棉铃虫核型多角体病毒p35基因的PCR扩增和克隆及其在原核细胞中的 …

用苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒凋亡抑制基因ｐ３５的合成引物,从棉铃虫核型多角体病毒基因组中用ＰＣＲ扩增到１ｋｂ片段。采用ＰＣＲ－双脱氧核苷酸链终止银染法,测定了所扩增到的１０１０ｂｐ全序列,发现其开放阅读框完整,长８９７ｂｐ,编码２９９个氨基酸。     

棉铃虫核型多角体病毒凋亡抑制基因对p35基因失活病毒的功能拯救

野生型苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（ＡｃＮＰＶ）能感染棉铃虫细胞,不引起细胞凋亡,用ＬａｃＺ基因使ＡｃＮＰＶ凋亡抑制基因ｐ３５插入失活,得到缺陷病毒Ａｃｐ３５Ｚ能迅速引起棉铃虫细胞凋亡,但缺陷病毒本身不能复制。用ＡｃＮＰＶ即早期基因ＩＥ１启动子带动棉铃虫杆状病毒（ＨａＮＰＶ）ｐ３５基因在棉铃虫细胞中瞬时表达,能拯救ｐ３５基因失活病毒Ａｃｐ３５Ｚ复制。通过Ｘ－ｇａｌ显色反应和ｄｏｔＥＬＩＳＡ分别检测到了半乳糖苷酶的活性和ｐ３５基因的表达,证明了所克隆的ＨａＮＰＶｐ３５基因不仅是一个凋亡抑制基因,也是一个与杆状病毒复制相关的基因,它的瞬时表达能支持Ａｃｐ３５Ｚ在棉铃虫细胞中复制。     

棉铃虫核型多角体病毒sod基因在大肠杆菌中的表达

用PCR方法从棉铃虫(Helicoverpa armigera)单粒包埋型核型多角体病毒(HaSNPV) C1株基因组中扩增sod基因编码区,克隆到pGEM—T—easy vector,测定了核苷酸序列。将基因编码区克隆到原核表达载体pETblue2,构建了含表达质粒pETblue2／HaSNPV SOD,转化大肠杆菌DE3 (BL21)进行IPTG诱导表达。SDS—PAGE分析表明SOD的表达量约为细胞总蛋白的37％。邻苯三酚法测定表达蛋白活性,结果表明每毫克菌体可溶性总蛋白中表达产物校正酶活力单位为694U／mg。     

美国白蛾核型多角体病毒p35基因的克隆及序列分析

对美国白蛾核型多角体病毒（HycuNPV,Hyphantria cunea nucleopolyhedrovirus）p35基因的序列分析表明：HycuNPV p35编码序列900?bp, 编码299氨基酸。同源性分析表明：HycuNPV p35与BomoNPV T3、AucaNPV、SpliNPV、LeseNPV、HearNPV在核苷酸水平上为99.9%、95.7%、93.6%、80.2%和87.2%,在氨基酸水平上为99.7%、90.3%、77%、64.9%和73.2%,显示了杆状病毒p35基因在进化上的保守性。BomoNPV T3中位的H122,在HycuNPV中被R取代。推测HycuNPV p35蛋白的功能及抑制细胞凋亡的能力与BomoNPV T3 p35蛋白的相似。     

中国棉铃虫核型多角体病毒DNA聚合酶基因的克隆和序列分析

应用谷实夜蛾核型多角体病毒（ＨｚＳＮＰＶ）ＤＮＡ聚合酶基因ＨｉｎｄⅢ／ＰｓｔⅠ３５９６ｂｐ片段作探针,经Ｓｏｕｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交,克隆了中国棉铃虫核型多角体病毒（ＨａＳＮＰＶ）完整的ＤＮＡ聚合酶基因,大小约为３．４ｋｂ。限制性内切酶分析表明,ＨａＳＮＰＶＤＮＡ聚合酶基因限制性内切酶图谱与ＨｚＳＮＰＶ相似。用双脱氧链终止法测定该基因部分核苷酸序列（８０５ｂｐ）,推导出编码区２０６ａ。序列同源性比较显示,ＨａＳＮＰＶＤＮＡ聚合酶与ＨｚＳＮＰＶ之间具有高度的同源性;与ＬｄＭＮＰＶ、ＡｃＭＮＰＶ、ＢｍＳＮＰＶ、ＣｆＭＮＰＶ和ＯｐＭＮＰＶ也具有一定的同源性     

