人胰岛素原在甲醇酵母（Pichia pastoris）中的高效表达

甲醇营养型酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ在近十几年已被人们广泛用作外源基因表达的系统。表达的是可溶性蛋白,且胞外分泌。本研究系将外源基因（胰岛素原基因）连接到穿梭质粒ＰＨＩＬ－Ｓ１上,再通过同源重组到酵母染色体,筛选表达株。用１升发酵罐在甲醇诱导下可获得０．３ｇ／Ｌ胰岛素原的产率。     

人胰岛素在甲醇酵母Pichia pastoris中的分泌表达

将猪胰岛素前体基因和在其５’端引入９个氨基酸的间隔肽序列的ＰＩＰ基因插入到Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ的分泌表达质粒ｐＰＩＣ９中,得到分泌表达质粒ｐｐＩＣ９／ＰＩＰ和ｐＰＣ９／ｓｐ－ＰＩＰ７并用以转化ｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＳ１１５。用点杂交筛选,获得高拷贝转化Ｐ３９（－ｓｐ）和Ｓ５１（＋ｓｐ）。     

甲醇营养型酵母表达系统的研究进展

甲醇营养型酵母越来越被人们用作外源基因的表达系统。本文综述其在表达质粒构建,表达株的筛选,表达产物的糖链加工以及它分拣外源蛋白进入过氧化物酶体等的特点,不仅具有广泛的商业用途,而且在理论研究特别是膜蛋白结构与功能方面也有潜在应用价值。     

甲醇营养型酵母表达系统的研究进展

甲醇营养型酵母越来越被人们用作外源基因的表达系统。本文综述其在表达质粒构建,表达株的筛选,表达产物的糖链加工以及它分拣外源蛋白进入过氧化物酶体等的特点,不仅具有广泛的商业用途,而且在理论研究特别是膜蛋白结构与功能方面也有潜在应用价值。     

甲醇酵母表达系统

甲醇酵母基因表达系统是一种最近发展迅速的外源蛋白质生产系统。甲醇酵母是可利用甲醇作为唯一碳源的酵母 ,主要有Ｈ .Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、ＣａｎｄｉｄａＢｏｄｉｎｉｉ、ＰｉｃｈｉａＰａｓ ｔｏｒｉｓ三种 ,其中ＰｉｃｈｉａＰａｓｔｏｒｉｓ作为基因表达系统使用得最多、最广泛[1] 。与以往的基因表达系统相比 ,它具有无可匹敌的高表达特性 ,已被认为是最具有发展前景的生产蛋白质的工具之一。1 .外源蛋白质的基因在甲醇酵母中的高效表达目前已有多种蛋白质的基因在该表达系统中克隆成功 ,包括蛋白酶、酶抑制剂、受体、单链抗体等 (…     

人胰岛素样生长因子Ⅱ在甲醇营养型酵母P.pastoris中的表达、分泌和性质研究

为获得ＩＧＦ－Ⅱ的高效表达,构建了其多拷贝、分泌型表达载体：含有５个串联的ＩＧＦ－Ⅱ表达单元;由受甲醇诱导的醇氧化酶启动子控制表达;利用啤酒酵母α因子的前导肽引导分泌．线形化表达载体转化Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ蛋白酶缺陷型菌株后,筛选到有ＩＧＦ－Ⅱ表达和分泌的阳性转化子;进一步优化表达、培养条件后,ＩＧＦ－Ⅱ在高密度发酵上清中的产量可达６０ ｍ ｇ／Ｌ．对Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ产生的ｒｈＩＧＦ－Ⅱ的性质分析表明,其具有正确的分子量,Ｎ 端和较好的生物活性．     

在甲醇酵母Pichia pastoris胞内表达有活性的辣根过氧化物酶

为了开辟在甲醇酵母 Pichia pastoris中表达 HRP的新途径 ,将编码成熟 HRP同功酶 C基因克隆到表达载体 p PIK3.5K中 .p PIK3.5KHRP转化 GS1 1 5后 ,用 PCR筛选阳性 P.pastoris重组株 ,并用甲醇进行诱导 . Western印迹杂交分析表明目标蛋白 (约为 38k D)能被天然 HRP的多克隆抗体所识别 ,因此活性辣根过氧化物酶已在 P.pastoris胞内表达 .筛选菌株中显示了明显的过氧化物酶活性 ,同时诱导过程中血红素和 Ca Cl2 的加入对过氧化物酶的活力影响不大     

