马肝醇脱氢酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

利用RT-PCR技术从马肝扩增HLADH-E和HLADH-S基因,通过基因工程方法构建表达质粒pLY115E和pLY115S,在大肠杆菌中表达,并利用Ni柱分离纯化。利用紫外检测辅酶NADH在340nm的吸光值,来考察表达产物转化环己醇的活性。试验结果证明马肝醇脱氢酶HLADH-E和HLADH-S基因均能在大肠杆菌中表达,并且可溶性表达产物都具有氧化环己醇的活性,为马肝醇脱氢酶的进一步研究开发奠定了基础。     

香蕉肉桂醇脱氢酶基因的克隆及表达分析

肉桂醇脱氢酶(CAD)在木质素合成过程中起关键作用。通过RACE(rapid-amplification of cDNA ends)方法从香蕉根系cDNA均一化全长文库中获得一个肉桂醇脱氢酶基因,命名为MaCAD1(GenBank登录号为KF582533)。MaCAD1是香蕉MYB基因编码框全长cDNA,包含一个1 077bp的最大开放阅读框(ORF),编码358个氨基酸。蛋白质序列同源比对发现,其含有完整的醇脱氧酶的典型保守结构域,属于典型的CAD蛋白。系统进化树比对分析表明,MaCAD1与水稻OsCAD6(CAD39907)的亲缘关系较近。组织特异性研究表明MaCAD1基因组成型表达于香蕉各个组织。在耐病和感病品种中,MaCAD1均上调表达,但在耐病品种中MaCAD1在所有时间点相对于对照增加的倍数均高于感病品种,表明MaCAD1基因在香蕉的抗病性中起着重要作用,MaCAD1可以作为一个新的响应枯萎病侵染的标记基因。     

水芹肉桂醇脱氢酶基因的克隆与表达特性分析

以‘八卦洲水芹’及其紫色叶柄突变型水芹‘南选八卦洲紫水芹’为实验材料,利用RT-PCR方法从‘南选八卦洲紫水芹’中克隆得到水芹肉桂醇脱氢酶(CAD)基因,命名为OjCAD。OjCAD基因开放阅读框长为1 074bp,编码357个氨基酸。OjCAD蛋白相对分子质量为39 143.10,理论等电点为6.91,属于MDR家族。系统进化分析显示,水芹OjCAD与同属伞形科的胡萝卜CAD进化关系最近,具有高度保守性。OjCAD编码的蛋白属于疏水蛋白,空间结构主要由7个α-螺旋和17个β-折叠组成。实时定量PCR分析显示,OjCAD基因在紫色和非紫色水芹的叶片和叶柄中相对表达量存在差异,水芹OjCAD基因在叶片中的表达量显著高于叶柄,在‘八卦洲水芹’中的表达量高于‘南选八卦洲紫水芹’。该研究结果为进一步分析水芹木质素生物合成奠定了基础。     

甜蛋白基因MBLⅡ对番茄的遗传转化

以5～7d龄的“丽春”番茄无菌苗子叶作为外植体,研究了子叶外植体对抗生素卡那霉素的敏感性,抗生素卡那霉素对番茄筛选的适宜浓度为70mg／L。通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导,成功地进行了马槟榔甜蛋白基因MBLⅡ对番茄的遗传转化,获得转化番茄抗性植株,组织化学法有阳性表现、PCR特异扩增及Southern杂交检测出现特异条带,表明MBLⅡ基因已顺利整合到转基因番茄植株的基因组。     

甜蛋白基因MBLII对番茄的遗传转化

以5～7d龄的 丽春 番茄无菌苗子叶作为外植体,研究了子叶外植体对抗生素卡那霉素的敏感性,抗生素卡那霉素对番茄筛选的适宜浓度为70mg/L.通过根癌农杆菌 Agrobacteriumtumefaciens 介导,成功地进行了马槟榔甜蛋白基因MBLII对番茄的遗传转化,获得转化番茄抗性植株,组织化学法有阳性表现、PCR特异扩增及Southern杂交检测出现特异条带,表明MBLII基因已顺利整合到转基因番茄植株的基因组.     

