中国人肥胖基因克隆及其原核表达载体的构建

为了探讨人肥胖基因的生理和病理意义,利用逆转录－聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）方法,从中国汉族成人腹膜后脂肪组织总ＲＮＡ中扩增出肥胖基因编码区序列（ＣＤＮＡ）,定向亚克隆至ＰＵＣ１９质粒,克隆的ＯＢＣＤＮＡ不含信号肽序列并加入了亲折起始密友子ＡＴＧ〈序列分析表明,与日本报道的人ＯＢＣＤＮＡ相比,多出一个谷氨酸密码子ＣＡＧ,将ＯＢＣＤＮＡ定向克隆至原功体ＰＢＶ２２０,构建了重组ＯＢ基因表达质粒ＰＢＶ     

GNA成熟蛋白基因亚克隆及其原核表达载体构建

雪花莲外源凝集素（GNA）对刺吸式昆虫和某些咀嚼式昆虫以及多种线虫均有毒性,从含GNA前体蛋白基因的质粒中亚克隆出GNA的成熟蛋白基因MGNA,将MGNA基因插入大肠杆菌表达载体pET22b的不同位点,再经测序验证,得到了三种不同表达形式的GNA原核表达载体;22bG1(分泌型融合GNA蛋白）,22bG2(包涵体型GNA蛋白）,22bG3(分泌型天然GNA蛋白）,这为进一步在大肠杆菌中表达GNA和将GNA制成生物农药奠定了基础。     

MBP-gldABC融合蛋白基因的原核表达载体的构建

目的：构建可高效生产甘油脱水酶的大肠杆菌工程菌,方法：将编码甘油脱水酶的三个基因gldA、gldB、gldC,分别克隆至克隆载体pMD18-T和pSIM-T中,经测序正确后,再亚克隆至表达融合蛋白的高效表达载体pMAL-c2X上,构建成表达质粒pMAL-gldABC,并转化大肠杆菌E.coli DH5α。结果：成功地将甘油脱水酶基因gldABC以同向串联方式克隆到大肠杆菌融合表达载体pMAL-c2X中,结论：得到了含gldABC基因的MBP融合蛋白表达载体,为研究甘油脱水酶基因（gldABC）的在原核表达载体中的串联表达奠定了基础。     

人抑癌基因PTEN的原核表达载体的构建及融合表达

为研究抑癌因子PTEN蛋白的抑癌机理,掏建了PTEN cDNA的原核表达载体并进行融合表达。将含有PTEN cDNA的质粒pMD-PTEN经EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切,回收PTEN基因片段与经相同酶切的高效原核表达载体pET-44a连接,经序列测定,证实融合型表达载体pET-Nus-PTEN构建成功。转化表达宿主BL21(DE3)后,IPTG诱导表达。经12％SDS-PAGE凝胶电泳,获得118kD的特异蛋白条带。目的蛋白占细菌总蛋白的17％。结果表明：PTEN基因和Nus基因融合表达成功,获得可溶性Nus-PTEN蛋白。该研究为PTEN蛋白的抑癌机理和基因工程药物的研究打下了基础,这是国内PTEN蛋白在原核细胞中成功表达的首次报道。     

骨形成蛋白-2表达载体的构建及其转录活性测定

将骨形成蛋白-2(BMP-2)基因克隆入带HA标签的BMP-2表达载体中,得到带HA标签的重组质粒pGBKT7/HA-BMP-2,将该重组质粒转染酵母AH109、Y187细胞,Western印迹检测表明表达了与预期相对分子质量大小一致的BMP-2.BMP-2表达载体的成功构建为深入研究骨形成蛋白-2在促进骨痂生成过程中的分子机制及其生物学功能打下了基础.     

人趋化因子受体CXCR4基因的克隆及原核表达

目的:构建人CXCR4原核表达载体并在大肠杆菌中进行表达。方法:从健康人外周血单个核细胞提取总RNA,以RT-PCR获得CXCR4基因全长1059bp的完整编码序列,将其克隆入载体pMD-18T中,经限制性内切酶和菌落PCR分析并测序证实的阳性重组子与表达载体pET-28a( )连接并转化大肠杆菌BL21(DE3)。结果:12%SDS-PAGE分析表明,在30℃以IPTG诱导获得分子量为43ku的His-CXCR4融合蛋白表达带,诱导4h后此蛋白表达量约为全菌总蛋白的25%。结论:成功获得人CXCR4基因融合蛋白。     

