重组大肠杆菌合成聚(3-巯基丙酸)和聚(3-羟基丁酸-3-巯基丙酸)的研究

利用Clostridium acetobutylicum的丁酸激酶基因 (buk) 和磷酸转丁酰基酶基因(ptb),以及Thiocapsa pfennigii的PHA合成酶基因,设计了一条能够合成多种聚羟基烷酸的代谢途径,用构建的质粒转化大肠杆菌,获得了重组大肠杆菌菌株.前期的研究表明,在合适的前体物条件下,该重组大肠杆菌能够合成包括聚羟基丁酸、聚(羟基丁酸-戊酸)等多种生物聚酯[Liu and Steinbüchel, Appl. Environ. Microbiol. 66739-743].利用该重组大肠杆菌,通过生物催化作用合成了3-巯基丙酸的同型共聚酯,同时利用该重组大肠杆菌还获得了含3-巯基丙酸单体的多种异型共聚物.实验首先研究了3-巯基丙酸对大肠杆菌生长的影响,在此基础上优化了培养过程中添加3-巯基丙酸的时机和浓度,结果表明,在实验的条件下,细胞合成聚(3-巯基丙酸)可达6.7%(占细胞干重),合成聚(3-羟基丁酸-3-巯基丙酸)(分子中3-巯基丙酸3-羟基丁酸=31)可达24.3%.实验进一步研究了同时或分别表达以上3个基因的重组大肠杆菌合成聚合物的能力,结果表明只有当3个基因同时表达时才能合成聚合物,说明3个基因对合成过程是必须的,从而表明了合成途径是按照设计的路线进行的.还通过GC/MS、GPC、IR等手段对合成的化合物进行了定性的研究.聚(3-巯基丙酸)或聚(3-羟基丁酸-3-巯基丙酸)等聚酯属于一类新型生物聚合物,它在分子骨架中含有硫酯键,不同于聚羟基烷酸酯的氧酯键,从而具有显著不同的物理、化学、光学等性质和具有重要的潜在应用价值.     

高效启动子在微生物生产4-羟基丁酸中的应用

4-羟基丁酸(4HB)是一种精神类药物,还可用于合成聚-4-羟基丁酸酯(P4HB)、聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)(P3HB4HB)等聚合物。在醇脱氢酶(DhaT)和醛脱氢酶(AldD)的共同作用下,1,4-丁二醇(BD)可转化为4-羟基丁酸。通过引入T7和PRe两种高效启动子,加强了dhaT和aldD基因的表达,促进合成4-羟基丁酸的反应进行。同时还研究了底物1,4-丁二醇的浓度对4HB生产的影响。结果表明:提供10 g/L的1,4-丁二醇,受PRe启动子调控的重组菌A.hydrophila 4AK4(pZQ01)可生产6.00 g/L的4-羟基丁酸,比对照组提高43.20%;而受T7启动子调控的重组菌A.hydrophila 4AK4(pZQ04)可生产4.87 g/L 4-羟基丁酸,比对照组提高16.23%。意味着T7和PRe这两种启动子确实发挥了提高基因表达水平的作用,加速了4-羟基丁酸的生物合成。     

Bacillus megaterium WZ009催化合成(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯和(S)-3-羟基-γ-丁内酯

以外消旋4-氯-3-羟基丁酸乙酯为唯一C源的富集培养筛选得到一株菌株WZ009,经16S rDNA测序鉴定为巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)。B.megaterium WZ009静息细胞可以立体选择性催化(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯水解和脱氯反应得到光学纯的(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(e.e.≥99%)和(S)-3-羟基-γ-丁内酯(e.e.≥95%)。笔者对B.megaterium WZ009不对称催化反应影响因素(温度、pH、中和剂、底物浓度、时间进程以及细胞重复利用)进行优化研究,确定了该反应体系最优条件:底物浓度200 mmol/L,中和剂氨水,pH 7.2,40℃反应12 h,转化率达到50.6%,底物对映体过量值为99.6%。该生物催化合成(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯和(S)-3-羟基-γ-丁内酯过程具有良好的工业化应用前景。     