花青素调节基因VlmybA2对番茄遗传转化

以小型番茄 Micro-Tom 为材料,利用农杆菌介导法导入花青素调节基因VlmybA2。对抗性筛选出的再生植株进行 GUS 组织染色和 PCR 检测,证明外源基因已经整合到 Micro-Tom 中,转基因番茄根、茎、叶脉、果皮均呈紫色,花色为黄紫嵌合。而野生型的根为白色,茎、叶脉呈绿色,果皮为红色,花为黄色。对转基因番茄的花青素含量、叶片叶绿素含量和光合速率等生理指标进行测定,花青素含量有显著增加,叶绿素含量降低,VlmybA2基因过量表达会降低植株的光合效率,但对植株正常生长影响并不显著。VlmybA2 基因既可增加抗衰老物质花青素含量,又可作为转基因植株的报告基因。     

胸腺肽基因对樱桃番茄的遗传转化

胸腺肽基因是一343bp的小肽基因,是从动物中克隆得到的。本文以“美味樱桃”番茄为植物材料,用农杆菌侵染法进行了胸腺肽基因的遗传转化。对所得再生植株进行了PCR和Southern blot检测及RT-PCR检测,34棵Kam抗性株通过目的基因PCR检测,4棵为阳性株,阳性株率为11．8%。实验中还对目的基因之后的Nos终止序列区进行了扩增,通过Nos Ter．引物对4株目的基因PCR阳性株作PCR检测．只有1株为阳性株,该植株经Southern blot检测和RT-PCR检测,均为阳性。这些检测结果说明胸腺肽基因成功地整合到番茄基因组中,并在转录水平上得以表达。     

弱氧化醋杆菌阿拉伯糖醇脱氢酶基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

The partial genomic library of Acetobacter suboxydans was constructed using Yeast\| E.coli shuttle plasmid YEp352 as vector.Two positive transformants,designated as DH5α(pAD91) and DH5α(pAD98),were obtained by screening the growth of transformants on the agar plate in which D\|arabitol was used as the sole carbon source.The results of Southern blot and restriction endonuclease analysis showed that the two recombinants are identical.The insert is about 2.3kb.Arabitol dehydrogenase activity assay indic…     

茶树CsCOR1基因的原核表达

将来自茶树的冷诱导基因CsCORI与pGEX-6p-1质粒上的谷胱甘肤-S-转移酶(GST)融合,构建为融合表达载体,最终实现了在0.8 mmol/L IPTC诱导下的原核表达,获得了36 kD的可溶性融合蛋白,为对CsCOR1基因功能的进一步研究奠定基础.     

茶树遗传转化研究进展

茶(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze)是全球重要的非酒精饮料之一,随着遗传转化技术的不断发展以及人们对高抗性和高品质型品种的需求,通过遗传转化进行茶树定向改良越来越受到学者们的关注.本文在回顾和总结茶树各遗传转化方法的特点和研究现状的基础上,重点讨论和概述了当前茶树遗传转化技术存在的主要问题以...     

植物肉桂醇脱氢酶及其基因研究进展

肉桂醇脱氢酶(cinnamyl alcohol dehydrogenase,CAD)作为植物次生代谢特别是木质素合成的关键酶,与植物生长发育和抵御病原菌入侵关系密切,研究CAD基因表达调控及其与组织木质化的关系具有重要的植物生理学意义.该文综述了植物CAD的蛋白特征、酶学性质、基因分布和分类、基因结构和表达调控以及CAD表达与木质素合成的关系,为研究CAD在植物生长发育和抗病中的作用提供理论指导.     

