲合柱层析为第一步纯化,Superdex 75凝胶过滤层析作为第二步精细纯化,HPLC测定蛋白的浓度,将纯化的LexA蛋白经注射途径免疫家兔,制备兔抗LexA血清,采用免疫双扩、ELISA及Western Blot分析LexA的免疫活性。结果：LexA以包涵体形式表达,经镍离子亲合柱层析和凝胶过滤层析二步组合纯化目的蛋白,经HPLC测定目的蛋白的最终纯度为98.97%,表达及纯化的LexA具有良好的免疫活性。