限制性核酸内切酶Bsp 63Ⅰ的纯化及性质研究

用Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ６３菌为材料,经ＤＮＡ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ和ＣｉｂａｃｒｏｎＢｌｕｅＦ３ＧＡ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ两步亲和层析,将Ｂｓｐ６３Ⅰ纯化到均一程度。酶比活力达６１４００Ｕ／ｍｇ蛋白。用凝胶过滤法测得该酶分子量为１１３８００。该酶样品在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ中呈现为一条蛋白带,并测得其亚基分子量为５６８００。用ＤＮＳ－Ｃｌ法测得该酶Ｎ－末端氨基酸为丙氨酸。上述结果表明该酶分子是由两个相同亚基组成。     

限制性核酸内切酶Asc I蛋白质的表达纯化、酶活测定及小角散射结构解析

限制-修饰系统(RMS)是细菌为了防御外来DNA入侵而进化产生的一种保护机制。RMS系统可分为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅳ型。Asc I是一种Ⅱ型限制性核酸内切酶,能识别8-bp DNA基序。尽管Asc I已经被广泛应用于分子克隆研究中,然而目前尚无关于Asc I蛋白质的表达、纯化以及结构机制等方面的研究报道。本研究基于大肠杆菌重组表达体系建立了Asc I重组蛋白质的高效表达和纯化方法,从每升细菌培养物中可获得约2.5 mg纯度大于95%的Asc I蛋白质。进一步的酶学性质研究表明,Asc I酶切反应的最适温度是37℃,最适pH为7.5～8.5,反应依赖于Mg²⁺和Mn²⁺等二价金属离子。基于小角X射线散射(SAXS)分析技术,我们还建立了Asc I蛋白质及其与底物DNA复合物在溶液状态下的三维空间模型,并结合点突变对该模型进行了验证。总之,本研究对Asc I蛋白质的重组表达、纯化、酶活性质以及结构机制进行了比较系统地研究,为了解RMS系统的工作机制提供了结构基础,同时也为Asc I作为分子克隆工具酶的进一步开发和改造提供了理论依据。     

限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）

利用基因重组技术的研究以及产品的制造得到广泛普及，其中的有功之臣就是限制性核酸内切酶。具有识别特定的碱基序列并加以切割的功能。日本东京大学的小宫山真教授为我们就其有关机理及应用用研究进行阐述。[编者按]     

单纯疱疹病毒基因组的限制性核酸内切酶分析

为了获得单纯疱疹病毒(HSV)基因组的限制性核酸内切酶(RE)分析资料和选择合适的RE去研究HSV感染,用11种常用的RE对HSV两个型别的实验室标准毒株的基因组分别作了分析。比较研究的结果表明,BamHI、HpaI和PstI等RE较适于HSV的研究和分型。本研究所采用的小量提取HSV DNA的方法具有快速、简便和实用的特点,值得在HSV感染的诊断、分型和HSV分子流行病学诸研究中推广使用。     

BamHI DNA甲基化酶的纯化及对BamHI限制性核酸内切酶限制作用的保护作用

用硫酸铵盐析、磷酸纤维素柱层析和肝素-Sepharose 4B亲和层析从解淀粉芽孢杆菌(Raviflus amyloliquefaciens)纯化了BamHI DNA甲基化酶。并以λDNA为底物,研究了λDNA被BamHIDNA甲基化酶作用后,对BamHI限制性核酸内切酶的切割产生了明显的阻抗作用。     

BamHI DNA甲基化酶的纯化及对BamHI限制性核酸内切酶限制作用的保护作用

用硫酸铵盐析、磷酸纤维素柱层析和肝素-Sepharose 4B亲和层析从解淀粉芽孢杆菌(Rocllus amyloliquefaciens)纯化了BamHl DNA甲基化酶。并以λDNA为底物,研究了λDNA被BamHl DNA甲基化酶作用后,对BamHl限制性核酸内切酶的切割产生了明显的阻抗作用。     

限制性核酸内切酶或特异位点的DNA内切酶

目前对那些在原核生物中看来普遍存在的特异位点核酸内切酶的看法,由于探索重组DNA技术学的工具而受到了严重地歪曲。仅分离到了具有识别3-7个特异碱基范围序列的酶。当然这些内切酶在复合组基因的分析、“逆转遗传学”(“reverse genetics”)的兴起以及在真核中基因表达区的最近突破,特别是在了解肿瘤病毒RNA的作用过程中和免疫球蛋白的表达中基因重排等方面的用途上在过去的五年深为分子和细胞生物学家们体会到了。已发现了在识别顺序中有交错、对称、不对称及简并巨大多样性。同时考虑到特异位点重组和(或)DNA降解方面的遗传学资料,说明我们现在所收集的内切酶只能代表一个程度极其复杂的特异性窄谱。这些酶本身也为生物物理学家们和生物化学家们提供了探索DNA-蛋白质相互作用的微妙问题的丰富材料。     

