焦磷酸测序测定SNP的常见问题与解决方法

目的：探讨焦磷酸测序技术对单核苷酸多态性分型因测序图谱中存在的一些典型问题而导致分型结果不准确的解决方法。方法：以VKORC1基因1639 G〉A位点、CYP2C19基因636 G〉A位点及UGT1A1基因TA重复序列（TA）6〉（TA）7的多态性检测为例,分别采用优化PCR条件、改变测序时dNTP的加入顺序以及设立外标校正的方法来解决上述问题,从而提高焦测序对SNP分型的准确性。结果：通过升高PCR退火温度,可以显著提高VKORC1基因的扩增特异性,降低了测序图谱中非特异性信号峰强度;通过优化测序时dNTP的加入顺序,CYP2C19基因636 G〉A位点的准确分型结果可通过观察测序图谱中相关信号峰的有无而简单获得,避免了比较信号峰的相对强度;通过比较待测样本与已知基因型的外标样本的测序图谱来确定待测样本的基因型,提高了对UGT1A1基因TA重复序列（TA）6〉（TA）7多态性的分型准确性。结论：本文针对焦测序在测定SNP时的常见问题所提出的相应解决方法不仅简单、经济有效,而且在临床应用方面具有可靠性。     

焦磷酸测序测定SNP的常见问题与解决方法

目的:探讨焦磷酸测序技术对单核苷酸多态性分型因测序图谱中存在的一些典型问题而导致分型结果不准确的解决方法。方法:以VKORC1基因1639 GA位点、CYP2C19基因636 GA位点及UGT1A1基因TA重复序列(TA)6(TA)7的多态性检测为例,分别采用优化PCR条件、改变测序时dNTP的加入顺序以及设立外标校正的方法来解决上述问题,从而提高焦测序对SNP分型的准确性。结果:通过升高PCR退火温度,可以显著提高VKORC1基因的扩增特异性,降低了测序图谱中非特异性信号峰强度;通过优化测序时dNTP的加入顺序,CYP2C19基因636 GA位点的准确分型结果可通过观察测序图谱中相关信号峰的有无而简单获得,避免了比较信号峰的相对强度;通过比较待测样本与已知基因型的外标样本的测序图谱来确定待测样本的基因型,提高了对UGT1A1基因TA重复序列(TA)6(TA)7多态性的分型准确性。结论:本文针对焦测序在测定SNP时的常见问题所提出的相应解决方法不仅简单、经济有效,而且在临床应用方面具有可靠性。     

焦磷酸光化测序技术的发展和应用

人类基因组计划(Human Genome Project, HGP)不仅极大地提高了人类对基因组和相关遗传信息的认识水平,而且促进了生命科学研究技术的发展和应用。正是在这样的历史背景下,焦磷酸光化测序技术(pyrosequencing)由瑞典研究人员发明。焦磷酸光化测序技术的基础原理是基于"通过合成测序"原理进行酶促反应的DNA测序方法,通过基于释放焦磷酸盐时的链式反应的可见光检测,即可获得一个特异的检测峰,峰值的高低和相匹配的碱基数成正比。该技术可应用于DNA核苷酸序列和突变的检测、单核苷酸多态性的基因型的鉴定,以及DNA甲基化水平变化的分析等。近年来,随着摄影器材和成像技术的快速发展,这项技术的原理是基于通过酶促反应而实时检测可见光,因此,有望在检测的敏感性方面得到更进一步的发展。该文根据笔者在瑞典近三十年的工作经验和积累的文献,首先阐明焦磷酸光化测序的基本原理,然后介绍该技术的应用,最后讨论其发展前景。     

焦磷酸测序技术其在分子生物学领域的应用

焦磷酸测序技术是一项新型DNA测序技术。在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶的协同作用下,将引物上每个dNTP聚合与一次荧光信号释放偶联起来,通过检测荧光的释放和强度,达到实时测定DNA序列的目的。操作中不需要电泳、样品标记和染色,具有高度的可重复性,并行性和自动化特点,本综述了焦磷酸测序技术的基本原理,测序过程和它在SNPs研究,病原微生物的快速鉴定、病因学分析、法医鉴定等方面应用。     