重组大肠杆菌合成聚（3-巯基丙酸）和聚（3-羟基丁酸-3-巯基丙酸）的研究

利用Clostridium acetobutylicum的丁酸激酶基因 (buk) 和磷酸转丁酰基酶基因(ptb),以及Thiocapsa pfennigii的PHA合成酶基因,设计了一条能够合成多种聚羟基烷酸的代谢途径,用构建的质粒转化大肠杆菌,获得了重组大肠杆菌菌株。前期的研究表明,在合适的前体物条件下,该重组大肠杆菌能够合成包括聚羟基丁酸、聚（羟基丁酸戊酸）等多种生物聚酯［Liu and Steinbüchel, Appl. Environ. Microbiol. 66:739743］。利用该重组大肠杆菌,通过生物催化作用合成了3巯基丙酸的同型共聚酯,同时利用该重组大肠杆菌还获得了含3-巯基丙酸单体的多种异型共聚物。实验首先研究了3巯基丙酸对大肠杆菌生长的影响,在此基础上优化了培养过程中添加3-巯基丙酸的时机和浓度,结果表明,在实验的条件下,细胞合成聚（3-巯基丙酸）可达6.7%(占细胞干重),合成聚（3-羟基丁酸—3-巯基丙酸）（分子中3-巯基丙酸:3-羟基丁酸=3:1）可达24.3%。实验进一步研究了同时或分别表达以上3个基因的重组大肠杆菌合成聚合物的能力,结果表明只有当3个基因同时表达时才能合成聚合物,说明3个基因对合成过程是必须的,从而表明了合成途径是按照设计的路线进行的。还通过GC/MS、GPC、IR等手段对合成的化合物进行了定性的研究。聚（3-巯基丙酸）或聚（3-羟基丁酸-3-巯基丙酸）等聚酯属于一类新型生物聚合物,它在分子骨架中含有硫酯键,不同于聚羟基烷酸酯的氧酯键,从而具有显著不同的物理、化学、光学等性质和具有重要的潜在应用价值。     

删除Loop区域表面不稳定氨基酸提高 (R)-ω-转氨酶热稳定性

手性胺是一类具有重要价值的医药及精细化工中间体,如何实现手性胺类化合物的不对称合成是目前人们普遍关注的一个焦点问题。ω-转氨酶(ω-Transaminase,ω-TA)是一类能直接合成对映体手性胺的天然生物催化剂。相比于(S)-ω-TA,(R)-ω-TA的研究较少,但其需求量随着手性胺类药物的发展日趋增大。提高具有潜在应用价值的(R)-ω-TA的热稳定性,将有利于手性胺的制备。本文利用Py MOL软件和YASARA软件预测来源于土曲霉Aspergillus terreus的(R)-ω-TA中具有高温度因子(B-factor)的Loop区域,通过定点突变对Loop区域表面不稳定氨基酸逐步进行删除获得突变酶。结果表明,突变酶R131del和突变酶P132-E133del半失活温度分别为41.1℃和39.4℃,比野生酶提高了2.6℃和0.9℃;在40℃下的半衰期分别为15.0 min和10.0 min,为野生酶的2.2倍和1.5倍。此外,在400 K和10 ns的分子模拟条件下,突变酶R131del在Loop区域的均方根涨落(Root mean square fluctuation,RMSF)比野生型低,突变酶P132-E133del在Loop区域增加了4个氢键。本研究通过删除(R)-ω-转氨酶Loop区域表面不稳定氨基酸提高了该蛋白的热稳定性,同时也为其他酶热稳定性的理性设计提供了方法学指导。     

