Tn5转座突变技术在革兰氏阴性细菌分子遗传研究中的应用

随着广宿主载体系统的发展,Tn5及其衍生载体已经广泛应用于革兰氏阴性细菌的分子遗传学研究。主要综述了Tn5转座突变技术在生防细菌生防机理研究、细菌必需基因的鉴定、病原细菌毒力相关基因研究、代谢调控基因研究和菌株的遗传改良方面的应用研究进展。     

细菌必需基因、最小基因组和合成细胞

单细胞原核生物是原始的细胞生命形式,确定细菌必需基因和最小基因组对理解生命的本质、细胞生命的起源和进化有非常重要的意义。文中简要介绍近年来有关细菌的必需基因、最小基因组和合成细胞的研究方法、理论和进展。还特别介绍人工建立最小细菌基因组的策略以及应用前景。     

铜绿假单胞菌随机启动子库的构建及受铁调控基因的筛选和鉴定

[目的]针对铁这种几乎所有微生物都必需的,对病原菌尤为重要的营养元素,在全基因组水平上检测铜绿假单胞菌的铁感应基因.[方法]采用含LuxCDABE报道子的质粒pMS402为载体,构建了铜绿假单胞菌的随机启动子库,建立了特定条件下研究铜绿假单胞菌全基因组基因表达变化的高通量平台.[结果]验证了2个已知的受铁调控的基因,并发现了尚未报道的二氢叶酸还原酶,磷酸葡萄糖脱水酶和柠檬酸铁转运蛋白受铁调控的现象,发现与铁相关的四个功能未知的基因和3个假定蛋白的基因.[结论]研究结果对于阐明铁在铜绿假单胞菌中的调控作用,揭示铁对细菌生理及致病性的作用机制提供了理论基础.随机启动子库的构建也为细菌基因组水平研究基因表达提供了一个有用的工具.     

干扰素(IFN)研究的两个主要发现

人干扰素有三大类:HuLeIFN、HuF IFN和HuI IFN。IFN基因在细菌中已实现克隆,并表现其生物活性。在研究细菌IFN的过程中有两个主要的发现:-- 一、发现人细胞中含有几个编码的LeIFN的基因,这个多基因的发现,先是C.Weissmann及其同事(苏黎世大学)发现的,尔后Goeddel D.和Stebbing N.及其同事(基因工程公司和Roche分子生物研究所)也得到类似结果。LeIFN基因最低限度有5个位点或10个位点,他们发现个体基因的核苷酸序列彼此约有15％的不同。然而不是所有的显性基因都能表达,基因工程公司研究工作者测定了其中8个核苷酸序列,发现一个含有终止信号,它阻止指令完全IFN蛋白的合成; 二、在LeIFN基因序列分析研究中发现LeIFN基因缺少间隙子(intron),其DNA片段定位于大多数真核基因,不编码蛋白质结构,迄今只有缺少IFN的其他真核生物基因中找到编码组蛋白,涉及基因表达的控制。 研究者在没有间隙子情况下较易建造生命,他是通过把人基因放入细菌细胞中而建造的细菌“IFN因子”,这就不必担忧细菌是否有产生蛋白质的机构(这种蛋白质是间隙子编码的,而间隙子在细菌细胞中又没有找到),事实上,基因工程公司和苏黎世研究者发现,LeIFN基因如系在细菌合适序列上,则细菌可制造LeIFN,为此,携带人IFN基因的细菌可产生IFN达200-250毫克/升菌液,据Weissmann的意见,基因工程方法产     

Tup1突变对转录抑制局部网络中基因表达的非线性影响

研究基因网络的非线性行为特征是研制基因网络技术的基础。Tup1基因是酵母中作用最为广泛的转录抑制因子之一,利用酵母生物信息学数据库中蛋白相互作用关系,构建一个以Tup1为中心,4个层次741个基因的局部基因网络。统计分析六张Tup1不同突变的基因表达芯片数据,将局部基因网络中的全部基因按照3个网络特征进行统计分析：必需、非必需基因、网络层次和网络节点,并研究这些特征与基因表达之间的关系。初步发现基因表达变化的强度与节点数目成一定的反比关系,必需基因的平均变化程度较非必需基因为低,且由Tup1突变引发的其他基因的表达变化在以Tup1为中心的局部基因网络中近层次网络变化程度较大,远层次网络变化程度较低。     

