酶和底物分子之间相互作用力对扩散控制反应速率的影响

本文是探讨在溶液中酶和底物分子之间相互作用力对扩散控制反应速率的影响,特别考虑到酶分子具有活性中心这一空间结构,及由它产生的力场作用,处理非球形对称扩散过程。从此可看到作用力是如何控制着底物分子的扩散及其在酶分子活性中心上定向作用,各种分子力对反应速率的影响,并且解释了一些实验结果。此外,给出了在溶液中酶-底物分子反应体系的力场等高线和浓度等高图。     

空穴活性中心的动力学研究

晶体衍射结果表明,大多数酶的活性中心通常是处于一种称之为分子裂陷之中,对这种酶反应体系,底物只有进入到空穴内才会起反应。本文试图对这种所谓空穴催化的动力学过程进行探讨。按所得方程对一具体模型的计算结果表明:反应的双分子阶段的速率一般并不会因活性中心处于空穴内而引起数量级的减小。这不仅解决了最近在碳酸酐酶作用原理的研究中所遇到的佯谬,而且也再次体现了分子生物学中结构与功能相统一的辩证关系。     

酶—底物结合反应的动力学——Ⅱ.多垒反应与测量信号

为了探讨涉及构象变化的液相快速反应体系,本文提出了一种新的动力学常数的分解方法。在此基础上,分析了多垒反直与测量信号间的关系,推导出一个既包含扩散限度的效应又包含溶剂和构象变化的效应的一般方程,从而得到一个较为普遍的动力学关系式,为深入研究酶-底物结合反应的全过程提供了动力学基础。此外,还通过实例计算,解释了通常的反应动力学理论所不能解释的实验结果。     

R-2-氯丙酸脱卤酶的定向进化

通过易错PCR手段将R-2-氯丙酸脱卤酶定向进化,并使用基于Cl-浓度显色反应的高通量筛选得到有效突变子库,发现突变子DehDIV-G2和DehDIV-E7的酶比活力分别提高25.2%和38.7%。通过SYBYL对酶与底物进行分子对接显示,DehDIV-G2的活化能下降0.961 4 kJ/mol,DehDIV-E7的活化能下降2.549 8 kJ/mol。由于酶和底物R-2-氯丙酸的活化能下降,亲和能力提高,从而提高酶的比活力。     

乙醇酸氧化酶必需精氨酸残基的化学修饰

丁二酮能使GAO迅速失活,其失活速度受介质pH和硼酸浓度的显著影响;其修饰反应具可逆性,当透析除去修饰剂和硼酸时,活性得到恢复。失活进程表现为假一级动力学。而计算表明,酶的每一活性中心单位与一分子丁二酮结合便可引起酶的失活。底物和竞争性抑制剂均能有效地保护酶免于失活。氨基酸分析表明,酶的失活是因为丁二酮修饰了精氨酸残基。丁二酮修饰GAO后使酶的K_m增大,而V_m没有变化。     

微生物合成11α-羟基-16α,17α-环氧孕酮的动力学

对耐温黑根霉菌丝体催化16α,17-α-氧孕酮生成11α-羟基-16α,17α-环氧孕酮的反应体系进行了研究,考察了不同反应时间、不同菌体量和底物质量浓度对11α-羟化反应的影响,建立了相应的动力学模型,其方程为r=0.031Sr/1.05＋Sr。结果表明：提高菌体质量浓度有利于提高反应速率;底物浓度与反应初速率的关系与米氏方程相似。     

基因工程菌1016氨基酰化酶的酶学性质研究

研究了基因工程菌 1 0 1 6所产的氨基酰化酶的酶学特性。该酶的拆分速率符合米氏方程 ,且在 0 .5mol/L的高底物浓度下 ,无底物抑制现象。 37℃时的米氏常数和最大反应速率分别为 0 .0 4 8mmol/L和 2 .1 78mmol/L·h。最适反应温度为 5 5℃。5 5℃时 ,Km为 0 .0 37mmol/L ,Vmax为 2 .5 5 8mmol/L·h。最适底物为乙酰蛋氨酸 ;热稳定性好。     