基于焦磷酸测序分析技术的金银花掺伪鉴别方法研究

金银花是大宗药材,市场掺伪时有发生,但目前的检测方法不能满足快速准确的检测需求,因此亟需建立快精准的检测方法。为了确立高精准度和大通量的金银花掺伪鉴别检测方法,结合SNP标记及焦磷酸测序分型分析技术,对金银花及其常见伪品差异性SNP位点进行PCR扩增及焦磷酸测序分析。结果发现,运用焦磷酸测序技术对金银花和山银花的差异性SNP位点进行定量分析,能够对金银花真伪及掺伪量进行鉴定。该方法兼有PCR技术的灵敏性和焦磷酸测序技术的准确性,具有重复性好、自动化程度较高、易操作的特点,能在3小时之内完成金银花成分掺伪量的检测工作,并得出量化结果。     

焦磷酸测序技术在禽流感病毒金刚烷胺耐药性检测中的应用

流感病毒M2蛋白五个关键位点氨基酸残基(第26、27、30、31和34位)中的任何一个发生突变都会导致抗流感病毒药物中金刚烷胺抗药性的产生。本研究利用焦磷酸测序技术对94株不同亚型禽流感病毒金刚烷胺耐药性分子决定区进行了鉴定,并进行抗药性分析。结果表明94株禽流感病毒中有81株M2基因存在金刚烷胺耐药性的分子标签,其余的13株根据分子标签判断为对金刚烷胺敏感。耐药性的分子标记存在V27I和S31N两种突变形式,其中绝大多数为S31N。     

基于焦磷酸测序技术的 基因突变检测在精准医疗中的应用研究进展

基因突变检测在肿瘤等疾病的早期诊断、个体化给药指导、疾病治疗进程与耐药监控等方面具有极其重要的意义。随着测序技术的 不断发展,DNA 突变的检测与分析已为病毒感染、血液病和实体瘤等疾病的个体化诊治提供重要参考。焦磷酸测序技术是一种基于生物发 光法测定焦磷酸盐的实时 DNA 测序技术,其用于 DNA 序列分析时不需电泳和荧光标记,定量性能好,结果准确,易于实现自动化,在基 因突变检测分析与肿瘤等疾病诊治中发挥巨大作用。综述基于焦磷酸测序技术的基因突变检测在分子靶向个体化治疗和疾病诊断中的应用 研究进展。     

焦磷酸测序检测食品中鼠伤寒沙门氏菌

根据鼠伤寒沙门氏菌的特异序列,分别设计扩增引物和测序引物,建立焦磷酸测序检测鼠伤寒沙门氏菌的方法。针对鼠伤寒沙门氏菌设计特异性扩增引物,对目标片段进行PCR扩增,然后制备单链模板,并利用测序引物进行焦磷酸测序。测序结果表明,6株不同来源的鼠伤寒沙门氏菌均可以扩增出碱基序列为TACAACCGGA GTGCACATTA ATCCCGCAGC的基因片段,而30株阴性对照菌株均未得到扩增。进行BLAST比对表明,该序列与GenBank中鼠伤寒沙门氏菌的碱基序列100%匹配。焦磷酸测序法是一种快速、准确的检测方法,可用于食品中鼠伤寒沙门氏菌的快速检测。     

应用焦磷酸测序技术快速检测猪流感病毒金刚烷胺耐药性的分子标签

【目的】本研究旨在通过焦磷酸测序技术对我国分离的H1N1、H3N2、H9N2等3种基因型的10株猪流感病毒分离株进行金刚烷胺耐药性鉴定。【方法】流感病毒M2蛋白5个关键位点氨基酸残基(第26、27、30、31和34位)中的任何一个发生突变会导致抗流感病毒药物中金刚烷胺抗药性的产生。本研究利用焦磷酸测序技术对2004-2008年国内分离的10株猪流感病毒M基因金刚烷胺耐药性分子决定区进行了鉴定,并进行抗药性分析。【结果】基于M2蛋白基因保守区序列建立的焦磷酸测序技术能用于国内猪流感病毒的快速检测,且具有较好的特异性和重复性。抗药性分析表明10株猪流感病毒国内分离株中5株H1N1分离株全部耐药,主要存在M2蛋白的V27T、V27I或S31N位点的突变,而4株H3N2和1株H9N2猪流感病毒分离株在M2蛋白5个关键位点上均未出现变异,表明其对金刚烷胺敏感。【结论】基于M基因的焦磷酸测序技术可以用于我国猪流感病毒金刚烷胺耐药性快速鉴定。     