干扰素(IFN)研究的两个主要发现

人干扰素有三大类:HuLeIFN、HuF IFN和HuI IFN。IFN基因在细菌中已实现克隆,并表现其生物活性。在研究细菌IFN的过程中有两个主要的发现:—— 一、发现人细胞中含有几个编码的LeIFN的基因,这个多基因的发现,先是C.Weissmann及其同事(苏黎世大学)发现的,尔后Goeddel D.和Stebbing N.及其同事(基因工程公司和Roche分子生物研究所)也得到类似结果。LeIFN基因最低限度有5个位点或10个位点,他们发现个体基因的核苷酸序列彼此约有15％的不同。然而不是所有的显性基因都能表达,基因工程公司研究工作者测定了其中8个核苷酸序列,发现一个含有终止信号,它阻止指令完全IFN蛋白的合成; 二、在LeIFN基因序列分析研究中发现LeIFN基因缺少间隙子(intron),其DNA片段定位于大多数真核基因,不编码蛋白质结构,迄今只有缺少IFN的其他真核生物基因中找到编码组蛋白,涉及基因表达的控制。 研究者在没有间隙子情况下较易建造生命,他是通过把人基因放入细菌细胞中而建造的细菌“IFN因子”,这就不必担忧细菌是否有产生蛋白质的机构(这种蛋白质是间隙子编码的,而间隙子在细菌细胞中又没有找到),事实上,基因工程公司和苏黎世研究者发现,LeIFN基因如系在细菌合适序列上,则细菌可制造LeIFN,为此,携带人IFN基因的细菌可产生IFN达200—250毫克/升菌液,据Weissmann的意见,基因工程方法产     

铜绿假单胞菌必需基因的研究进展

铜绿假单胞菌为专性需氧非发酵革兰氏阴性杆菌,是医院感染的常见条件致病菌之一,可引起呼吸道、泌尿道、烧伤创面和菌血症等严重感染。铜绿假单胞菌耐药形势日益严峻,给临床治疗带来困难。必需基因是生长过程中必不可少的看家基因,对铜绿假单胞菌必需基因进行深入研究,不仅有助于了解细菌的生长、毒力等基本特性,也有助于筛选新的抗菌药物靶标。本文针对铜绿假单胞菌及其必需基因进行综述,首先介绍了铜绿假单胞菌的基本生理特性及目前耐药趋势,又归纳了必需基因的研究方法,最后对铜绿假单胞菌必需基因的研究进展进行总结。     

细菌启动子识别及应用研究进展

细菌启动子是细菌中基因表达的必需调控元件,决定了细菌基因表达的强度和时机。通过启动子的插入或缺失,可以改变细菌基因的表达,实现对菌体生长发育以及代谢调控的研究。启动子也是构建各种表达系统、实现异源基因表达的基础。启动子的识别和应用研究,对于实现异源基因的可控表达、有效获得目的产物、促进生物催化和代谢工程研究具有重要的意义。以下对细菌启动子进行了简单的介绍,总结了细菌启动子的识别方法,并对细菌启动子的研究进展和具体应用进行了概述。     

利用CRISPR/Cas9核酸酶靶向细菌必需基因的特异性抗菌剂研究（英文）

CRISPR/Cas9核酸酶是一种高效和精确的基因组DNA编辑工具。目前,CRISPR/Cas9被开发成一种新型抗菌剂,通过靶向破坏目标基因,例如抗生素耐药基因来诱导细菌死亡。本研究利用CRISPR携带多靶点优势,同时靶向大肠杆菌必需基因gyrA、gyrB和folA,以达到杀菌作用。本设计针对3个内源基因的CRISPR系列载体,分别含有1个、2个或3个靶点。当IPTG诱导Cas9表达后,CRISPR RNA (crRNA)和反式作用CRISPR RNA (trans-activating CRISPR RNA, tracrRNA)复合物募集Cas9切割靶基因,导致细菌死亡。随着crRNA中靶点数量的增加,杀菌效率显著提高。当含有3个靶点的crRNA作用于细菌基因组时,杀菌效率达到99.35%。此外,在存活的大肠杆菌中,crRNA表达质粒的靶序列和直接重复序列发现碱基缺失,而内源靶基因和Cas9基因均未发生突变。最后,该CRISPR系统还应用于其他大肠杆菌实验室菌株和产肠毒素K88菌株,并表现出高效的杀菌作用。我们设计了一种基于CRISPR/Cas9核酸酶的新型抗菌剂,为抗菌剂的研发提供新策略。     