(2R,3S,4S)-2-(N,N-二乙氨基)甲酰氧基-3-苯基-4-苯甲酰基-N-甲基-Y-内酰胺的合成及工艺研究

目的:通过对黄皮酰胺全合成中间体(2R,3s,4S)-2-羟基-3-苯基-4-苯甲酰基-N-甲基-Y-内酰胺(化合物A)2位羟基的酯化,提高脂水分配系数(1gP),考察对谷丙转氨酶活性的影响。方法:以化合物A为原料,通过酰化反应合成(2R,3S,4S)-2-(N,N-二乙氨基)甲酰氧基-3-苯基-4-苯甲酰基-N-甲基-Y-内酰胺(化合物B),重点考察了摩尔比、反应温度、反应时间等条件对反应的影响。化合物B结构已经元素分析、红外光谱、质谱及核磁共振氢谱确证。结果:化合物A和酰化剂以摩尔比2:3,在160℃下反应1h,目标化合物B,收率78．42%。结论:本合成路线及具体反应方法,具有试剂廉价易得、反应条件温和、后处理简便等优点,是一种较为实用的合成方法。     

基于脱氢松香酸的酰氯的合成

以脱氢松香酸(1)为起始原料合成了7-异丙基-1,10-二甲基-1,2,3,4-四氢蒽-1-羧酸酰氯(8)。随后利用核磁共振波谱技术研究了其对外消旋α-苯乙胺的手性识别能力。实验结果表明:主体手性酰氯对外消旋的手性胺表现出了良好的识别效果,与其手性碳相连的甲基碳原子的ΔΔδ值高达0.33 ppm。     

一种来源于运动替斯崔纳菌KA081020-065的新型卤醇脱卤酶的表达纯化及性质分析

卤醇脱卤酶(Halohydrin dehalogenase)不仅对于含氯污染物的生物降解、净化环境具有重要意义,而且在手性医药中间体合成中也是一种重要的生物催化剂,但其数量较少。采用基因挖掘在基因组数据库中获得一种来自运动替斯崔纳菌Tistrella mobilis KA081020-065的新型卤醇脱卤酶基因Hhe TM,将该基因克隆、表达在大肠杆菌BL21(DE3)中,利用镍柱亲和层析将该酶进行纯化并研究了其酶学性质。Hhe TM是一种同源四聚体;最适温度为50℃;不同的p H缓冲液对其活性有较大影响;在碱性、30℃以下的条件下稳定性高。在氰根离子存在的条件下,Hhe TM能够催化(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯合成(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯,为酶法合成阿托伐他汀关键中间体提供了一种新的卤醇脱卤酶。     

转化奎宁酮为(R)-3-奎宁醇菌株的筛选及转化条件优化

(R)-3-奎宁醇是一种用于合成各类药物的重要手性砌块,以奎宁酮盐酸盐为唯一碳源,筛选得到一株能够将奎宁酮不对称还原为(R)-3-奎宁醇的菌株X15。常规生理生化鉴定和18S rDNA序列分析表明,菌株X15属于粘红酵母菌Rhodotorula mucilaginosa,定名为R.mucilaginosa X15。结果显示,菌株X15具有酮基还原能力和辅酶再生能力,在100 mL反应体系中可将奎宁酮还原为(R)-3-奎宁醇,转化率90%,ee值为88%。     

酵母还原乙酰乙酸乙酯制备(S)-3-羟基丁酸乙酯的研究*

研究了五种酵母催化乙酰乙酸乙酯生成(S)-3-羟基丁酸乙酯的能力,筛选出催化性能较好的菌株酿酒酵母,并以该酵母为出发菌株进行紫外诱变筛选出催化性能更优良的菌株LY7;另外还对菌株LY7催化乙酰乙酸乙酯生成(S)-3-羟基丁酸乙酯的反应特性进行了研究。研究表明:采用200g/L蔗糖作为碳源,初始乙酰乙酸乙酯浓度为0.25mol/L,初始细胞浓度为150g/L,反应温度为36℃时所得产物得率和对映体过剩值最高。     

酵母还原乙酰乙酸乙酯制备(S)-3-羟基丁酸乙酯的研究

研究了五种酵母催化乙酰乙酸乙酯生成(S)-3-羟基丁酸乙酯的能力,筛选出催化性能较好的菌株酿酒酵母,并以该酵母为出发菌株进行紫外诱变筛选出催化性能更优良的菌株LY7;另外还对菌株LY7催化乙酰乙酸乙酯生成(S)-3-羟基丁酸乙酯的反应特性进行了研究。研究表明:采用200g/L蔗糖作为碳源,初始乙酰乙酸乙酯浓度为0.25mol/L,初始细胞浓度为150g/L,反应温度为36℃时所得产物得率和对映体过剩值最高。     