香菇C91-3菌凋亡相关基因24414功能域片段原核表达载体的构建

目的构建高效快速且方便的His-标签原核表达体系,对香菇C91-3凋亡相关基因24414功能域进行克隆。方法根据香菇C91-3凋亡相关基因24414的基因序列,分别设计特异性上下游引物,采用PCR方法,以24414基因序列为模板,扩增出24414基因的功能域序列。并将功能域基因连入pMD19-TSimpleVector克隆载体中,进行蓝白斑筛选,挑选出阳性菌落,提取质粒经双酶切及PCR验证后,进行基因测序。将克隆载体上目的基因连入pET-32a原核表达载体,构建重组质粒。转化入E．coli JM109宿主菌,经双酶切验证后,进一步测序鉴定验证重组质粒。结果PCR扩增出大小为747bp的基因片段,测序结果显示与香菇C91-3,凋亡相关基因24414的功能域片段同源性为100％,并成功构建了原核表达体系。结论重组原核表达载体pET-32a-24414的成功构建为进一步研究香菇C91-3凋亡相关基因24414功能域的表达纯化及生物学活性奠定了基础。     

嘌呤核苷磷酸化酶基因的克隆及原核表达载体的构建

通过PCR方法从产气肠杆菌、胡萝卜软腐欧文氏菌、大肠杆菌扩增嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase)基因,然后将扩增的约720bp的基因片段克隆到pET-28b表达载体上,构建重组PNPase的表达载体。核苷酸及推导的氨基酸序列分析表明,该基因在三个菌株之间有很高的同源性。SDS-PAGE电泳结果显示出明显的特异性蛋白质条带,其分子量约为29.8kDa.该载体的构建为进一步研究核苷及其类似物的生物合成奠定基础。     

蓖麻RcTUBβ1基因的克隆和原核表达

微管蛋白基因(Tubulin)具有高度的保守性,常作为目标基因相对表达量研究时的内参基因.本研究旨在通过构建蓖麻(Ricinus communis L.)RcTUBβ1基因的原核表达载体pET32a(+)-RcTUBβ1并优化表达工艺以表达融合蛋白His-RcTUBβ1.以蓖麻雌花为材料,通过RT-PCR技术,扩增得到含酶切位点BamHⅠ和Xho Ⅰ 的 RcTUBβ1 基因(GenBank Accession number:XM_002509734.3)的ORF 序列,经双酶切构建原核表达载体pET32a(+)-RcTUBβ1,将pET32a(+)-RRcTUBβ1转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中诱导表达,并考察诱导时间、诱导温度、诱导IPTG浓度对表达的影响.结果表明,所获得的蓖麻RcTTUBβ1 ORF序列与GenBank中的序列一致,长度为1 341 bp,未发生移码突变.IPTG可诱导产生分子量约为68kDa的融合蛋白,最优表达条件为诱导温度28℃、诱导时间7 h和IPTG 0.5 mmol/L,融合蛋白主要以包涵体的形式存在.这为纯化融合蛋白以制备其抗体,用以研究RcTUBβ1的免疫组织化学分布及时空表达模式提供了基础.     

长春花金属硫蛋白基因原核表达载体的构建及表达研究

将从长春花中克隆的金属硫蛋白基因（GenBank登录号：DQ016341）构建到高效原核表达载体pGEX-6P-1,并命名为pGEX-6P-1-CrMT,并对GST-CrMT融合蛋白的表达进行诱导和条件优化。对不同的诱导温度、IPTG诱导浓度和诱导时间等条件的优化结果表明,随诱导时间增长GST-CrMT融合蛋白表达量提高,22℃,24 h和37℃,240 min均能诱导GST-CrMT融合蛋白的最大量表达,在0.8 mmol·L^-1 IPTG浓度下可以有效诱导GST-CrMT融合蛋白的表达。     

