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1.
目的建立一种基于尼龙膜的反向斑点杂交法,用于检测乙型肝炎病毒(HBV)基本核心启动子区(BCP)A1762T/G1764A突变。方法根据我国HBV主要流行的基因型为B和C,从GenBank上查出4种HBVBCP序列。利用在线工具ClustalW进行比对,针对该突变位点设计引物和检测探针。探针经合成和修饰后点在带正电的尼龙膜上。将反向斑点杂交法结合地高辛检测试剂盒用于检测A1762T/G1764A突变,以测序法确定该区域序列的标本为检测对象。结果反向斑点杂交法分别检测5例A1762/G1764病毒株、2例T1762/G1764病毒株、5例A1762/A1764病毒株和4例T1762/A1764病毒株,结果与测序完全相同。结论应用本方法可以快速、准确地HBV相关的热点突变。 相似文献
2.
通过构建乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)单倍体分子,阐明HBV基本核心启动子突变(A1762T/+G1764A,BCP)对HBV复制的影响。本研究收集了HBeAg阴性的慢乙肝患者,将其中两例BCP突变的序列通过重叠PCR克隆到HBV1.3倍体的复制质粒;构建环状的HBV单倍体分子,转染Huh7.0细胞后,通过ELISA、实时荧光定量PCR等分析BCP突变对病毒复制的影响;通过荧光素酶实验分析BCP突变对HBV preC mRNA转录的影响。55例HBeAg阴性的慢乙肝患者中有30例带有A1762T/G1764A的突变;克隆带有BCP突变的临床序列到HBV 1.3倍体转染细胞后,上清中HBeAg为阴性,表面抗原降低10%(P>0.05);构建的HBV单倍体环化后形成闭合环状的cccDNA分子,转染细胞后,结果表明BCP突变后,HBeAg下降55.48%(P<0.05),表面抗原无显著性差异(P>0.05),细胞内病毒颗粒中DNA水平为野生型的3.18倍,上清中HBV DNA为野生型的1.36倍;BCP突变后preC mRNA水平降低81.05... 相似文献
3.
新OPG/OCIF变体基因的克隆及其表达 总被引:2,自引:0,他引:2
从正常中国人肝细胞株L02中抽提总RNA,利用RT-PCR技术克隆了亲破骨细胞抑制因子(OPG/OCIF)cDNA,同时从人胎肾细胞株293细胞中克隆了OPG/OCIF基因3′端基因组序列,序列分析结果表明,与国外文献报道相比较,中国人肝细胞株中该cDNA3′端存在一个赭石型终止码突变,从而使这一蛋白质所报道的在C端少8个氨基酸残基。从293细胞克隆的基因组序列也同样存在这一突变。将OPG/OCI 相似文献
4.
本研究通过缺失突变和移码突变研究了ctx B基因上游A基因部分序列对ctxB表达水平的影响,结果表明:(1)将霍乱毒素操纵子XbaI-EcoRi片段克隆至pUC19,构建的质粒pUC19CTB中A亚基的部分序列不能翻译,该质粒转化大肠菌后的CTB的表达产量为30μg/μl;(2)在质粒pUC19CTB的XbaI位点引入移码突变,构建质粒pMC02C,使A亚基基因部分序列能够翻译至自然的终止密码,B 相似文献
5.
细胞培养上新城疫病毒HN基因在抗体免疫选择压作用下的抗原表位变异 总被引:3,自引:0,他引:3
本实验研究了抗体免疫选择压对新城疫病毒(NDV)HN基因和F基因变异的影响。将NDV野毒株TZ060107分别接种到含有抗NDV的单因子血清(A组)与不含抗体的(B组)鸡胚成纤维细胞中连续传代,每组设3个独立的传代系列。分别对第10,20,30,40,50代病毒的HN和F基因进行扩增克隆测序。序列比较结果显示,有抗体A组HN基因发生突变的位点数明显多于无抗体B组,且非同义突变(NS)与同义突变(S)比值NS/S为6,明显高于无抗体B组NS/S的3.4。在有抗体A组有5个碱基位点发生稳定的非同义突变,而且其中3个(aa#353,521和568)与已知的抗原表位密切相关。F基因在有抗体A组也出现2个稳定的非同义突变,无抗体B组没有产生稳定变异。但不论在有抗体A组还是无抗体B组,F基因变异的NS/S比均小于2.5。本研究表明,抗体免疫选择压可显著影响HN基因变异,但对F基因变异的影响小于HN基因。 相似文献
6.