棉铃虫核型多角体病毒p40基因序列分析

克隆了棉铃虫(Helicoverpaarmigera)单粒包埋型核型多角体病毒(HaSNPV)基因组HindⅢ-H、J片段,其长度分别为10kb和6.7kb.通过对克隆片段末端测序,得到HaSNPVp40基因全序列.p40基因编码区全长966bp,预计可编码36.kD的多肽.HaSNPVp40基因核苷酸序列与HzSNPVp40基因有98%的相同性.这两种基因与BmNPVp40(GenBank-L33180)和AcMNPVgp41(GenBank-L22858)的氨基酸序列相似性43%左右,但四种蛋白对应于HzSNPVp40、HaSNPVp40的28～277氨基酸区域,同源性高达62%,并且存在一个保守的亲水性结构域.进一步将在基因组中相邻的HindⅢ-H、J两片段用BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ、PstⅠ四种限制性内切酶进行了分析.     

棉铃虫核型多角体病毒基因组结构及p10基因

用BamHI、EcoRV、HindⅢ、KpnⅠ、PstⅠ和XbaⅠ六种限制性内切酶消化HaSNPV C1株基因组DNA,电泳后形成的大于400bp的片段数分别为11、31、13、6、7和25条。预计整个基因组长度为137.7kb左右。构建了HaJSNPV基因组6种限制性内切酶的物理图谱,并在图谱上定位了5个同源重复区hr1、hr2、hr3、hr4和hr5以及多角体蛋白(ph）基因、极早基因（ie1)、p10、几丁质酶（chitinase）基因、DNA聚合酶基因（DNApol）、解旋酶（helicase）基因、超氧化物歧化酶基因(sod）、碱性外切核酸酶基因（alk-exo）、蜕皮甾体尿苷二磷酸葡萄糖转移酶基因（egt）。HaSNPV的基因组结构与其他已知的病毒表现了很明显的差异。p10基因位于BamHI-Ⅰ片段（1.89kb)上,其转录方向与多角体蛋白基因（polh）相反。p10上游为p26基因,下游为p74基因,p26和p10基因转录方向一致,p74基因转录方向与前两者相反。p10基因编码区全长261bp,可编码分子量为9.3kD ,由87个氨基酸残基组成的多肽。编码区上游是一个富含AT区,在起始密码子ATG上游－52bp处有杆状病毒晚期基因启动子典型的转录起始位点元件TAAG,而在翻译终止密码子TGA下游20bp处有转录终止信号AATAAA。     

大肠杆菌\%otsA\%基因的克隆和表达

用ＰＣＲ方法扩增了１．５ｋｂ的ｏｔｓＡ基因片段,将该片段连接到多拷贝克隆载体后转化ｏｔｓＢＡ缺失和ｏｔｓＡ缺陷的大肠杆菌菌株,使转化株重新获得ｏｔｓＡ基因功能。生长曲线表明转化株在高渗培养基中生长良好,薄层层析法（ＴＬＣ）检测海藻糖实验说明转化株细胞诱导后合成海藻糖,ｏｔｓＡ基因的克隆和表达为赋予转基因植物抗高渗、耐干旱能力提供了实验依据和材料。     

L─山梨酮脱氢酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达

参照已知的L－山梨酮脱氢酶基因序列,合成了两个引物序列,以AcetobacterliqueficiensIF012258的染色体DNA为模板进行PCR反应,克隆得到了L－山梨酮脱氢酶基因,经酶切验证与预期结果相同,序列测定结果也与已知序列一致。采用PCR方法在此基因的两端加上了E．coRI和HindⅢ两个酶切位点,经E．coRI和HindⅢ酶切后去掉了两端的多余序列后,将此片段连接到pKKH上,经诱导无蛋白表达,采用RcaI酶切启动子端,对载体pKKH则采用Mcol酶切,使表达载体的SD序列     

纳豆激酶基因在E.coli HB101中的初步表达研究

利用PCR技术以纳豆杆菌染色体DNA为模板扩增纳豆激酶基因,将该基因克隆到温度诱导型表达形体pVB220上,转化E．coliHB101,获得转豆激酶基因重组菌。在确定了其最佳培养时间与诱导时间后,SDS－PAGE分析结果表明基因表达产物为分泌型,蛋白表达量占菌体蛋白的12％左右,液体发酵后纳豆激酶产量可达120U／ml菌液,对重组菌中重组质粒的稳定性进行研究,结果表明该质粒在宿主菌中具有良好的分离稳定性,而结构稳定性较差。     