蒸汽爆破玉米秸秆酶解动力学

为了掌握蒸汽爆破玉米秸秆的酶解特性,研究了不同底物浓度、酶浓度、温度对反应速率的影响。运用米氏方程对酶解动力学过程进行拟合,结果表明,纤维素酶对该玉米秸秆的水解反应在反应前3 h符合一级反应,可用米氏方程对其进行拟合。在转速为120 r/min、酶浓度为1.2 FPU/mL、pH 5.0、温度为45 ℃时米氏常数Km为11.71 g/L,最大反应速率Vm为1.5 g/(L·h)。确立了包括底物浓度、酶浓度、温度在内的酶解动力学模型,该模型适合温度为30 ℃~50 ℃。     

PEP羧激酶测定过程中影响草酰乙酸溶液稳定性的几个因素

草酰乙酸（OAA）是PEP羧激酶（PEPCK）和苹果酸脱氢酶可逆催化反应的底物或产物，也是PEP核化酶的反应产物。然而OAA在溶液中可以酮式和烯酸式两种互变异构体及其水合物形式存在，而只有酮式OAA才能作为酶的底物[1，2，5]。同时，OAA很容易通过非酶促脱羧反应而降解[4]。OAA的这种多型性和不稳定性，往往导致以它为底物或产物的酶类活性测定值偏低。作PEPCK脱按活性测定时，所用的OAA溶液皆需规配现用，并在起动反应时作OAA非酶促脱波速率的校正。然而，实验过程中OAA浓度往往随时间而下降，使反应系统中OAA水平出现明显…     

核盘菌5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶的酶学性质

核盘菌5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶（EPSP合酶）是AROM多功能酶的活性之一.该酶催化莽草酸磷酸（S3P）和磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）产生5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸和无机磷酸的可逆反应,受除草剂草甘膦（N-（膦羧甲基）甘氨酸）抑制.纯化了核盘菌AROM蛋白并对EPSP合酶进行了酶学特征研究.结果显示,该酶反应的最适pH值为7.2,最适温度为30℃.热失活反应活化能是69.62 kJ/mol.底物S3P和PEP浓度分别高于1 mmol/L和2 mmol/L时,对EPSP合酶反应产生抑制作用.用双底物反应恒态动力学Dalziel方程求得的Km(PEP)为140.98 μmol/L,K _m(S3P)为139.58 μmol/L.酶动力学模型遵循顺序反应机制.草甘膦是该酶反应底物PEP的竞争性抑制剂（Ki为0.32 μmol/L）和S3P的非竞争性抑制剂.正向反应受K⁺激活.当［K⁺］增加时,K _m(PEP)随之降低,Km(S3P)不规律变化,而K _i(PEP)随［K⁺］增加而提高.     

青鱼腸胃道中蛋白酶的初步研究

(1)从淡水魚青魚腸胃道中提取出魚蛋白酶,酶制剂活力以酪蛋白作底物約为結晶胰蛋白酶的1/3。酶的前身有酶原存在,激活最适pH为8。(2)酶作用的pH偏于碱,水解酪蛋白和B-精-NH_2的最适pH都为9,酶和酶原对酸都不稳定,当pH低于4吋,酶活性和酶原激活的能力迅速丧失。(3)此酶对热很稳定,反应温度55度时,反应速度仍符合Arrhenius定律。測得水解酪蛋白和B-精-NH_2的活化能分别为14.6千卡/克分子及8.0千卡/克分子,較之胰蛋白酶水解此同一底物所需的活化能为低,尤以后者更显著,約相当于1/2值。(4)对小底物的水解以B-精-NH_2活力最高,K_m=3.3×10~(-3)M(40度pH8.7),为胰蛋白酶水解此同一底物所得K_m值的二分之一,对胰凝乳蛋白酶的底物B-酪-NH_2不作用,而对Cbz-甘-苯丙及白-NH_2却有較明显的活力。(5)半胱氨酸(10~(-3)M)和PCMB(10~(-4)M)对酶活力无影响,但能被DFP和胰蛋白酶抑制剂所抑制。DFP的抑剂随其与酶保温时間的增长而增大。lO~(-4)MDFP与酶液保溫10小时后能抑制酶活力达60%。胰蛋白酶抑制剂对此酶抑制的作用与抑制胰凝乳蛋白酶相类似。(6)从青魚腸胃道中找到有类胰蛋白酶抑制剂的存在。对魚本身蛋白酶有显著的抑制作用,对胰蛋白酶亦能抑制,但抑制能力較弱。     