微生物必需基因的理论研究现状

必需基因是生物体在优化条件下生长不可缺少的基因。近年来,对必需基因的研究已逐渐成为微生物学、基因组学和生物信息学研究领域的热点。文章首先描述了已经实验确定必需基因的微生物物种。然后,对必需基因的理论研究现状进行了综述。从进化保守性和序列组成两方面比较必需基因和非必需基因的差异,到必需基因的理论预测及必需基因在染色体上的分布等。最后,对这一重要研究领域的进展进行了总结和展望。     

鸭疫里默氏杆菌自然转化的发现及机制研究进展

自然转化(natural transformation)是微生物水平基因转移的一种重要机制,其在遗传多样性的产生或修复DNA损伤等方面发挥着重要作用,并且与耐药基因、毒力因子的扩散息息相关。鸭疫里默氏杆菌(Riemerellaanatipestifer,RA)是威克斯菌科中第一个被发现可以发生自然转化的细菌,本文作者利用此特点建立了多种基因编辑的方法,促进了对其遗传多样性和致病机理的研究进程。通过系统性地研究影响鸭疫里默氏杆菌自然转化的因素,鉴定出了参与该菌自然转化的营养物质;通过筛选转座子插入突变体文库,鉴定出了参与该过程的必需基因;最终,在该菌发现了一种新型的自然转化系统。本文结合其他细菌自然转化研究进展,针对以上研究结果进行综述,以期对该菌的自然转化机制有更深入的理解,也为更进一步探明该菌的耐药和毒力基因获得机制提供参考。     

人Era不同结构域在酵母双杂交系统中的表达及对报告基因激活作用的检测

ｅｒａ基因是 1986年在测定大肠杆菌基因组序列时发现的一个开放读框 .由于其编码的氨基酸序列与人及酵母的ＲＡＳ蛋白有部分相似之处 ,命名为Ｅ .ｃｏｌｉＲＡＳ ｌｉｋｅ(ｅｒａ)基因[1] .ｅｒａ基因广泛存在于原核生物中 ,与细胞周期和细胞分裂有关 ,是细菌生存繁殖所必需的重要基因[2 ] .在真核生物如蠕虫、小鼠和人的组织中都发现有与细菌ｅｒａ高度同源基因存在[3 ,4 ] .人ｅｒａ基因 (ｈｅｒａ)的全长ｃＤＮＡ于 1998年被克隆 ,与原核ｅｒａ基因具有很高的同源性[5] .人Ｅｒａ蛋白与大肠杆菌Ｅｒａ蛋白的氨基酸序列有 30 %相同 ,两者…     

英国科学家已着手用基因工程手段来改造酶

迄今为止,大多数生物工程学者只是在增加蛋白质的数量方面下功夫,例如,通过基因工程在细菌中生产胰岛素和干扰素。而今已有人在着手于提高蛋白质产量的同时,还注意改造酶的结构。英国一研究小组最近极其成功地通过基因工程的方法,将一种酶的催化活力提高了25倍。 他们所用的材料是酪氨酰tRNA合成酶,是细菌细胞中蛋白质合成所必需的许多种     

耐药基因可从海洋细菌进入人体内细菌

？新华网东京9月17日电：日本研究人员发现，耐药基因可从自然界的海洋细菌转移至人体内的大肠菌或肠球菌。     

基因转移因子———一类在海洋中广泛存在的介导水平基因转移的新型生物因子

基因转移因子(Gene Transfer Agent,GTA)是一种由细菌释放的、形态和有尾病毒类似的生物颗粒。GTA颗粒携带的遗传物质是宿主基因组的随机小片段而不包含编码GTA自身的基因或病毒基因组。根据4个模式菌株释放的GTA的研究,GTA具有高效的,种间介导基因水平转移的功能。近年来大规模细菌基因组测序,发现编码GTA的基因簇广泛存在于海洋细菌基因组上,GTA是在海洋环境中发生水平基因转移的重要模式。本文在总结4个模式菌株释放的GTA的认识的基础上,着重描述海洋主要类群的细菌释放的GTA的特征,讨论在海洋生态系统中,GTA对水平基因转移的贡献,并对未来的研究进行了展望。     

基因芯片技术在病原细菌检测中的应用

基因芯片技术具有快速、高通量、平行化等优点,在病原细菌检测中有广泛的应用前景,选择细菌适宜的靶基因是芯片制备的关键之一。用细菌核糖体基因做靶基因的芯片技术,虽然应用广泛,但仍存在一些不足,随着基因组信息及基因功能的深入研究,包括毒力基因、耐药基因等具有较好种属特异性的细菌基因不断被发现,为芯片技术检测病原细菌提供了更多特异的靶基因,使检测结果更加灵敏、准确,在病原细菌研究中将发挥更大的作用。     