乙肝治疗耐药基因突变的焦磷酸测序技术诊断

目的:建立焦磷酸测序技术检测拉米夫定和阿德福韦酯治疗乙肝所致乙肝病毒基因耐药突变的定量检测方法,为临床乙肝耐药诊断和治疗提供依据。方法:针对乙肝病毒DNA聚合酶基因序列上4个常见基因突变位点的6种突变形式,分别克隆构建野生型和突变型质粒作为标准品,应用生物信息学手段设计目标基因通用PCR引物和各突变点的焦磷酸测序引物,建立焦磷酸测序的突变检测方法。对接受拉米夫定、阿德福韦酯治疗的慢性乙型肝炎患者血清标本进行检测。结果:构建了乙肝病毒四种常见耐药性突变的标准株和变异株克隆,建立了分别或同时检测拉米夫定、阿德福韦酯耐药突变的焦磷酸测序方法,对68例临床耐药或疑似耐药的患者血清标本进行检测,双脱氧测序验证,检出拉米夫定耐药突变32例,阿德福韦酯耐药突变5例,其中焦磷酸测序检出20例为混合突变,而双脱氧测序显示为6例。结论:成功建立了焦磷酸测序定量检测拉米夫定、阿德福韦酯耐药基因突变的方法,构建了乙肝病毒耐药基因突变的标准质粒,为临床动态监测乙肝病毒变异病毒株、指导合理用药奠定了基础。     

乙肝治疗耐药基因突变的焦磷酸测序技术诊断

目的：建立焦磷酸测序技术检测拉米夫定和阿德福韦酯治疗乙肝所致乙肝病毒基因耐药突变的定量检测方法,为临床乙肝耐药诊断和治疗提供依据。方法：针对乙肝病毒DNA聚合酶基因序列上4个常见基因突变位点的6种突变形式,分别克隆构建野生型和突变型质粒作为标准品,应用生物信息学手段设计目标基因通用PCR引物和各突变点的焦磷酸测序引物,建立焦磷酸测序的突变检测方法。对接受拉米夫定、阿德福韦酯治疗的慢性乙型肝炎患者血清标本进行检测。结果：构建了乙肝病毒四种常见耐药性突变的标准株和变异株克隆,建立了分别或同时检测拉米夫定、阿德福韦酯耐药突变的焦磷酸测序方法,对68例临床耐药或疑似耐药的患者血清标本进行检测,双脱氧测序验证,检出拉米夫定耐药突变32例,阿德福韦酯耐药突变5例,其中焦磷酸测序检出20例为混合突变,而双脱氧测序显示为6例。结论：成功建立了焦磷酸测序定量检测拉米夫定、阿德福韦酯耐药基因突变的方法,构建了乙肝病毒耐药基因突变的标准质粒,为临床动态监测乙肝病毒变异病毒株、指导合理用药奠定了基础。     

耐热荧光素酶的表达及热稳定焦磷酸测序体系的建立

焦磷酸测序是一种基于生物发光反应的实时DNA序列测定技术,其反应体系中的荧光素酶决定测序反应的灵敏度。传统焦测序反应使用的是野生型北美荧光素酶Photinus pyralis luciferase(PpL),该酶热稳定性较差,因此由该酶配制的焦磷酸测序反应体系对热不稳定,影响焦磷酸测序的灵敏度。为了建立热稳定的焦磷酸测序反应体系,全合成了耐热突变日本萤火虫荧光素酶的编码序列,并将其插入到表达载体pET28a(+)中构建重组质粒,将重组质粒转化到大肠杆菌中,筛选得到的阳性重组菌成功表达了N端带有6×His(组氨酸)标签的耐热突变日本萤火虫荧光素酶。利用镍亲和层析法,纯化得到了分子量约为60 kDa且比活为4.29×1010RLU/mg的重组蛋白。对重组耐热日本萤火虫荧光素酶的热稳定性研究结果表明,该酶在50℃时仍具有活性,在40℃下孵育25 min后活性保留了90%以上。与基于野生型北美荧光素酶的焦磷酸测序体系相比,由耐热日本萤火虫荧光素酶配制的测序反应体系对热稳定性有了极大的提高,该测序反应液在37℃放置1 h后仍能够得到正确的测序结果。研究结果为建立稳定可靠的现场及时快速焦磷酸测序反应体系奠定了基础。     