水稻纯合胚致死突变研究 总被引:2,自引:0,他引:2
以EMS的处理并结合组织培养技术成功地获得胚致死突变的纯合再生植株。该植株生长发育正常,除种子无发芽能力外,纯合突变体的一切性状均与亲本品种表现一致。观察到胚败育的各种表现:(1)仅具有一个球形胚。(2)完全没有胚器的分化。(3)仅具胚根的分化而无胚芽的分化。(4)胚芽分化不完全。(5)胚芽与胚根之间没有输导组织相连接或者输导组织发育不完全等等。(纯合突变体×正常品种)杂种当代的种子(F1)发芽正常,而由F1及R1植株上所产生的种子(F2及R2)约有3/4具发芽能力,而1/4无发芽能力。统计分析的结果表明胚致死突变受隐性单基因控制。据我们所知,获得胚致死突变纯合体的成熟植株,本研究乃是首例报告,至少在水稻上是如此。在以利用无融合生殖之固定杂种优势的“一系法”杂交水稻生产的设想中,胚致死突变可作为胚乳的提供者而加以利用。 相似文献
7.
为了探索POLG1外显子1、3、4、7突变与弱精子症的相关性及对mtDNA序列突变和4977bp缺失的影响,按WHO标准收集了120例弱精子症和101例精子活力正常的精液标本,经PCR测序分析POLG1外显子1、3、4、7突变,继而测序检测9例外显子4c.948G〉A突变的弱精子症标本、9例无C.948G〉A突变的弱精子症标本和9例正常对照标本的mtDNA全序列,利用巢式PCR技术分析94Pie.948G〉A突变标本、9例无C.948G〉A突变的弱精子症标本和9例对照标本的4977bp缺失。结果显示:在120例弱精子症中发现P说G,外显子4c.948G〉A突变9例(7.5%),显著高于对照组(0%,P〈0.05)。c.948G〉A突变组mtDNA全序中突变率与对照组比无统计学差异俨〉0.05)。作者关注的两组中,突变数有差异的位点累积突变频次突变组显著高于对照组俨〈0.05),但与无C.948G〉A突变的弱精子症标本的累积突变频次比较无统计学意义;突变组mtDNA4977bp缺失率(7/9,77.8%)显著高于对照组(2/9,22.2%,P〈0.05)和无c.948G〉A突变的弱精子症组(2/9,22.2%,P〈0.05)。以上结果提示,弱精子症的发生可能与POLG,c.948G〉A突变有相关性,弱精子症线粒体DNA某些位点的累积突变率增高,但可能不是POLGlc.948G〉A突变引起;c.948G〉A突变可能会增加mtDNA4977bp缺失,从而影响精子线粒体功能,导致精子活动力下降。 相似文献
8.
副粘病毒融合蛋白活性位点中亮氨酸基因突变分析 总被引:7,自引:3,他引:7
为了确定副粘病毒融合蛋白(F)分子上活性位点中亮氨酸在F的细胞融合作用中的作用,弄清F融合细胞的分子机理,采用基因定点突变法创造一个酶切位点,用酶切反应初步筛选突变株,然后用DNA序列分析进一步确定,并在真核细胞内进行表达,Giemsa染色和指示基因法检测细胞融合功能,荧光强度分析(FACS)检测表达效率。结果表明,hPIV3等460位亮氨酸(L)和第474位异亮氨酸(I)分别突变成丙氨酸(A)( 相似文献
9.
目的探讨我国3个特有的小型猪品系,巴马小型猪,五指山小型猪,中国农大小型猪胰淀素(IAPP)基因多态性分布,为我国小型猪在2型糖尿病及代谢性疾病研究中的应用提供基础资料。方法提取3个品系小型猪血液基因组DNA,针对IAPP基因外显子3~内含子3的部分序列进行PCR扩增,产物鉴定、测序,统计分析基因多态。结果在所扩增的片段中共检测出2个SNPs位点,SNPs1:43G→A,位于外显子上,未引起的氨基酸的改变,突变发生在五指山猪(G/A杂合突变为16.7%,A纯合突变为83.3%)和中国农大猪(G/A杂合突变60%,A纯合突变为20%两个品系中。SNPs2:214C→T,位于内含子上,发生在五指山猪(T/C杂合突变为16.7%,T纯合突变为83.3%)和中国农大猪(T/C杂合突变为20%,T纯合突变为60%)两个品系中。结论在IAPP基因外显子3-内含子3的部分扩增序列中发现了2个SNPs位点,在3个品系小型猪中的分布不同。 相似文献
10.
