高分辨率熔解曲线分析-分子诊断的新技术

高分辨率熔解曲线分析(High Resolution Melting,HRM)是近几年来在国际上刚兴起的单核苷酸多态性及突变研究工具.这种检测方法因其高通量、低成本、结果准确、不受检测位点的局限,并且实现了真正的闭管操作而受到普遍的关注.对HRM技术的原理和在分子诊断上的应用进行了阐述,并对最新研究进展作一综述.     

高分辨率熔解曲线法检测CYP4A118590T＞C单核苷酸多态性

目的 建立CYP4A11 8590T＞C单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）的高分辨率熔解曲线（high resolution melting,HRM）检测方法.方法先采用温度梯度PCR,确定适宜的退火温度;再利用正交试验,优化引物、DNA模板量和Mg2＋量,最终确定PCR反应体系和反应条件.通过对607例无血缘关系的受试者基因组DNA进行HRM分析,并随机选择50例产物测序.结果 引物最适退火温度为57.8 ℃;PCR最佳反应体系为20 μl,包括2×conc dNTP mix 10 μl,上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μl,DNA溶液（30 ng/μl）1.0 μl,Mg2＋（2.5 mmol/L）1.5 μl和灭菌水6.5 μl.607例受试者中CYP4A11 8590TT、TC和CC基因型频率分别为54.7 %、37.6 %和7.7 %.结论该正交试验优化的HRM技术可用于检测CYP4A11 8590T＞C单核苷酸多态性,且其分析结果和测序结果一致.     

高分辨率熔解曲线分析技术及其应用进展

高分辨率熔解曲线分析(High Resolution Melting,HRM)是结合饱和荧光染料、未标记探针和实时荧光定量PCR的一种新的检测基因突变与基因分型的分子诊断技术,具有高通量、低成本、简单快捷、结果准确、灵敏度和特异性高和真正闭管操作等优点。本文就高分辨率熔解曲线分析的临床应用和研究进展进行综述。     

高分辨率熔解曲线及其应用

饱和荧光染料、未标记探针与实时荧光PCR结合产生的高分辨率熔解曲线(HRM)是一种新的实时定量技术,在检测速度、灵敏度和准确性上具有突出的优点,近几年来在突变扫描、DNA甲基化和基因分型等医学检测中发展迅速.就HRM的原理、应用以及在HRM基础上发展起来的未标记探针(unlabled probe)HMR、弹回探针(snap probe)HMR技术作一介绍.     

高分辨率熔解曲线分析技术检测结核分枝杆菌的耐药性

目的:探讨高分辨率熔解曲线分析(High resolution melting,HRM)技术检测结核分枝杆菌耐药突变位点的可行性。方法:对218株结核分枝杆菌进行利福平(RFP)和异烟肼(INH)的药物敏感性测定,并进行耐药基因位点的PCR扩增和测序,同时采用HRM方法检测RFP和INH耐药基因位点情况,分析HRM的敏感性和特异性。结果:218株结核分枝杆菌药敏试验结果显示,有106株(48.6%)对RFP耐药,100株(45.9%)对INH耐药,81株(37.4%)对RFP和INH均耐药。测序发现,101株(46.3%)存在RFP耐药基因的突变,107株(49.1%)存在INH耐药基因的突变。HRM检测结果显示,100株(45.9%)存在RFP耐药基因的突变,103株(47.2%)存在INH耐药基因的突变。分别以药敏试验和测序结果为标准,HRM检测RFP耐药的敏感性为94.3%(100/106)和99.0%(100/101);特异性为97.3%(109/112)和100%(117/117);INH耐药的敏感性为97.0%(97/100)和98.1%(103/105);特异性为97.3%(109/112)和100%(113/113)。结论:HRM快速检测结核分枝杆菌耐药具有较高的特异性和灵敏度,能够满足临床需求。     