HER2胞外段的克隆与原核表达

应用RT-PCR技术从人乳腺癌细胞系SK-BR-3中克隆出人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factorreceptor 2,HER2)基因的胞外段,并插入到表达载体pET-30a中,得到重组表达载体pET30-HER2(Ex)。将该载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)细胞中,加入IPTG进行诱导表达,成功获得HER2胞外段蛋白。分别提取培养液上清、大肠杆菌周质腔、细胞质可溶性及不可溶性组分蛋白进行SDS-PAGE电泳分析,确定目的蛋白定位于大肠杆菌细胞质包涵体中。通过改变诱导温度、诱导物浓度、诱导起始菌体密度和诱导时间,寻找最佳表达条件,使目的蛋白的表达量达到最高。结果表明,在37℃下,OD600达到1.0时,经终浓度为0.1 mmol/L的IPTG诱导4 h,目的蛋白的表达量最高。将重组表达菌进行超声破碎,分离出包涵体组分,经Ni2+亲和层析纯化后获得了纯度>90%的HER2胞外段蛋白,从而为抗HER2抗体的制备及肿瘤疫苗的研究奠定了基础。     

人精子蛋白SP22的cDNA克隆、表达及纯化分析

精子蛋白SP2 2与生殖功能密切相关。睾丸附睾毒物氯醇硝唑作用于大鼠生殖系统时 ,精子表面SP2 2大量脱落至附睾液中 ,导致生育力降低。深入研究发现SP2 2与生育力存在量的关系。从人睾丸组织中提取总RNA ,通过RT-PCR克隆出人睾丸组织中的SP2 2基因 ,连入pGEM Teasyvector进行cDNA克隆测序。再亚克隆到pET-2 8a-c( + )vectors成功构建pET-2 8a-c( + )vectors SP2 2表达载体 ,并转化BL2 1 (DE3) ,以IPTG诱导表达 ,对诱导剂浓度、诱导时间进行优化后以镍离子亲和层析纯化目的蛋白。蛋白表达量占菌体总蛋白 30 %。所得蛋白可推动SP2 2的蛋白结构活性、睾丸组织中的定位分布及在男性不育、癌症等疾病检测中的应用研究。     

兔骨形态发生蛋白15 cDNA部分序列的克隆及其在卵母细胞中的表达(英文）

采用RT-PCR法从新西兰大白兔卵巢中克隆出BMP15基因部分cDNA片段,经blast分析后,发现其与猪、牛、绵羊、山羊、人和小鼠的同源性达到了83%—90%。同时,利用实时荧光定量RT-PCR方法检测了BMP15 mRNA在卵母细胞体外成熟培养过程中（IVM）的表达变化情况,结果表明：在兔卵母细胞体外成熟过程中,该基因在未成熟卵母细胞中表达水平较低,在培养16 h其表达丰度达到峰值,并与卵丘扩展时间相一致,随后下降,推测BMP15可能在兔卵丘细胞扩展中发挥重要作用。     

骨形成蛋白诱导型真核载体的构建及其表达

成骨分化相关基因骨钙素 (OC)等的启动子内均含有成骨特异性转录因子Cbfa1特异性作用元件 ,而骨形成蛋白 (bonemorphogeneticprotein ,BMP)的促成骨分化作用正是通过其首先引起Cbfa1的升高 ,而后Cbfa1激活这些基因的表达 ,最终出现成骨分化表型 .为解决BMP没有理想的活性测定方法的问题 ,在RT PCR结果证实BMP 2可促进NIH3T3和C2C12细胞Cbfa1表达后 ,构建了串联6个Cbfa1作用元件的小鼠OC部分启动子 (6OCP)控制萤光素酶 (luciferase)报告基因的真核表达质粒 ,以期来放大BMP诱导报告基因表达的作用效果 .即通过细胞转染、rhBMP 2刺激后检测萤光素酶活性变化 ,从而间接定量测定rhBMP 2的生物学活性 .结果表明 ,pcDNA3 6OCP Luc转染细胞后其报告基因的基础活性较pcDNA3 Luc大为降低 ;而且在一定剂量范围内 ,转染细胞的萤光素酶活性 (荧光值 )随rhBMP 2剂量增加而升高 ,并呈线性正相关 ,为建立BMP活性定量测定的方法打下基础     

兔骨形态发生蛋白15 cDNA部分序列的克隆及其在卵母细胞中的表达

采用RT-PCR法从新西兰大白兔卵巢中克隆出BMP15基因部分cDNA片段,经blast分析后,发现其与猪、牛、绵羊、山羊、人和小鼠的同源性达到了83%—90%。同时,利用实时荧光定量RT-PCR方法检测了BMP15mRNA在卵母细胞体外成熟培养过程中(IVM)的表达变化情况,结果表明:在兔卵母细胞体外成熟过程中,该基因在未成熟卵母细胞中表达水平较低,在培养16h其表达丰度达到峰值,并与卵丘扩展时间相一致,随后下降,推测BMP15可能在兔卵丘细胞扩展中发挥重要作用。     

