应用套式PCR检测猪细小病毒

从猪细小病毒基因组的ＶＰ２基因上,选择两对引物进行套式聚合酶链反应体外扩增,产物经２％ａｇａｒｏｓｅ凝胶电泳和生物素标记的探针鉴定。证实具有特异性,敏感性实验证明,大套式ＰＣＲ能检测到１ ＴＣｉＤ５０的病毒量,在临床上应用方法能从不同的组织样品和粪便中检测出猪细小病毒,具有很高的敏感性。     

猪细小病毒分子生物学研究进展

猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)是引起母猪繁殖障碍的主要病原之一,研究发现该病毒在进化史上相对保守,对宿主专一性高,但近年来相继发现的PPV2和PPV香港株(Porcine HoKovirus,PHoV)与PPV差异较大,对PPV、PPV2和PHoV的基因组结构、分子进化研究、复制培养现状及其蛋白表达方面研究进行了简单综述,为猪细小病毒多样性研究提供参考。     

疫苗原辅料中猪圆环病毒1型、2型和猪细小病毒PCR检测方法的建立及验证

目的 建立疫苗原辅料中猪圆环病毒1型(porcine circovirus type 1, PCV1)、2型(porcine circovirus type 2, PCV2)和猪细小病毒(porcine parvovirus, PPV)的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)检测方法并进行验证。方法 根据NCBI公布的PCV1、PCV2和PPV基因序列设计了3对特异性引物,通过优化反应条件,建立起检测疫苗原辅料中PCV1、PCV2和PPV的PCR检测方法,并对方法的重复性、中间精密度、专属性、耐用性和检测限进行了验证。结果 PCR反应的退火温度为55℃,特异性引物浓度为10μmol/L。该方法重复性、中间精密度、专属性和耐用性均良好,对PCV1、PCV2、PPV的最低检测限分别为1 pg/μL、100 fg/μL和10 fg/μL。结论 PCR检测方法可以有效检测出疫苗原辅料中外源病毒污染情况,能为生产合格的疫苗提供质量保证。     

细小病毒B19感染检测方法的研究进展

本文综述了细小病毒Ｂ１９感染检测方法的研究进展。病毒分离目前仍处于实验研究阶段;电镜及免疫组化法检测阳性率不高,限制了其使用;血清学方法多用重组抗原进行,血清中病毒特异性ＩｇＭ阳性可做为近期感染的指标,但由于与风疹病毒的交叉反应,该方法与病毒ＤＮＡ检测结合使用结果更为可靠;核酸杂交法敏感性高,可用于常规诊断和流行病学调查,但易出现假阳性,特别是同位素探针,敌目前多倾向于用非放射性标记探针;ＰＣＲ法     

湖北猪场猪细小病毒的首次分离与鉴定

猪细小病毒是引起初产母猪繁殖障碍的主要病因之一,许多国家从初产母猪的流产、死产及木乃伊化胎儿中分离到猪细小病毒。我们从湖北省某猪场的初产母猪流产、死产及木乃伊化胎儿中分离到两株病毒。研究表明,它们可在PK15,Hela、BHK及Vero传代细胞系和胎猪肾、婴兔肾等原代细胞上产生特征性的细胞病变:对豚鼠红血球有血凝作用;对脂溶性溶剂不敏感,对热和酸有较强的抗性:对胰蛋白酶处理不受影响。对DNA合成抑制剂5—FVDR敏感。电镜观察发现这两株病毒大小为20nm左右,呈球形。两株病毒能被标准的细小病毒阳性血清中和。回感豚鼠,成功地从死产胎儿胎盘中收获到该病毒。按照国际病毒学分类原则,我们将这两株病毒鉴定为猪细小病毒,填补了湖北猪细小病毒的研究空白。     

猪细小病毒vp2基因的表达和类病毒颗粒的构建

利用PCR方法从病毒基因组中获得了vp2完整的编码区并经测序后克隆到原核表达载体pET-32(a)上.在大肠杆菌中诱导表达了VP2与Trx-His-S Tag的融合蛋白,通过免疫家兔获得了高特异性的兔抗血清.另外,将vp2克隆到pFastBacDUAL载体上,利用昆虫表达系统,即AcMNPV的Bac-to-Bac系统对vp2进行了表达,经SDS-PAGE和Western blot分析,表达产物为64kD,并且该蛋白能在昆虫细胞中形成类病毒颗粒.     