基于高分辨率熔解曲线的常见五种皮肤癣菌分子鉴定

皮肤癣菌是浅表真菌感染的重要致病菌,常见致病菌种包括红色毛癣菌、趾间毛癣菌、絮状表皮癣菌、犬小孢子菌和内弯小孢子菌。本研究基于实时荧光PCR的高分辨率熔解曲线分析技术,以几丁质合成酶1为目标基因设计扩增引物,对经测序鉴定的上述5种皮肤癣菌进行熔解曲线分析,并在方法建立后,对已鉴定的临床菌株进行验证。实验结果表明,使用该方法上述5种皮肤癣菌均能扩增,并表现出不同的熔解曲线和熔解温度值,可有效区分;对其余对照菌及人基因均无法扩增,特异性为100%;临床菌株的熔解曲线分析结果与DNA测序结果一致。本研究提供了一种快速、准确鉴别5种常见皮肤癣菌的方法,可为临床应用和分子流行病学研究提供参考。     

应用高分辨率熔解曲线分析石蜡标本中KRAS基因突变

目的:KRAS基因在结直肠癌患者突变率为30％～50％,并且KRAS基因状态与抗EGFR抗体疗效的密切相关.常用的直接测序法其检测灵敏度低、容易出现假阴性结果.采用高分辨率溶解曲线分析法检测结直肠癌中KRAS基因突变,探索其应用于临床检测的可行性.方法:本文收集20例结直肠癌患者石蜡包埋组织标本,应用高分辨率熔解曲线方法检测KRAS基因突变(2,3号外显子).将KRAS基因突变型DNA(p.G12D)和野生型DNA梯度混合稀释,突变型DNA浓度分别为40％、20％、10％、2％,进行高分辨率熔解曲线方法进行检测,并将扩增产物进行直接测序,比较两种方法的灵敏度.结果:在20例结直肠癌患者中检出5例2号外显子突变,p.G12D 2例,p.G12V 2例,p.G13D 1例,3号外显子未检出突变.HRM方法检测基因突变的检出限可达2％,直接测序法检测基因突变的检出限为20％.结论:HRM法比直接测序法灵敏度高,能精确检测出结直肠癌石蜡标本中低浓度的KRAS突变,有望应用于临床基因突变检测.     

高分辨率熔解曲线分析法检测结直肠癌KRAS基因突变

目的:采用高分辨率熔解曲线分析法检测结直肠癌中KRAS基因突变,探讨其用于临床检测的可行性。方法:首先用高分辨率熔解曲线分析法检测64例结直肠癌患者KRAS基因第2外显子的突变情况,再用直接测序法对结果进行验证。结果:通过高分辨率熔解曲线分析法检测,发现有23例KRAS基因突变(35.9%),经直接测序法验证,证实所有患者的突变情况与高分辨率熔解曲线法的结果完全一致;共检测出6种KRAS突变类型,G12D(GGT>GAT)的突变率最高(47.8%),G12D、G12V和G13D等3种常见突变型占总突变数的78.3%。结论:与直接测序法相比,应用高分辨率熔解曲线分析法检测KRAS基因突变具有操作简单快捷、结果准确、成本低的优点,适合应用于临床检测。     

高分辨率熔解曲线法的非标记探针基因分型技术

PCR反应中利用荧光检测技术对已知位点进行基因分型时常采用荧光标记的寡核苷酸做探针。近年来新兴起的高分辨率熔解曲线技术可以采用非标记的探针对已知位点的SNP(single nucleotide polymorphism)或突变进行基因分型研究。采用非标记探针法对已知位点的基因分型研究具有廉价、快速、简便等特点,因此被大量应用在和疾病、形状等相关的一些多肽位点的研究中。本文较详细地介绍该技术的基本原理和实验中的注意事项。     