嗜热丁烷氧化古菌Candidatus Syntrophoarchaeum烷基转移酶MtaA催化丁基辅酶M的分子机制研究

【背景】嗜热古菌Candidatus Syntrophoarchaeum可以与硫酸盐还原细菌共生,通过逆转产甲烷途径进行正丁烷的氧化,但在该过程中负责催化丁基辅酶M氧化的酶尚未确定。【目的】利用分子动力学模拟证明Ca.Syntrophoarchaeum中mta A基因编码的蛋白可以特异性催化丁基辅酶M中丁基的转移,并非转移甲基。【方法】使用Methanosarcina mazei辅酶M甲基转移酶Mta A的晶体结构(PDB ID:4ay8)作为模板,对Mta A_1 (Gen Bank登录号OFV65993.1)和Mta A_2 (Gen Bank登录号OFV65678.1)进行同源建模。使用分子对接得到两者分别结合CH_3-Co M和C_4H_9-Co M时的结构,并用AMBER18进行分子动力学模拟。【结果】当Mta A_1和Mta A_2分别结合C_4H_9-Co M时,表现出与4ay8晶体结构类似的TIM-Barrel折叠三维结构,但在活性中心形状、Zn~(2+)与底物距离以及活性位点附近氨基酸配位方式等方面存在差异,这可能是导致Ca.Syntrophoarchaeum中mta A基因编码的蛋白催化丁基辅酶M氧化的原因。其中Mta A_2与4ay8结构更相似,活性中心氨基酸配位更完整,暗示其更可能具备催化活性。然而当Mta A_1和Mta A_2分别结合CH_3-Co M时,整体结构不合实际,活性中心Zn~(2+)与底物距离过远,表明底物几乎不可能与酶结合。【结论】Ca.Syntrophoarchaeum中的Mta A_1和Mta A_2很可能是特异性的丁基转移酶,而非催化甲基的转移,其中Mta A_2具备活性的可能性更高。     

高效液相色谱法在脱氧核糖核酸酶解动力学

为了更好地对脱氧核糖核酸酶解动力学过程进行研究,建立脱氧核糖核酸(DNA)酶解液中4种脱氧核苷酸(腺嘌呤脱氧核苷酸(dAMP)、鸟嘌呤脱氧核苷酸(dGMP)、胞嘧啶脱氧核苷酸(dCMP)、胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dTMP))的高效液相测定方法,能将酶解液中4种脱氧核苷酸完全分离并准确定量.在此基础上,对DNA酶解的动力学进行初步研究,其反应机理为不存在底物和产物抑制的双底物顺序反应,动力学方程为x=1/bln(1+abt)(其中a=0.372 3ρ0-0.974;b=-0.049 3ρ20+1.115 3ρ0 - 1.110 3),该方程可以很好地描述DNA酶解过程,误差仅为3.31%.     

酶促水解大豆分离蛋白动力学模型的研究

本文对AS1.398中性蛋白酶在pH6.9和温度49℃条件下水解大豆分离蛋白的动力学机制进行了研究．结果表明：酶水解速率随水解反呈指数递减．为了解释实验结果,我们提出了如下假设：对底物而言水解反应终为零级反应,水解过程中由于游离酶攻击酶-底物中间络合物而造成的不可逆酶变性是一个二级动力学过程．在此基础上,由实验数据推导得到了描述AS1.398中性蛋白酶催化水解大豆分离蛋白的动力学方程,该方程可用于指导和优化酶解反应实验．     

非水相体系酶催化反应研究进展

非水相酶催化反应是酶催化反应中的一个重要方面。非水相溶剂通常可增加底物溶解度,减少水相中的副反应,加快生物催化的速率和效率,在药物及药物中间体和食品等方面具有较大的应用价值。以下探讨了非水相体系对酶活力及酶促反应速率的影响因素,并阐述酶的化学修饰、固定化及定点突变对酶活力的影响,进一步分析无溶剂系统、反胶束、超临界流体及离子液体的不同溶剂体系对酶反应速率及催化效率的影响。此外,还列举一些非水相酶催化反应的应用实例。     

简单节杆菌转化氢化可的松的△-脱氢反应动力学I．简单节杆菌BY-2-13自由细胞转化氢化可的松的△-脱氢反应动力学

本文研究了简单节杆菌(Arthrobacter simplex) By-2-13转化氢化可的松为氢化泼尼松韵△一脱氢反应动力学。其中包括溶解底物的底物浓度对反应速度的影响,反应初速度与底物浓度的关系;固体悬浮液中底物总浓度对反应速度的影响,反应初速度与底物浓度的关系;酶量对反应的影响以及产物的抑制作用等。溶解底物和固体悬浮液底物的反应初速度与底物浓度的关系都符合简单米氏方程,米氏常数Km分别为0．33mg／mJ和29．41n,g／ml,而两者的反应过程曲线均与简单米氏方程不符。无论在较低或较高浓度的固体悬浮液底物转化过程中,产物对A’。脱氢反应都呈现抑制作用。由此建立了该反应的反应动力学模型及相应的动力学方程,井经线性化后回归得出反应的动力学参数。当反应时间小于‘(达到约85％的转化率所需要的时间)时,用此动力学方程拟合所得的数据与实验测定值相符。     