面包酵母催化不对称合成4-氯-(R)-3-羟基丁酸乙酯

以4 氯乙酰乙酸乙酯为原料,以面包酵母为手性生物催化剂,选择性合成光学活性4 氯 (R) 3 羟基丁酸乙酯。经IR、GC MS、1HNMR和旋光度测定,表明所得产品的结构与预期的结构一致。分别考察了面包酵母用量、葡萄糖浓度、底物投入量、pH值、反应时间以及反应温度等因素对产品比旋光度的影响。结果表明,4 氯乙酰乙酸乙酯不对称生物还原反应的适宜条件为:面包酵母6 0 0g/L、葡萄糖2 0g/L、反应温度34℃、底物加量16mL/L、反应时间4 8h、pH为5 ,产品的比旋光度为[α]2 0D = 13 9°。     

聚羟基烷酸酯 (PHA) 改性研究进展

本文简述了生物制造聚羟基烷酸酯(PHA),包括聚3-羟基丁酸酯(PHB)、聚(3-羟基丁酸酯-3-羟基戊酸酯)(PHBV)、聚(3-羟基丁酸酯-4-羟基丁酸酯)(P3/4HB)、聚(3-羟基丁酸酯-3-羟基己酸酯)(PHBH)的产业化现状,综述了针对PHA材料热稳定性差、加工窗口较窄等缺点而进行的一些改性研究。选用适当方法对PHA进行改性,可使其性能得到优化,应用领域得到拓展。     

甘油原料转化生产手性环氧氯丙烷关键酶的开发

手性环氧氯丙烷是一种重要的三碳手性合成子,在医药、农药、化工、材料等领域有着广泛的应用。开发以甘油替代石油基原料合成手性环氧氯丙烷的绿色合成工艺具有重要的开发价值。生物催化技术可有效提高过程安全性与原子经济性,降低"三废"排放,提升产品质量。阐述了生物催化合成手性环氧氯丙烷关键酶技术的研究进展,进行了生物合成路线设计、卤化酶酶库构建、卤醇脱卤酶与环氧化物水解酶的筛选与改造、卤醇脱卤酶/环氧化物水解酶双酶串联合成手性环氧氯丙烷工艺构建等技术开发,为手性环氧氯丙烷绿色生物合成技术的研究与应用提供理论基础与技术支持。     

代谢工程技术调控3-羟基丁酸与3-羟基己酸共聚酯PHBHHx的微生物合成

3-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚酯(PHBHHx)是一种新型生物可降解材料,其性能与3-羟基己酸(3HHx)在共聚物中的摩尔百分含量密切相关。本研究在两株嗜水性气单孢菌Aeromonas hydrophila WQ和Aeromonas hydrophila 4AK4中分别引入了编码酯酰辅酶A脱氢酶的yafH基因和编码合成3-羟基丁酸-CoA的phbA和phbB基因,将A.hydrophila WQ合成的PHBHHx中的3HHx的摩尔含量由3％—5％提高到20％以上;而A.hydrophila 4AK4合成的PHBHHx中的3HHx摩尔含量则由15％左右降低到3％-12％。成功地实现了对PHBHHx单体组成的调控。     

酵母还原乙酰乙酸乙酯制备（S）-3-羟基丁酸乙酯的研究

研究了五种酵母催化乙酰乙酸乙酯生成(S)-3-羟基丁酸乙酯的能力,筛选出催化性能较好的菌株酿酒酵母,并以该酵母为出发菌株进行紫外诱变筛选出催化性能更优良的菌株 LY7;另外还对菌株 LY7 催化乙酰乙酸乙酯生成(S)-3-羟基丁酸乙酯的反应特性进行了研究。研究表明：采用 200g／L蔗糖作为碳源,初始乙酰乙酸乙酯浓度为 O.25mol/L,初始细胞浓度为 150g／L,反应温度为36℃时所得产物得率和对映体过剩值最高。     