几种限制性核酸内切酶

限制性核酸内切酶(简称限制酶)是遗传工程研究不可缺少的工具酶。曾作过一些介绍,新酶不断地扩大,这里仅就Boehringer Mannheim公司商品化生产的几种限制酶列表做一介绍:     

限制性核酸内切酶与DNA相互作用研究进展

蛋白质对ＤＮＡ识别的模体中,除了锌指结构、螺旋—转角—螺旋、亮氨酸拉链和β带外,近年来发现,Ⅱ型限制性内切酶与ＤＮＡ作用的模体有许多特别之处。通过对ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＶ等与ＤＮＡ复合物的空间构象、一级结构分析,发现酶分子存在催化性裂缝,并且氨基端形成臂结构包绕ＤＮＡ;同时ＤＮＡ发生构象变化、螺旋扭结。这些有趣的结构有利于酶对底物的特异性结合和催化作用。     

识别序列外DNA甲基化对限制性核酸内切酶PvuⅡ酶切活性影响的研究

构建了重组质粒ｐＳＶ２ｇｐｔ－ＳＶ４０ｏｒｉ－ａｎｔｉｓｅｎｓｅ－ｒａｓ（简称Ｐ１）,利用这一重组体进一步证实了识别序列外ＤＮＡ甲基化对限制性核酸内切酶ＰｖｕⅡ切割活性的抑制作用,并对这一抑制作用进行了定量研究。结果表明：邻近ＰｖｕⅡ识别位,点的ＤＮＡ甲基化可降低ＰｖｕⅡ对该位点酶切活性的７０％左右。     

限制性核酸内切酶Bsp 63I特性的研究

Ⅱ型限制性核酸内切酶的发现和应用,革命性地推动了分子生物学和遗传工程的发展。不管从酶本身的理论研究或从工具酶的应用研究方面来说,都必须首先确定酶促反应系统的最适条件以及各种因素对酶活性的影响,但是目前关于这类酶促反应条件的确定,多数是根据定性实验和经验,很少是根据定量实验作动力学描述。     

限制性内切酶及相关试题分析

简单介绍限制性内切酶，并通过相关试题分析，帮助学生更好地掌握这类酶的作用。     

三种鱼mtDNA的限制性内切酶分析

鱼类线粒体DNA(mtDNA)的限制性酶切图谱分析,对于探讨鱼类的起源和演化等方面均有十分重要的意义。但是目前有关鱼类mtDNA酶切图谱的研究较少,这主要是受方法学的限制。为此我们改良了一种鱼类mtDNA的提取法,对鲤科的草鱼(Ctenopharyngodon idellus)、鲢鱼(Hypophthalmichthys molitrix)和鳙鱼(Aristi-chthys nobilis)的mtDNA进行了限制性内切酶酶切分析。     

鸭瘟病毒核酸限制性内切酶图谱

鸭瘟病毒(DPV)是一种禽疱疹病毒,引起鸭急性致死性传染病。本病毒自1923年报道后,半个多世纪以来,对其生物学特性等虽有某些研究,但有关分子病毒学研究则国内外尚无报道。本研究通过对DPV DNA的限制性内切酶图谱的分析,为进一步开展DPV的分子病毒学研究提供基础资料,并对DPV的分类地位作些探讨。     

关于限制性核酸内切酶的几个“一定”问题

限制性核酸内切酶是现代分子生物学实验过程中常用的工具酶之一,在不同版本的教材中均作为重点内容要求学生掌握。结合教学实践,从限制性核酸内切酶的识别序列、切割位点及在基因工程中的应用等几个方面进行了比较、分析,进而总结了几个关于限制性核酸内切酶的几个"一定"问题。     

DNA限制性内切酶与RFLP的研究

植物遗传进化及分类学的研究,通常以形态特征特性和数量性状为基础。尽管这些形态学特征都是遗传本质的表现,但环境因素却在遗传表现的过程中起了过大的作用。近年来,运用同工酶谱带和以生化指标为依据进行过不少研究,但仍不能克服环境的影响。当前,DNA限制性内切酶和衍生的限制性片段长度多态性(RFLP)方法,应用于遗传进化及分类学研究,在微生物中做了大量的工作。因为这种研究是直接针对遗传物质——DNA分子的,所以,更为精确和有效。