乙酰胆碱酯酶的别构作用:两类胆碱能配基在外周阴离子部位的颉颃

纯化的黄姑鱼肌肉乙酰胆碱酯酶,在低离子强度介质中,底物(硫代丁酰胆碱)浓度和活性的关系符合Michaelis 方程。底物在外周阴离子部位的结合不抑制酶活性。然而,底物按Kss 值(底物在外周结合作用的解离常数)解除箭毒和阿托品对酶的纯非竞争性抑制作用。与箭毒类似的胆碱能配基还有1,5-双-(4-三甲铵苯)戊酮-3及十甲鎓。但它们对酶的催化阴离子部位也有很高的亲和力。我们测定了它们作用于酶上两类部位的抑制常数。另一类胆碱能配基,包括硫代丁酰胆碱、乙酰胆碱、苯酰胆碱、间-三甲铵酚、烟碱、六甲鎓和季铵酚,除了它们在酶的催化阴离子部位有较高的亲和力外,也结合于外周部位,并表现为解除箭毒抑制的颉颃作用。其中某些化合物在外周结合后也有别构激活作用。从这些结果能假定,酶至少可存在三种构象状态。讨论了乙酰胆碱酯酶和乙酰胆碱受体的某些相似性。     

S-2-氯丙酸脱卤酶的定向进化及其应用

为提高S-2-氯丙酸脱卤酶的活力,通过易错PCR的方法将源于假单胞菌(Pseudomonas sp.CGMCC 3267)的脱卤酶(DehII)进行定向进化,进化酶DehII-B2的比活提高3.9倍。同源模建两者的三维结构,并与底物进行分子对接。结果表明,突变位点为A7I,进化酶DehII-B2的结合能比原始酶降低了1.4kcal/mol,活性中心Asp10与底物α碳原子的距离缩短了0.321 6nm,因而加快了酶反应速率、提高了酶比活。目前,该酶的比活高于实验室已得酶。与原始酶相比,其最适温度和热稳定性略有增加,最适pH和pH稳定性没有明显变化。对该酶的应用做了初步的探索,结果表明在40℃,60mmol/L底物浓度下反应10h,转化率达到49.6%,ees>99.9%,因此该酶有一定的应用价值。     

高效液相色谱法在脱氧核糖核酸酶解动力学研究中的应用

为了更好地对脱氧核糖核酸酶解动力学过程进行研究,建立脱氧核糖核酸（DNA）酶解液中4种脱氧核苷酸（腺嘌呤脱氧核苷酸（dAMP）、鸟嘌呤脱氧核苷酸（dGMP）、胞嘧啶脱氧核苷酸（dCMP）、胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTMP））的高效液相测定方法,能将酶解液中4种脱氧核苷酸完全分离并准确定量。在此基础上,对DNA酶解的动力学进行初步研究,其反应机理为不存在底物和产物抑制的双底物顺序反应,动力学方程为x=1／bin（1＋abt）（其中a=0．3723p0—0．974;b=-0．0493p0^2＋1．1150p0-1．1103）,该方程可以很好地描述DNA酶解过程,误差仅为3．31％.     

醛缩酶的活性中心

醛縮酶經羧肽酶消化催化底物果糖-1,6-二磷酸分解的活力下降至7%以后,竞爭性抑制物果糖-6-磷酸对酶不再有抑制作用,說明被羧肽酶消化切除的C末端酪氨酸和酶与竞爭性抑制物的結合有关。此外还发现底物果糖-1,6-二磷酸能保护醛縮酶不受羧肽酶消化。因此我們认为C末端酪氨酸是醛縮酶的活性中心。酶分子通过它和竞爭性抑制物果糖-6-磷酸及底物果糖-1,6-二磷酸的-6-磷酸部分結合。利用邹承魯新近提出的方法推算,醛縮酶的三个酪氨酸末端中有二酪氨酸是酶的活性中心。