基于高分辨率熔解曲线技术的CRISPR/Cas9介导的细胞基因突变快速检测研究

旨在建立一种通过高分辨率熔解曲线(high-resolution melting,HRM)分析技术快速检测CRISPR/Cas9介导的细胞基因突变的方法。采用野生型、纯合突变及杂合突变小鼠胚胎干细胞优化和完善HRM检测条件,然后应用建立的HRM方法对30个测序结果已知的CRISPR/Cas9技术编辑过的小鼠胚胎干细胞单克隆进行检测,根据熔解温度与熔解曲线的差异区分野生型、纯合突变型及杂合突变型,以验证HRM方法的可行性和准确性。结果表明,优化的HRM检测方法能够鉴别野生型、纯合突变型及杂合突变型小鼠胚胎干细胞。应用建立的HRM方法分析30个CRISPR/Cas9技术编辑过的小鼠胚胎干细胞单克隆,结果显示,14个单克隆为杂合突变型、2个单克隆为纯合突变型、14个单克隆为野生型,与测序结果一致,准确率为100%。本研究建立的高分辨率熔解曲线法能对CRISPR/Cas9介导的细胞基因突变进行快速筛选,是一种灵敏、准确、简便、高通量的方法。     

一种快速检测CLN6模型小鼠基因型的方法——高分辨率熔解曲线分析法

目的建立利用高分辨率熔解曲线（HRM）分析快速鉴定CLN6（神经元蜡样脂褐质沉积症,ceroid—lipofuscinosis,neurona16）小鼠（c2硒基因移码突变）基因型的方法。方法根据NCBI公布的小鼠cln6序列（NC00075）设计HRM引物和测序引物,然后采用HRM技术获得高分辨熔解曲线鉴定实验小鼠基因型,同时通过直接测序法进行验证,评价其灵敏性和准确性。结果181只实验小鼠经HRM检测,共有野生型11只、Cln6基因突变杂合子73只和纯合子97只,HRM结果和直接测序结果完全一致,准确性为100％。结论HRM方法检测DNA微小突变时具有操作简便、快速、灵敏,单管避免污染以及准确度高等优点,值得推广。     

草鱼基因组DNA一些RAPD位点的遗传分析及分子标记筛选

RAPD技术的实验结果很容易因实验条件和反应参数的不同而造成差异。为了建立能通用的草鱼基因组多态性分析RAPD分子标记体系,需要利用RAPD位点按照孟德尔共显性规律遗传的特点,用不同遗传背景的材料对多态性的RAPD位点进行统计遗传学比较分析以判断其真实性。为此,本实验选择具有遗传多态性的湘江流域草鱼群体和经连续两代人工诱导雌核发育获得的雌核发育草鱼品系,对一些可能作为草鱼基因组DNA分子标记的RAPD位点进行了遗传学比较分析。所用的10条多态性随机引物共检测到30个多态性RAPD位点。两个不同遗传背景群体的遗传统计对比分析结果表明:这30个多态位性位点在湘江流域草鱼群体和雌核发育草鱼群体中的分布符合孟德尔遗传规律,可以作为草鱼基因组DNA分析的可靠分子标记。本实验的观察结果还表明:在人工诱导雌核发育过程中,存在RAPD位点的快速丢失现象,两次人工诱导雌核发育过程中共丢失了17个多态性位点。因此,加强对自然水体中草鱼种质资源多样性的保护和利用各种现代生物学技术纯化、筛选和组合优良性状基因,是草鱼遗传育种中同样重要和不可或缺的两个方面。       

小麦新抗源CH5383抗条锈病基因的遗传分析及分子定位

CH5383是新育成的源于中间偃麦草的渗入系,对小麦条锈病和白粉病均表现免疫。为明确其抗性来源、遗传方式和抗病基因在染色体上的位置,将CH5383的系谱材料及其与高感条锈病品种(系)杂交的F1、F2和F2:3家系群体进行条锈病抗性鉴定。结果表明,CH5383对条锈病的抗性源于中间偃麦草,对条锈病生理小种CYR32的抗性由一对显性核基因控制,将此基因暂时命名为YrCH5383。从476对SSR引物中筛选到3对引物Xgwm108、Xbarc206和Xbarc77与抗病基因连锁,遗传距离分别是8.2 cM、10.7 cM和13.6 cM。根据这两对标记在染色体上的位置,将抗病基因定位到3B染色体的长臂上。3B染色体的长臂还未见有正式命名的抗条锈病基因的报道,推测YrCH5383可能是一个源于中间偃麦草的新抗条锈病基因。     