乌龟Sox gene的PCR扩增及其条件

参照人SRY gene HMG-box保守区的序列,设计一对引物,扩增了乌龟的Sox gene,并对扩增条件进行了优化。结果显示乌龟Sox gene的扩增片段与人SRY gene扩增片段大小相同,为220bp左右,且雌雄个体间无差异;最佳扩增条件为：Mg^2 2.0mM、dNTP120μM、引物0.3μM及退火温度52℃。本研究为探索乌龟的性别决定机制以及Sox gene进货的保守性提供分子资料。     

雨生红球藻质体球滴结构蛋白基因的克隆与原核表达

叶绿体或者有色体中的质体球滴结构(Plastoglobules)是多数植物的类胡萝卜素等次生代谢产物积累的场所,但在能大量积累虾青素的雨生红球藻中,这个结构一直没有得到确认。通过透射电子显微镜观察发现雨生红球藻的质体内确切存在plastoglobules结构;并通过RT-PCR结合RACE技术,从雨生红球藻cDNA文库中克隆到了与编码plastoglobules的结构蛋白(Plastoglobulin)具有高度同源性的基因序列全长,称做Hpgp基因;该基因的表达产物称之为雨生红球藻质体球滴蛋白(HPGP;Haematococcus plastoglobules pro-tein);并进一步利用原核表达系统将该编码基因进行原核诱导表达,用His-Tag蛋白分离纯化系统纯化到了目标蛋白,并用该His-Tag融合蛋白为抗原免疫实验兔,制备到了相应的一抗抗体,为下一步对该蛋白的功能阐明以及雨生红球藻的虾青素积累机制研究提供重要的基础。     

邻单胞菌邻苯二酚1,2-双加氧酶基因(tfd C)的克隆及其在大肠杆菌中表达

根据已报道的邻苯二酚１,２－双加氧酶基因（ｔｆｄ Ｃ）序列,设计ＰＣＲ引物,从一株邻单胞菌（Ｐｌｅｓｉｏｍｉｎａｓ）的ｐＬ１质粒上扩增到ｔｆｄ Ｃ基因片段,连接到ｐＧＥＭ－Ｔ载体上,并转化大肠杆菌ｌＭ１０９菌株,筛选到阳性克隆。序列分析结果表明,ＰＣＲ产物全长８０１ｂｐ,有一阅读框,编码２５５个氨基酸,与增氧产碱菌（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｌｕｓ）的ｔｆｄ Ｃ基因相比,在６９３位相差一     

日本三角涡虫hsp70 cDNA克隆及原核表达

热休克蛋白70 是热休克蛋白家族中的重要成员, 它在保护生物体免受各种胁迫中发挥重要作用。由于其惊人的再生能力, 淡水涡虫作为研究再生和发育的模式动物受到研究者关注。但是, 有关涡虫抗逆性的分子机制却少有报道。研究采用 RACE (Rapid amplification of cDNA end) 技术首次从日本三角涡虫中克隆出hsp70 (Djhsp70)全长cDNA 序列。Djhsp70 cDNA 全长2066 bp, 含有1947 bp 的开放阅读框, 编码648 个氨基酸, 分子量71.18 kD, GenBank 登录号EU380241。DjHSP70 的氨基酸含有真核生物HSP70 家族蛋白的三个标签序列(9–16 位的IDLGTTYS、199—206 位的 DLGGGTFD、334–339 位的IVLVGG)和末端高度保守序列EEVD。经BLAST 检索分析, Djhsp70 的核苷酸序列和推定的氨基酸序列与目前已知HSP70 家族成员高度同源。有趣的是, HSP70 亲缘关系分析表明: 涡虫更靠近脊椎动物, 而与无脊椎动物果蝇和线虫相距较远。为了制备抗体研究DjHSP70 的组织学定位, 实验还成功构建了DjHSP70 表达载体, 在IPTG 诱导下表达出约76 kD 的融合蛋白。Djhsp70 cDNA 的克隆与表达载体的构建为下一步工作奠定了基础。       

查尔酮异构酶基因的克隆序列分析及在大肠杆菌中的表达

从矮牵牛(Petunia hybrida Vilm.)花瓣的cDNA中克隆了查尔酮异构酶(chalcone isomerase,CHI)的基因chi-a,进行了序列分析。结果表明,chi-a基因全长726 bp,编码241个氨基酸。并在大肠杆菌中表达了chi-a基因,对来源于不同植物种的CHI进行了同源性比较分析。