费氏中华根瘤菌M6-3合成多聚羟基丁酸的发酵动力学研究

采用分批和连续培养的方法对中华根瘤菌M6 - 3合成多聚羟基丁酸的发酵动力学进行了研究 ,实验结果表明 ,该菌合成多聚羟基丁酸的发酵类型属于部分生长关联型。其细胞生长速率与限制性基质葡萄糖之间的关系符合Monod方程式。其合成PHB的速率公式为 :dpdt=0 0 76 2x - 0 2 192 dxdt,细胞的生长耗糖得率系数 (yG)为 1 4 1(g干细胞 g葡萄糖 ) ,细胞的维持耗糖系数 (m)为 0 0 34 (g葡萄糖 h·g细胞 ) ,产物得率耗糖系数 (yp)为 0 133(gP(3HB) g葡萄糖 ) ;并且通过实验与回归数理分析建立了一系列发酵动力学模型。     

毕赤酵母不对称合成阿托伐他汀中间体

阿托伐他汀可通过抑制HMG-CoA还原酶与底物的结合来抑制胆固醇的合成,而 (R)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚胺基戊酸乙酯是阿托伐他汀合成的重要中间体。通过对实验室保藏菌种进行筛选,得到一株巴氏毕赤酵母X-33可将5-邻苯二甲酰亚胺-3-氧代戊酸乙酯还原为 (R)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚胺基戊酸乙酯。在磷酸盐缓冲液体系中考察了初始底物浓度、反应时间、辅助底物、葡萄糖添加量、pH、温度等因素对产物收率和对映体选择性的影响,获得了较佳的反应条件。选择底物投料量为7 g/L时,当菌体浓度120 g/L,葡萄     

新颖深海微生物酯酶EstC11的酶学性质及其在手性拆分乙酸苏合香酯中的应用

【背景】手性乙酸苏合香酯是重要的手性香料产品,在食品及精细化工等领域都有重要的应用。酶催化不对称合成手性乙酸苏合香酯产品具有极好的工业应用前景。【目的】研究酯酶EstC11的基本酶学性质及其在制备手性乙酸苏合香酯中的应用。【方法】对来自西太平洋深海热液口芽孢杆菌Bacillus sp.CX01中的新颖微生物酯酶基因EstC11进行克隆、表达及酶学性质鉴定。通过对p H、温度、有机溶剂等反应条件的优化提高酯酶手性拆分乙酸苏合香酯的光学纯度。【结果】酯酶EstC11的最适反应p H为8.5,最适温度为25°C,一些金属离子和有机溶剂对酯酶EstC11的水解活性具有不同程度的抑制作用。通过对反应条件的优化,在最适反应条件下(p H 9.0 50 mmol/L Tris-HCl,20°C,50 mmol/L底物浓度)反应3 h后,(R)-乙酸苏合香酯的光学纯度达98%,得率为39%。【结论】通过对酯酶拆分条件的优化,手性拆分乙酸苏合香酯生成(R)-乙酸苏合香酯的光学纯度明显提高,为酯酶EstC11在工业化上的应用奠定了基础。     

微生物法还原氯代苯乙酮制备手性醇

手性醇是合成手性药物、农业化学品、香料和液晶等物质的重要中间体[1] 。 2 1世纪是手性药物发展迅速的时代 ,手性醇合成方法的成熟与改进对于手性药物的合成具有积极的促进作用。光学活性的苯乙醇及其衍生物可用于合成手性药物 ,如 :L 氯丙那林、R 沙丁胺醇[2 ] 、R 肾上腺素、S 心得安、S 舒喘宁、S 氟西汀和R 托莫西汀[3,4 ] 等。目前 ,生产手性醇的主要方法有化学法和生物法两种[5] 。利用微生物中酶的立体选择性能够合成一些化学方法难以合成的手性中间体[5] 。化学法中采用的反应体系一般为有机溶剂 ,而微生物法采用水相体系 ,微…