猪细小病毒单克隆抗体的制备和鉴定

目的制备猪细小病毒（PPV）杂交瘤细胞株,并对其分泌的PPV单克隆抗体进行鉴定。方法按常规方法制备并获得2株杂交瘤细胞。用染色体分析对杂交瘤细胞进行鉴定,用间接ELISA、免疫过氧化物酶单层试验（IPMA）和间接免疫荧光试验（IFA）对其分泌的单克隆抗体进行效价测定、亚型鉴定和特异性鉴定。结果得到2株分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株2H9、1F9,染色体数目介于90～110之间。细胞上清效价均达1∶1×104,腹水效价均达1∶1×107,其亚型分别为IgG1、IgM,均为kappa链。2H9、1F9单抗与猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪圆环病毒I型（PCV-1）、猪圆环病毒Ⅱ型（PCV-2）、乙脑病毒（JEV）等均无交叉反应。IPMA和IFA检测结果显示2H9、1F9单抗均能与接种于PK-15细胞的PPV发生特异性反应。结论成功制备了2株抗PPV杂交瘤细胞株,证实其产生的单克隆抗体具有良好的特异性和敏感性。     

犬细小病毒血凝的检测和血凝抑制试验方法的优化

目的优化血凝和血凝抑制（HA／HI）试验条件,提高HA／HI试验的稳定性和准确性。方法在不同的缓冲液、pH值、猪红细胞浓度、BSA浓度下进行HA／HI试验,选择合适的HA／HI条件。结果pH7．0、0．1％BSA、0．2mol／LPBS、1％猪红细胞可作为HA／HI试验合适的反应条件,猪血球可保存12d不影响试验结果。结论方法优化后稳定性增强、检测时间缩短、准确性提高。     

检测PCV2、PPV、PRV疫苗株与野毒株的多重PCR方法

本文建立了一种同时检测猪圆环病毒2型（PCV2）、细小病毒（PPV）、及伪狂犬病毒（PRV）疫苗株与野毒株的多重PCR方法.根据GenBank上发表的PCV2、PPV和PRV gB、gE基因序列,针对各自保守区各设计一对特异性引物,用这四对引物对同一样品中的PCV2、PPV和PRV gB、gE进行检测,结果可同时扩增出269bp（PCV2）、581bp（PPV）、372bP（PRV gB）及147bp（PRV gE）四条特异性片段.对JEV、PRRSRV、大肠杆菌和双蒸水的PCR扩增结果均为阴性;敏感性测定结果表明,该多重PCR能检出10pg PCV2、PPV和PRV gB、gE检测敏感度分别为10^-6.2、10^-3.8、10^-5.8TCID50的模板.该方法的建立对临床上进行这三种疾病的鉴别诊断和混合感染的检测具有重要意义.     

检测PCV2、PPV、PRV疫苗株与野毒株的多重PCR方法

本文建立了一种同时检测猪圆环病毒2型(PCV2)、细小病毒(PPV)、及伪狂犬病毒(PRV)疫苗株与野毒株的多重PCR方法.根据GenBank上发表的PCV2、PPV和PRV gB、gE基因序列,针对各自保守区各设计一对特异性引物,用这四对引物对同一样品中的PCV2、PPV和PRV gB、gE进行检测,结果可同时扩增出269bp(PCV2)、581bp(PPV)、372bP(PRV gB)及147bp(PRV gE)四条特异性片段.对JEV、PRRSRV、大肠杆菌和双蒸水的PCR扩增结果均为阴性;敏感性测定结果表明,该多重PCR能检出10pg PCV2、PPV和PRV gB、gE检测敏感度分别为10-6.2、10-3.8、10-5.8TCID50的模板.该方法的建立对临床上进行这三种疾病的鉴别诊断和混合感染的检测具有重要意义.     

猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪细小病毒混合感染的流行病学调查

根据GenBank上发表的PRRSV ORF7、PPV VP2及PCV的基因组序列设计合成引物,建立了分别用于检测PRRSV、PPV和PCV的RT-PCR、PCR及复合PCR方法.应用建立的复合PCR方法对送检的127份病料进行了PCV的检测,对鉴定为PCV2阳性的67份病料再分别进行PRRSV和PPV的检测,以确定猪群中PCV2与PRRSV和/或PPV混合感染情况,结果表明,35份样品表现为PRRSV与PCV2混合感染,占样品总数的52.3%;18份样品表现为PCV2与PPV混合感染,占26.9%.另外,还有一定比例的三重感染,共5个样品,占7.5%.由此可见,猪群中PCV2与PRRSV及PPV混合感染比较普遍.     

猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪细小病毒混合感染的流行病学调查

根据GenBank上发表的PRRSVORF7、PPVVP2及PCV的基因组序列设计合成引物,建立了分别用于检测PRRSV、PPV和PCV的RT-PCR、PCR及复合PCR方法。应用建立的复合PCR方法对送检的127份病料进行了PCV的检测,对鉴定为PCV2阳性的67份病料再分别进行PRRSV和PPV的检测,以确定猪群中PCV2与PRRSV和,或PPV混合感染情况,结果表明,35份样品表现为PRRSV与PCV2混合感染,占样品总数的52．3％;18份样品表现为PCV2与PPV混合感染,占26．9％。另外,还有一定比例的三重感染,共5个样品,占7．5％。由此可见,猪群中PCV2与PRRSV及PPV混合感染比较普遍。     