HPV16(新疆株)E6在Pichia pastoris酵母中的分泌表达

目的：利用酵母Pichia pastoris真核蛋白表达在系统,表达HPV16（新疆株）E6（HPV16 XJ E6）蛋白。方法：根据HPV16 XJ E6基因序列设计引物,并分别在5′引物和3′引物中引入了EcorRI和XbaI酶切位点,经PCR扩增后与pMD18-T载体相连,再将HPV16 XJ E6从载体上切下并克隆至穿棱质粒pGAPZαA上,获得的重组穿棱质粒pGAPZαA-E6经线性化后,采用LiCl法将重组穿棱质粒转入酵母细胞内,Zeocin^ 筛选鉴定,经小瓶发酵后,取上清作SDSPAGE检测,结果：HPV16 XJ E6成功地在酵母真核表达系统获得表达,表达产物的分子量为20kD,为深入研究HPV16 XJ E6蛋白功能奠定了理论基础。     

毕赤酵母外源基因表达系统研究进展

巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris外源基因表达系统已经成功表达了很多胞间型和胞内型蛋白质。与酿酒酵母Saccharomyces ceresiviae相比,该系统所具有的很多优势使其应用越来越广泛。有关研究主要涉及以下几个方面：宿主菌株,表达载体,转化方法,外源基因整合,外源蛋白糖基化和高密度发酵培养等。     

人可溶性gp190在酵母Pichia pastoris中的表达

人可溶性gPl90(sgp190)是白血病抑制因子(LIF)的可溶性受体,可能在LIF行使众多生物学功能中扮演着重要的角色。为获得这一蛋白以研究它在人体内的生物学活性,在酵母Pichia pastoris中实现了重组sgp190分泌表达。利用基因重组技术,将编码人可溶性gP190(LlF受体α亚基gP190胞外区)cDNA克隆到毕赤酵母Pichia pastoris分泌表达载体pPIC9K,构建了重组表达质粒pPIC9K-sgp190。原生质体法转染Pichia pastoris GS115菌株,经过G418筛选,得到了高效分泌表达sgp190蛋白的毕赤酵母菌株GS115／pPIC9K-sgp190,sgp190蛋白占摇瓶培养表达上清中总蛋白质的26％。经初步纯化,对表达产物的性质鉴定表明,其分子量约125kD,具有免疫活性。对sgp190体外活性分析表明它能够抑制LIF诱导滋养层细胞分泌hCG。     

柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶3基因在毕赤酵母中的表达及分析

旨在真核表达系统中高效表达柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶3(Eimeria tenella calcium-dependent protein kinase-3,EtCDPK3),获得有活性的天然蛋白,利用毕赤酵母表达系统对该基因进行了表达.将EtCDPK3基因连接到毕赤酵母表达载体pPIC9K上,构建重组质粒pPIC9K-EtCDPK3.重组质粒通过电击转化入酵母细胞GS115后,用组氨酸缺陷培养基和G418分别进行筛选,获得含重组质粒的酵母表达细胞.重组酵母细胞在含1％甲醇的BMMY培养基中诱导产生目的蛋白,培养收集1-4d的部分上清.经SDS-PAGE检测,所表达的蛋白相对分子质量约为49 kD.Western blotting表明,该蛋白能与兔抗EtCDPK3血清特异性结合.结果表明,柔嫩艾美耳球虫CDPK3基因在毕赤酵母中成功地进行了表达.     

提高外源基因在巴斯德毕赤酵母中表达量的研究进展

巴斯德毕赤酵母 (Pichiapastoris)表达系统是基因工程研究中广泛使用的真核表达系统 ,与现有的其它表达系统相比 ,巴斯德毕赤酵母在表达产物的糖基化修饰、折叠、加工、外分泌及表达量等方面有明显的优势。外源基因在该系统中表达时 ,由于受基因内部的结构、分泌信号、甲醇诱导的浓度及诱导时间、培养温度、启动子、表达环境的 pH值等诸多因素的影响 ,一些外源蛋白的表达也存在着表达不够稳定、表达量较低 ,甚至不表达的情况。对影响巴斯德毕赤酵母表达的各种可能因素进行了分析 ,结合具体实践经验 ,就如何提高外源基因在巴斯德毕赤酵母中表达量的问题进行了综述。     

甲醇酵母基因表达系统的研究进展

在大肠杆菌这一传统表达系统被频繁用作研究各种基因表达时,一种新型且有效的基因表达系统--甲醇酵母正逐渐引起人们的注意。此系统不仅具有高表达、高稳定、高分泌的特点,而且其宿主甲醇酵母--巴斯德毕赤酵母（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）具有高密度生长的特性。因此近年来此表达系统的研究得到迅速发展,在其中表达了多种具有商业价值的外源蛋白。本文对甲醇酵母基因表达系统的特点及研究进展作一简要综述。     