大鼠D-双功能蛋白基因原核表达载体的构建及表达

利用原核表达系统构建大鼠D-双功能蛋白表达载体。设计基因拼接引物,通过RT-PCR合成DBP基因cDNA序列,将酶切、纯化的DBP基因与经相同处理的表达载体pET-28 a相连接,转化感受态大肠杆菌DH5α,筛选阳性重组子。将通过酶切及序列分析鉴定阳性的重组子质粒转入感受态大肠杆菌BL21-gold表达菌中,经IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE分析目的蛋白表达情况。结果显示,成功获得了包含DBP基因的双链cDNA序列,酶切、序列分析及Western blotting证实成功构建了DBP基因的原核表达载体。通过原核表达系统,DBP蛋白以包涵体形式产生,复性后可获得高表达的目的蛋白。     

重组人骨形态形成蛋白2在家蚕幼虫中表达及产物纯化

将编码人ＢＭＰ２ｃＤＮＡ基因插入昆虫杆状病毒转移载体ｐＢａｃＰＡＫ１,与修饰的家蚕核形多角体病毒Ｂｍ－ＢａｃＰＡＫＤＮＡ共转染家蚕细胞,通过同源重组得到含有在多角体蛋白基因启动子控制下的ＢＭＰ２ｃＤＮＡ基因的重组病毒Ｂｍ－ＢａｃＰＡＫ－ＢＭＰ２。用重组病毒感染家蚕幼虫,第五天ＢＭＰ２表达率最高,每毫升蚕血淋巴中约１０μｇ表达产物;表达产物在在体内被加工成Ｃ－端１６ｋＤ片段,以二硫键连结成分子量为３０ｋＤ的同源二聚体;经纯化获得９０％以上纯度的成熟ＢＭＰ２,与骨基质胶原结合后植入大鼠皮下,７天后在局部诱导生成软骨组织。     

植原体免疫主导膜蛋白Imp基因原核表达载体构建及表达

旨在构建植原体免疫主导膜蛋白Imp基因原核表达载体,并进行初步表达。以重组克隆质粒pMD18-T-Imp为模板,PCR扩增Imp基因片段。构建表达载体pET-28a(+)-Imp,转化宿主菌E.coliBL21(DE3)。筛选阳性克隆,提取重组质粒作PCR鉴定、酶切鉴定及IPTG诱导表达鉴定。PCR及双酶切结果显示,重组质粒pET-28a(+)-Imp构建成功。经IPTG诱导BL21(pET-28a(+)-Imp)表达约20 kD的蛋白,与预期的携带6×His-Tag的目的蛋白(19.5 kD)大小相符,主要以包涵体形式存在。结果显示,构建的表达载体pET-28a(+)-Imp在E.coliBL21(DE3)中能够达一定量表达,为进一步纯化Imp蛋白奠定基础。     

重组人骨形成蛋白-3羧基端肽在大肠杆菌中表达及其诱骨活性

以双顺反子表达载体,在大肠杆菌中经ＩＰＴＧ诱导表达了人骨形成蛋白－３羧基端肽段（ｈＢＭＰ－３Ｃ）,表达量占菌体总蛋白量的１８．５％．目的蛋白为２５ｋＤ、含ｈＢＭＰ－３Ｃ端２１５个氨基酸残基组成的肽段,包括ｈＢＭＰ－３成熟肽和一部分前肽．表达产物以包涵体的形式存在,用含ＴｒｉｔｏｎＸ－１００的洗涤液和５ｍｏｌ／Ｌ以下脲溶液连续洗涤,可获得较高纯度的重组人骨形成蛋白－３Ｃ端肽．经复性处理成可溶性蛋白,植入小鼠肌肉内,第１４ｄ组织切片显示有软骨细胞和软骨基质形成,第２１ｄ可见成骨细胞和骨基质形成．将ｒｈＢＭＰ－３Ｃ与脱矿去免疫原性异种骨粒复合后作小鼠肌肉植入试验,２１ｄ组织切片上可见硬质骨形成．结果表明：大肠杆菌表达的ｈＢＭＰ－３Ｃ经复性后具有诱骨活性,糖基化并非ＢＭＰ－３活性所必需．