微测序技术分析人类单核苷酸多态性

单核苷酸多态性 (singlenucleotidepolymorphism)是指染色体基因组水平上单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性 ,即一种二等位基因标记。目前推断在基因组中至少有 30万个SNP[1 ] 。随着分子遗传学的发展 ,疾病研究从对单基因疾病的研究转向探讨多基因疾病 (如心血管疾病、神经系统疾病、各种肿瘤等 )的相关因素。因此 ,需要在人类基因组中找到一种数目众多、分布广泛且相对稳定的遗传标记 ,单核苷酸多态性正代表了这样一种标记。因此SNPs已成为继第一代限制性片段多态性标记 ,第二代微卫星多态性标记后具有重要研究价值的第三代基因遗传…     

454高通量焦磷酸测序法鉴定膜生物反应器膜污染优势菌种

【目的】对诱发膜-生物反应器(Membrane bioreactors,MBR)膜污染的优势菌种进行研究。【方法】利用454高通量焦磷酸测序法对MBR污泥混合液样品与膜污染物样品中微生物信息进行统计,并对两组样品的Chao丰度指数与Shannon生物多样性指数计算,对测序结果进行系统发育学分析。【结果】从污泥混合液样品与膜污染物样品中获得9 353与7 504条优化序列,发现膜污染物中微生物丰度与多样性均高于污泥混合样品。借助基因频谱对OTU分布特点进行统计,表明源于污泥混合液中的微生物在膜表面定殖生长过程中发生了种群变化,在膜面污染物样品中,β-变形菌纲丰度显著降低,α-变形菌纲、γ-变形菌纲与Phycisphaerae在微生物种群结构中比重增加。【结论】454焦磷酸测序分析表明,黄色单胞菌(Xanthomonadaceae),嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter),Phycisphaera以及2株尚未培养出的细菌(Candidate_division_TM7及Candidate_division_OD1)是诱发MBR膜污染的优势菌种(微生物丰度1%)。诱发膜污染的细菌既包括了黏性高、表面疏水的种类(如γ-变形菌),从而引发细菌在膜表面的定殖,也包括了代谢能力强的物种(如Candidate_division_OD1)可以确保种间递氢顺畅。     

基于焦磷酸测序技术建立基因编辑水稻检测方法

基因编辑技术发展迅速,但对应的检测方法较少。为寻找创建基因编辑作物适用的检测方法,以 PL3 基因编辑水稻编辑位点为靶标,有效设计了焦磷酸测序的扩增引物及测序引物,并进行有效性检测,分别利用Sequence to Analyze等程序以及SNP和AQ两种模式完成了对PL3 基因的定性和定量检测试验,建立了 PL3 基因编辑水稻编辑位点焦磷酸测序检测方法。结果表明,基于焦磷酸测序技术可以通过检测编辑位点从而将基因编辑型水稻与野生型水稻进行区分。与常规的转基因检测方法相比,该检测方法具有较好的准确性、高效性及高灵敏度等优点,在基因编辑型水稻编辑位点定性和定量检测分析方面具有很好的应用前景。     

焦磷酸测序技术在确认北京严重急性呼吸综合征(SARS)病毒株并检测基因突变中的应用

结合严重急性呼吸综合征(SARS)病毒株序列信息分析和高通量测序技术,建立一种快速、简单地确定SARS病毒株并筛查SARS病毒突变位点和突变频率的方法。从感染人SARS病毒的Vero-6细胞中提取病毒RNA,反转录为cDNA后,PCR扩增目的基因片段,采用焦磷酸测序技术(Pyrosequencing Technology,PSQ)进行第2601、7919、9479、19838多个碱基突变位点测序和突变频率分析。通过测序分析多个可能出现突变的位点,确定了该病毒为北京流行株,同时发现第7919位碱基发生了A／G突变。PSQ技术对于高通量筛选研究病毒基因的突变和确定病毒株型别有着简单、快速、灵敏的特点。利用生物信息学分析核酸多态性,结合实验验证,可以确定SARS病毒流行株的特征,有利于对突发事件及早确定传染来源。     