在毕赤酵母中表达的重组人血管内皮生长因子(rhVEGF121)为氨基端4个氨基酸缺失的异构体

为获得重组人血管内皮生长因子 ,采用重叠PCR扩增出含Kozak顺序、α因子前导肽和hVEGF12 1的融合基因 ,经DNA测序无误后 ,插入Pichiapastoris酵母载体 ,并体外构建 4拷贝表达单元质粒pAO81 5 4KαVEGF12 1。表达载体转化酵母宿主菌GS1 1 5 ,筛选出高效表达hVEGF的转化子。摇瓶培养并 1 %甲醇诱导 80h的VEGF分泌性表达量可达 30mg L。表达产物经S Sepharose离子交换层析纯化后测活表明表达产物二聚体具有良好生物活性。SDS PAGE分析、Western印迹表明表达产物具有适宜的分子量和抗原性。VEGF蛋白经氨基端氨基酸测序证实纯化后的不同糖化程度产物为同一蛋白质 ,但均为氨基端缺失了 4个氨基酸的全长为 1 1 7个氨基酸的VEGF。     

Expression,purification and biophysical characterization of recombinant Streptomyces violaceoruber phospholipase PLA2 overproduced in Pichia pastoris

Abstract

Aim: The main purpose of this work was to develop new protocols for high yield purification of secretory phospholipase A2 (PLA2) and to investigate its biophysical properties.

Materials and methods: We have used a Pichia pastoris expression system for PLA2 expression and two-stage chromatography for its purification. The biophysical properties of PLA2 were investigated by circular dichroism.

Results: A scalable method for high yield purification of recombinant Streptomyces violaceruber PLA2 was developed. The PLA2 from S. violaceruber was expressed in the methylotrophic yeast P. pastoris. Functional active phospholipase A2 with specific activity 73?U/mg was purified with a concentration of at least 3?mg/mL. The role of different divalent ions in PLA2 thermostability were evaluated. Ca²⁺ and Ba²⁺ ions significantly increased thermostability of the enzyme.     

重组人白细胞介素11在毕氏酵母中的表达

将人白细胞介素11基因选用酵母偏爱密码子人工合成全基因,克隆到酵母分泌型表达载体pGENYk中,酶切线性化后原生质体转化导入酵母细胞进行整合,G418筛选得到多拷贝转化子,甲醇诱导表达,纯化制备产物,经过SDS－PAGE、Western印迹及体内外生物学活性等分析表明,产物活性与E.coli融合表达的Neumega一致。     

人Mn-SOD cDNA的克隆及其在巴斯德毕赤酵母中的表达

以人肝细胞株(L02)总RNA为模板,用RT-PCR扩增出人锰超氧化物歧化酶(hMn-SOD)cDNA,将其插入含有AOX1基因启动子和α分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体pPIC9k,构建重组质粒pPIC9k-MnSOD,转化毕赤酵母GS115,筛选出整合了多拷贝hMn-SOD基因的Mut^ 表型菌株,摇瓶培养,0．5％甲醇诱导表达。SDS-PAGE分析显示,诱导4d的培养上清中hMn-SOD的表达量约为上清总蛋白的32％,酶比活可达247、7u／mg。hMn-SOD在巴斯德毕赤酵母中实现了分泌性表达。     

人基质金属蛋白酶-2的表达、纯化和性质鉴定

PCR方法扩增人基质金属蛋白酶 2 (MMP 2 )不含信号肽的表达序列 ,酶切和测序鉴定正确后 ,构建酵母重组表达质粒pPIC9 MMP 2 ,电击法转化毕赤酵母 (Pichiapastoris)细胞得到阳性克隆 ,甲醇诱导获得含大量基质金属蛋白酶 2的培养上清 ,经SephacrylS 2 0 0纯化后 ,纯度达到电泳纯。明胶酶谱和SDS PAGE分析说明重组MMP 2能够降解明胶和IV型胶原 ,表明重组蛋白具有与天然MMP 2相似的底物特异性。糖基化分析和SDS PAGE表明 ,表达产物的分子量约为 5 0kD ,重组MMP 2的C 末段可能发生了降解。     

自身抗原组氨酰转移核糖核酸合成酶基因在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达研究

目的:通过基因克隆在巴斯德毕赤酵母中表达人自身抗原组氨酰转移核糖核酸合成酶(HRS或Jo-1)。方法:PCR扩增Jo-1基因,与酵母表达载体pPIC9k重组,构建表达质粒pPIC9k-Jo-1。用电穿孔法转化酵母菌SMD1168,在MD平板上筛选重组克隆,用G418快速筛选高拷贝转化子,阳性克隆经甲醇诱导表达后,培养上清用SDS-PAGE和免疫酶斑点法鉴定。结果:PCR产物长约1500bp,与预期1526bp接近;pPIC9k-Jo-1重组阳性克隆测序结果与GenBank核酸数据库的报道完全一致,双酶切鉴定正确,表达产物Jo-1的相对分子质量约55000,免疫酶斑点法证实表达产物具有天然Jo-1分子的免疫原性,阴性对照菌未见目的表达条带。结论:Jo-1在巴斯德毕赤酵母中分泌表达成功,为后续研究打下了基础。