茶树脂氢过氧化物裂解酶基因CsiHPL1的克隆及表达

根据茶树基因CsiHPL1的cDNA序列设计引物,采用RT-PCR方法从茶树品种龙井43′中克隆了CsiHPL1序列,并分析了CsiHPL1在生物和非生物胁迫下的诱导表达情况及亚细胞定位。结果表明,CsiHPL1包含一个1 476 bp的最大开放阅读框,编码491个氨基酸,预测为13-HPL基因。Real-Time PCR分析结果表明,CsiHPL1的表达受到茶尺蠖取食、机械损伤和茉莉酸的诱导;构建了CsiHPL1与绿色荧光蛋白（GFP）基因的重组表达载体,经农杆菌瞬时转化烟草叶片,利用激光共聚焦显微镜在叶绿体中观察到GFP荧光,表明CsiHPL1编码的蛋白质为叶绿体蛋白质。     

前列腺素脱氢酶在大肠杆菌中的表达纯化及鉴定

15-羟基前列腺素脱氢酶（PGDH）属于抑癌基因,在多种肿瘤中表达缺失,在肿瘤的发生发展中起着重要作用。提取人正常大肠黏膜组织总RNA,利用RT-PCR方法扩增得到PGDH基因的编码序列,克隆入原核表达载体pBV220,测序鉴定正确后转化E.coli DH5α,经温控诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE和Western blot,证实为相对分子质量约为29000的PGDH-His6蛋白,表达产物以包涵体形式存在,3h诱导表达量最高,约占菌体总蛋白的30%。经Ni2+配体亲和层析纯化得到纯度大于95%的目的蛋白。重组PGDH简单复性后具有一定的生物活性,约为3.7×104U/mg,为下一步研究其在肿瘤中的作用奠定了基础。     

Comparison of the Gene Expression Patterns of Alcohol Dehydrogenase Isozymes in the Thermotolerant Yeast Kluyveromyces marxianus and Their Physiological Functions

Four genes encoding alcohol dehydrogenase (Adh) isozymes in the thermotolerant yeast Kluyveromyces marxianus, a potent candidate for ethanol production at high temperatures, were investigated. Of these, KmADH3 and KmADH4 were cloned and sequenced, and their deduced amino acid sequences were compared with those of KmAdh1 and KmAdh2 and other Adhs of Kluyveromyces lactis and Saccharomyces cerevisiae. The four KmAdhs had high sequence similarity, though KmAdh3 and KmAdh4 possessed an amino-terminal extension as a mitochondrial targeting sequence, and appear to belong to the zinc-containing Adh family. These results and the results of Southern blot experiments suggest that there are at least four Adh isozymes in K. marxianus, two cytoplasmic enzymes and two mitochondrial enzymes. The expression profile revealed that KmADH genes are differently expressed depending on growth phase and carbon source, suggesting that these highly homologous Adhs play distinctive roles in cells.     

丹参肉桂醇脱氢酶基因（SmCAD）的克隆及表达分析

肉桂醇脱氢酶（cinnamyl alcohol dehydrogenase,CAD）依赖于NADPH还原肉桂醛及其衍生物,是催化木质素单体生物合成途径的最后一步关键酶。通过分析丹参转录组数据库,从丹参中获得一条肉桂醇脱氢酶基因,命名为SmCAD（Genebank注册号：HQ162287）。该序列包含一个长为1083 bp的开放阅读框,有3个内含子和4个外显子,编码360个氨基酸,含有NADP（H）结合域,Zn1和Zn2锌结合位点。利用BD walking的方法获得其启动子序列1202 bp,序列分析结果表明,SmCAD启动子区包含茉莉酸甲酯（MeJA）、脱落酸（ABA）、赤霉素（GA3）响应元件以及MYB结合位点。利用实时荧光定量PCR分析表明,该基因在丹参根、茎、叶中均有表达,且其表达受到MeJA的诱导和GA3的抑制,推测该基因可能参与了丹参对外源信号的应答反应。研究结果可为进一步研究SmCAD基因在丹参中的具体功能提供理论依据。     