抗微生物脂肽体外抗PRV和PPV的研究

本试验研究了枯草芽孢杆菌fmbJ株产生的抗微生物脂肽(Antimicrobial lipopeptide,AMI)的体外抗伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)、猪细小病毒(Porcine parvovirus, PPV)南京株活性并对其可能的机理进行了初步探讨.结果表明该抗微生物脂肽对猪肾(Porcine Kidney,PK-15)细胞的半数中毒浓度(Median Toxicosis Dose,TD50)和最大无毒浓度(TD0)分别为47.57 mg/L、18.9 mg/L;对PRV株、PPV南京株所致细胞病变效应(Cytopathic Effects,CPE)有明显的抑制作用,可使细胞存活率显著升高;但不能抑制PRV株、PPV南京株在PK-15细胞上的感染和复制.由此可知,该抗微生物脂肽可以直接作用于PRV株、PPV南京株,从而抑制其对PK-15细胞的感染作用,其作用效果显著低于抗病毒药物阿昔洛韦(Acyclovir,ACV),但由于其对PK-15细胞毒性较弱,可作为一种抗病毒药物进行进一步开发研究.     

猪细小病毒VP2蛋白在干酪乳杆菌表面的表达

将编码猪细小病毒主要免疫保护性抗原VP2基因插入干酪乳杆菌细胞表面表达载体pPG中,构建了重组表达载体pPG-VP2,将其电转化干酪乳杆菌Lactobacillus casei 393,获得了表达猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌系统,经2%乳糖在MRS培养基中的诱导表达,SDS-PAGE检测表明,有约74kD蛋白得到了表达,表达蛋白的大小与理论值相符。Western-blot结果分析表明,表达的蛋白可被鼠源PPV抗血清所识别,间接免疫荧光实验结果表明,所表达的蛋白能够在干酪乳杆菌菌体表面检测到。     

猪细小病毒SD-68株NS1基因的克隆与序列分析

对猪细小病毒(PPV)SD-68株NS1基因进行了克隆和序列测定,结果表明SD-68株NS1基因全长1989bp,编码662个氨基酸组成的多肽。该序列与PPV SY-99株、Kresse株、NADL-2(5075)和NADL-2(4973)株的NS1基因比较,核苷酸的同源性分别为99．9％、99．9％、99．7％、98．1％,氨基酸的同源性分别为99．7％、99．5％、99．5％、96．7％。PPV SD-68株与MVM(i)、MEV(Abashiri)、CPV、FPV、BPV3、GPVNSl的进化树分析表明：PPVSD-68株NS1与MVM(i)NS1亲缘关系最近,与BPV3 NS1的亲缘关系最远;在Thr435和Ser473位点PPV SD-68株与MVM(i)完全一致,表明Thr435和Ser473是PPV SD-68株NS1潜在的磷酸化位点。     

猪细小病毒VP2蛋白主要抗原表位基因真核表达载体的构建及表达

Using a pair of specific primers designed according to the relevant nucleotide sequences from GenBank, the main antigen domain for VP2 gene of Porcine parvovirus was ampilified with PCR method using the genomic DNA as template. The PCR product was cloned into the expression vector pIREShyg to get a recombinant eukaryotic expression plasmid pIREShyg-VP2, which was then transfected into the CHO-K1 cells. The expressed product was detected by IFA after the positive cell clone was selected with hygromycin. The result revealed that the main antigen domain for VP2 gene of porcine parvovirus was stably expressed in CHO-K1 cells.     

猪圆环病毒PCR检测方法的优化

猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)为无囊膜的单股负链DNA病毒,是目前发现的最小的动物病毒,大小约为17nm[1]。PCV根据抗原性及基因组的不同可以分为PCV1和PCV2两种基因型,PCV1分离自猪肾细胞系PK15,它不致病,能够在PK15中稳定存在而不形成细胞病变;PCV2对猪有致病性,可引起猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎与肾病综合征(PDNS)、断奶猪和育肥猪的呼吸道疾病、猪的繁殖障碍等疾病。近年来已成为严重危害我国养猪业的主要疾病之一。但迄今为止市场上还没有商品化疫苗和特效药物防治该病,并且该病有时呈亚临床感染,所以…     

啮齿类螺杆菌不同检测方法的比较

目的确定用于实验啮齿类动物常规螺杆菌检测方法。方法选用针对螺杆菌属16S rRNA属特异性的4对引物进行了引物选择、取材部位以及与分离培养法比较。结果引物P7/P8的敏感性优于其它3对,检出限可达0.01 pg,对阳性动物群检出率80%-100%;分离培养法检出率40%-50%;盲肠、结肠检出率无显著差异。结论以引物P7/P8的PCR方法作为啮齿类实验动物螺杆菌初筛方法,分离培养法作为验证方法,取材部位可在盲肠或结肠。