焦磷酸测序法检测OCT4启动子在大鼠骨髓源性肝干细胞分化中的甲基化变化

骨髓间充质干细胞具有分化成为肝细胞的潜能已得到证实,但其分化的调控机理还不完全清楚。通过检测大鼠骨髓源性肝干细胞(rat bone marrow-derived liver stem cells,RBMLSCs)诱导分化为肝细胞过程中OCT4启动子甲基化的变化,来探讨启动子甲基化调控细胞分化的机制。RBMLSCs用25μg/L重组人肝细胞生长因子和0.1 nmol/L地塞米松进行诱导,在诱导之后不同时间点(0 d,7 d,14 d)提取细胞的DNA及RNA。用荧光定量PCR法检测白蛋白(albumin,Alb)和OCT4的m RNA表达水平,应用焦磷酸测序法定量检测OCT4基因的启动子中4个Cp G位点的甲基化变化。结果表明:在RBMLSCs分化过程中,Alb m RNA持续增高(P0.05),但OCT4 m RNA表达在7 d及14 d明显减少(P0.005);同时OCT4启动子上游的Cp G 1-2-3甲基化频率显著上升(P0.001),但Cp G 4甲基化无明显变化。这些结果说明OCT4启动子高甲基化可能导致其m RNA表达减少,RBMLSCs多能性消失,但Cp G 4并不参与这一分化调控过程。     

利用DNA池和测序技术快速筛查SNPs及估算基因频率

选取产蛋性能具有明显差异的4个鸡品种(莱航鸡、阳山鸡、丝羽乌骨鸡和隐性白洛克鸡)构建品种DNA池,采用测序的方法研究鸡催乳素基因5′侧翼调控区远端序列(1028bp)的多态性,快速筛查到8个可能与产蛋性能相关的SNPs(C-2402T、T-2192C、C-2161G、C-2134G、C-2062G、G-2040A、A-1944G和C-1884A)。进一步利用测序图中SNP等位基因峰高的比值估算各鸡品种等位基因的频率,其中C-2402T、C-2161G、C-1884A和C-2062G、G-2040A位点等位基因频率的估算结果分别被PCR-RFLP、PCR-SSCP所验证,说明测序峰高比值估算等位基因频率的方法具有一定的可行性。     

第三代测序技术在微生物研究中的应用

1977年Sanger发明的双末端终止法开启了测序之旅,而测序技术在30多年内不断革新。每种新技术的出现都有超过前代产品的独特之处,但也会不可避免的存在自身局限性,关键在于掌握每种技术的优缺点并加以合理应用。第三代测序技术是一种集高通量、快速度、长读长及低成本等多种优点于一身的新型测序技术,它的出现为基因组学、转录组学及DNA甲基化等研究注入了新活力。本文在介绍基本技术原理的基础上,着重概述了第三代测序技术在微生物研究中的应用,从而揭示了其广泛的应用前景。     

重组大肠杆菌单链结合蛋白性质表征及其在提高焦磷酸测序准确性中的应用

利用基因工程手段表达了分子量约为24 kDa的重组大肠杆菌单链结合蛋白 (r-SSBP),通过凝胶阻滞电泳与DNA熔解温度 (Tm) 影响实验表征了r-SSBP与单链DNA (ssDNA) 结合的特性,结果表明,r-SSBP可以与ssDNA结合,并且能够降低DNA的Tm值,同时还能增大含有单个错配碱基的DNA与完全匹配的DNA的Tm值差异,这一特性在提高单核苷酸多态性检测的特异性方面具有潜在的应用价值。此外,将r-SSBP应用于本课题组开发的高灵敏度焦磷酸测序体系中测定已知序列ssDNA模板,结果表明,r