油茶脂酰辅酶A脱氢酶基因的克隆与表达分析

以国审油茶(Camellia oleifera)良种‘华硕’种子为材料,在已构建的转录组和表达谱数据库基础之上,采用RACE技术,克隆获得油茶脂酰辅酶A脱氢酶基因的全长c DNA序列,命名为Co ACAD(基因登录号KJ910338)。该基因c DNA全长为2702 bp,含有2487 bp的开放读码框,编码828个氨基酸,分子量为92.4113 k D,理论等电点p I为8.47,具有2个比较明显的跨膜区和酪氨酸蛋白激酶活性位点LVHGDFRIDNLVF,存在5个亚结构域;在Co ACAD基因c DNA全长序列的基础上构建表达载体,其中原核表达载体在宿主细胞BL21(DE3)中成功诱导表达,获得表观分子量约为93 k D的目的蛋白;实时荧光定量PCR分析表明,Co ACAD基因在果实膨大期和成熟期上调表达,预示着Co ACAD基因可能在种子发育过程中参与能量供应过程的调控。     

香蕉中4条乙醇脱氢酶基因的克隆及表达分析

该研究采用RACE技术从香蕉中克隆了4条乙醇脱氢酶基因——MaADH1(GenBank No.KM253748)、MaADH2(GenBank No.KM253749)、MaADH3(GenBank No.KM253750)、MaADH4(GenBank No.KM253753),且在核苷酸水平上4条基因与2A基因组中的乙醇脱氢酶同源性较高;遗传进化树分析显示,MaADH2、MaADH3和MaADH4属于乙醇脱氢酶第I类,而MaADH1不属于第I类,也不属于第Ⅲ类。半定量RT-PCR分析显示,4条基因在不同器官中的表达量不同;不同激素、不同非生物胁迫以及生物胁迫处理后4条基因的表达显示,MaADH2受ABA、乙烯、茉莉酸、水杨酸、干旱和涝害诱导表达,最大表达量分别为 19.14、 428.19、 68.21、 61.79、53.73和108.43;MaADH3受盐胁迫诱导表达,最大表达量为220.27;MaADH1和MaADH4在不同处理后的表达量变化不明显。研究表明,在香蕉中MaADH2可以作为ABA、乙烯、茉莉酸、水杨酸、干旱和涝害的标记基因,MaADH3可以作为盐害的标记基因。     

重组酵母菌乙醇脱氢酶基因的克隆及序列分析

目的:克隆产麻黄碱重组酵母菌乙醇脱氢酶基因片段,并对其进行序列分析,为研究该基因在重组酵母中与麻黄碱生物合成途径的关系提供参考.方法:根据一段利用抑制差减杂交技术获得的来源于重组酵母乙醇脱氢酶基因片段,采用RACE的方法扩增Adh基因,使用分子生物学软件对该基因进行生物信息学分析.结果:获得一段大小为1 245 bp的基因片段,编码375个氨基酸,含有两个催化域和两个锌结合域,与来源于Gandida boidinii ADH3基因的同源性为85％.结论:克隆的基因为乙醇脱氢酶基因,并在GenBank注册,登录号为JF293468.     

番茄交替氧化酶基因的克隆和表达

利用简并PCR扩增产物做探针筛选番茄cDNA基因文库获得一个全长交替氧化酶cDNA基因LeAoxlau.经序列分析得出,该基因全长1 418bp,编码区序列长1 077 bp,编码约40 kD的前体蛋白.该蛋白在转运到线粒体时被加工成32kD的成熟蛋白.Southern印迹杂交分析结果显示该基因以单拷贝形式存在于番茄的基因组中RT-PCR显示,该基因在在番茄植株的根、茎、叶和子叶中表达.重组表达实验表明该基因能在大肠杆菌中表达.