生物分子相互作用分析技术的一次突破

细胞生命活动的过程,无不涉及两个或多个生物分子之间相互作用,如信号传导、免疫反应、酶与底物作用等。因此,为了更好地研究生命过程,就迫切需要开发出一种能实时检测出生物分子间相互作用的系统,Phar－maca公司于90年代初就开发出了这样一种技术,即BM技术（BiornoecularInterationAnalssis）,该技术是基于表面等离子共振（Snd。PI。R。ce,简称SPR）的光物理现象［fi。在该现象中,所检测出的共振角与结合在传感片表面的生物分子的质量呈正比例关系。因此以时间对共振角（以共振单位表示）作图可记录相互作用的动态全过程,…     

传染性病原体的分子诊断——技术的发展与趋势

分子遗传检验的优点表现在，基于遗传信息的特异性，统计上的灵敏性，以及与以往检测相比的快捷性。发病机理的分子基础，与基于核酸自主装配技术的结合，使多元检验的发展达到顶峰，即：可以同时检测和区分多种病原体或致病因子。但目前核酸技术仍不能解决所有诊断中的问题。     

生物传感技术的新应用——生物分子相互作用分析技术（BIA）

BIA 技术(biomolecular interaction analysis)——生物分子相互作用分析技术是利用生物传感技术发展的全新概念.生物分子间的相互作用可在免标记的状态得到实时的追踪和分析.文章简单介绍BIA的原理和应用范围.在以后的几期杂志中,还将介绍一系列应用实例.结合已发表的近400篇应用文献,读者可以看到此新技术应用范围之广,得到的信息之多,堪称开创了生物技术的新纪元.     

利用RAPD技术分析实验用比格犬的遗传背景

目的　运用RAPD技术对实验用比格犬 (Beagle)进行遗传背景分析。方法　筛选的 16个RAPD引物对 4 0个样品的分析 ,共得到 93个扩增条带。结果　所有样品的相似系数 80 4 %到 10 0 %间变动 ,平均相似系数为93 2 8% ,聚类分析得到了这些个体的同源树资料。结论　本遗传背景资料可以为以后的比格犬繁育生产和生物医药学的研究应用提供技术指导     

基于PacBio测序数据的蜜蜂球囊菌SNP与InDel位点发掘及分析

[目的]本研究拟利用已获得的蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis菌丝的PacBio单分子实时(single molecule real-time,SMRT)测序数据对蜜蜂球囊菌的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)和插入缺失(insertion-deletion,...     

基于RNA-seq技术对大骨鸡垂体及下丘脑组织的SNP/InDel分析

下丘脑和垂体调节母鸡的生殖生理和产蛋性能。为了解其产卵调控机制,利用RNA-seq技术对高产和低产庄河大骨鸡的下丘脑和垂体组织进行测序和分析,获得SNP/InDel位点,并进行数据统计及生物信息学分析,以鸡基因组作为参考,对SNP所在基因进行GO富集分析。结果显示:SNP/InDel纯合子变异体数量高于杂合子变异体数量,垂体组织中的SNP/InDel数量高于下丘脑组织;SNP类型转换种类少于颠换,但转换类型的数量却远远高于颠换;垂体组织中的SNP所在基因的GO富集程度与生产性能呈负相关关系(P0.05),下丘脑组织中的SNP所在基因的GO富集程度与生产性能呈正相关关系(P0.05)。研究结果为大骨鸡的选育以及改善其生产性能的研究提供了理论依据。     

作物分子设计育种的发展态势分析

近年来,分子设计育种逐渐成为作物育种的重要技术手段,全球各国都已对该领域进行了积极的规划和布局。本文通过分析各国在作物分子设计育种方面的政策规划,分析了各国布局的重点研究领域和研究对象,通过文献计量,利用citespace和VOSviewer软件,分析了“分子设计育种”概念提出以来,领域的发展态势、知识和技术演化以及当前的研究热点,并对未来分子设计育种的研究发展趋势进行了展望。