细菌最小基因组研究进展

具有最小基因组的细菌只包含维持自我生命复制所必需的基因,其作为一种潜在的工业生产平台具有诸多优势。由于高通量DNA测序和合成技术的发展,目前已经构建了多种缩减基因组的菌株。本文首先介绍了最小基因组的概念,其次总结了细菌必需基因的相关研究进展,然后梳理了人工缩减与合成微生物基因组的相关工作,最后探讨了在设计和组装基因组的过程中遇到的技术障碍和限制,以期为人工合成基因组的实验与应用提供理论参考。     

植物病原细菌的hrp基因

hrp基因存在于4类革兰氏阴性植物病原细菌中,决定病原细菌对寄主植物致病性和诱导非寄主及抗病植物过敏性反应。本文从hrp基因族,hrp基因avr基因的关系,hrp基因的编码产物harpin蛋白,hrp基因调控与功能以及hrp基因参与植物-细菌互作等几个方面,较为详细地阐述了当前植物病原细菌hrp基因的研究状况,并分析了hrp基因未来研究的趋势。     

START家族Rv0164蛋白在耻垢分枝杆菌中的表达及垂钓互作蛋白

【目的】START家族蛋白的突变或者错误表达使哺乳动物产生肾上腺皮质增生、乳腺癌和结肠癌等疾病;START家族蛋白是植物发育过程中重要的调节因子;尚未阐明START家族蛋白作为细菌必需基因的作用机制。结核分枝杆菌必需基因Rv0164属于START家族,功能未知,研究Rv0164作用机制将为START家族分子机制增添新理论。【方法】生物信息学方法分析Rv0164序列特征;模式菌耻垢分枝杆菌中表达Rv0164并分析蛋白的细胞定位;Co-immunoprecipitation(Co-IP)方法垂钓Rv0164的相互作用蛋白,质谱鉴定互作蛋白,酵母双杂交和Pull down验证蛋白相互作用。【结果】Rv0164的N端17个氨基酸在分枝杆菌中不保守;Rv0164无信号肽;Rv0164定位在细胞质中,受蛋白降解机制调控,该机制在细菌生长平台期比对数期活性弱;N端缺失使Rv0164在平台期和对数期均不稳定;Rv0164结合多个胞内蛋白。【结论】Rv0164的N端肽段增加了蛋白的稳定性;Rv0164是一个胞内蛋白;Rv0164能够结合细菌生存必需蛋白。     

鸭疫里氏杆菌hemH基因功能初步鉴定及其缺失株的转录组学分析

血红素是绝大多数细菌生长繁殖所必需的一种营养物质,其参与了细菌多种重要的生理过程。细菌可以通过自身合成和从外界摄取2种方式获得血红素。然而过多的血红素对细菌是有毒性的,细菌则会利用外排、螯合和降解等多种方式减轻血红素毒性。鸭疫里氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)是一种感染禽类的革兰氏阴性菌,前期研究表明该菌可通过转运的方式从外界环境摄取血红素。然而,是否该菌也可以自身合成血红素未知。基因组分析发现鸭疫里氏杆菌ATCC11845菌株中的基因RA0C_RS08070编码铁螯合酶(ferrochelatase)HemH,是参与将铁插入卟啉中心,形成血红素的关键酶。hem H缺失后会导致铁离子和卟啉的积累,对细菌造成毒性。【目的】为鉴定Hem H在合成血红素中的功能及查找参与鸭疫里氏杆菌铁离子和卟啉解毒相关基因。【方法】本研究构建了RAATCC11845Δhem H缺失株,并检测亲本株和hem H缺失株在GCB以及GCB添加血红蛋白液体培养基中的生长情况;随后对亲本株和hem H缺失株进行转录组测序并进行比较分析。【结果】RAATCC11845Δhem H缺失株不能在GCB培养基中生长,而在GCB培养基补充血红蛋白后生长良好。转录组测序及比较分析发现,与亲本株相比,hem H缺失株中有354个显著差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)。基因本体论(gene ontology,GO)功能富集分析发现差异表达基因主要富集在催化活性、生物调节和代谢过程等途径,京都基因和基因组百科全书(Kyotoencyclopediaofgenesandgenomes,KEGG)通路富集分析发现差异表达基因主要富集在氨基酸代谢、氧化磷酸化和三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle,TCA cycle)等途径。【结论】Hem H参与了血红素的合成,hem H缺失后导致大量的基因表达改变来适应代谢的改变,为进一步研究鸭疫里氏杆菌的Hem H的功能奠定基础。