对SARS病人粪便样本直接测序,得到SRAS—CoV BJ202全基因组序列(AY864806)。应用比较基因组研究方法对GenBank中公布的115株SARS—CoV基因组序列以及BJ202进行分析。以GZ02序列为参照,发现2个以上基因组中同时存在单核苷酸多态(SNP)位点共278个。多态位点在SARS—CoV基因组中呈偏态分布,大约一半突变位点(50.4%,140/278)发生在基因组3’末端1/3区域。编码Orf10-11、Orf3/4、E蛋白、M蛋白和S蛋白区域突变率较高。克隆并测序含有BJ202基因组12个多态位点的11个cDNA以及4个不含已知多态位点的cDNA片段(15个片段总长度为6.0kb),结果显示:BJ202特有的3个多态位点(13804、1503l和20792)以及另外3个多态位点(26428、26477和27243)均检出两种不同核苷酸;位点18379虽在已公布的115株SARS—CoV基因组中未发现突变,实际上也是多态位点。14个克隆中有8个克隆该位点为A,6个克隆为G。全部116个SARS—CoV基因组中共有18种缺失类型和2种插入类型。大部分缺失发生在编码ORF9和ORF10-11区域(基因组序列27700—28000bp处)。以邻位连接法(Neighbor-Joining)构建了116株SARS—CoV系统发育树,BJ202与BJ01和LLJ-2004等SARS—CoV的亲缘关系较接近。 相似文献
11.
摘要:α-银环蛇毒素(α-bungarotoxin)是一种突触后神经毒素,广泛存在于眼镜蛇科蛇类的毒腺中,对于该基因cDNA多态性是否真实一直存有争议。本研究从银环蛇基因组DNA中克隆到α-银环蛇毒素基因序列,并对其中5个克隆进行测序和序列比对分析。作为参照,从同一次反转录得到的cDNA混合物中,克隆了蛇毒神经生长因子cDNA,并对其进行测序、比对和突变情况分析。综合各研究组报道的α-银环蛇毒素cDNA序列、α-银环蛇毒素基因序列和神经生长因子cDNA序列的突变情况,发现α-银环蛇毒素cDNA的多态性在基因组模板上不存在对应的变化,因此推测这种多态性不是从不同的转录本而来,同时考虑到不同研究小组报道的序列突变位点并没有出现相同的情况,因此其多样性也不是RNA编辑的结果。可见这种cDNA序列上的多样性很可能是由反转录过程以及基因克隆过程中人为引入的错误造成的。 相似文献
12.
猪CACNA1S基因部分序列的克隆、测序及SNP检测 总被引:2,自引:0,他引:2
CACNA1S是钙离子通道主效亚基α1亚单位的编码基因,该基因突变会导致人(Homo sapiens)低钾性周期性麻痹和恶性高温综合征.目前CACNAIS基因的研究主要集中在人和模式动物上,而在家畜中的研究少见报道.本研究以金华猪(115头)、皮特兰猪(30头)、金华猪与皮特兰猪杂交产生的金皮F2代杂种猪(126头)、大约克猪(23头)为研究对象,根据人CACNA1S基因序列设计引物,对猪基因组DNA进行PCR扩增、克隆测序,并与人相应序列作同源性比较,然后采用PCR-SSCP技术检测序列中可能存在的单核苷酸多态(single nucleotide polymorphism,SNP)位点,并对有合适内切酶存在的突变点应用PCR-RFLP技术进行验证.结果表明:(i)用6对引物对猪基因组DNA进行扩增,共克隆得到猪CACNAIS基因约5211bp的DNA序列,其中外显子区域,猪与人同源性为82.6%,序列已递交GeneBank收录(登录号DQ767693);(ii)在克隆得到的DNA序列中,共检测到57个单核苷酸突变点,其中外显子区域存在24个;(iii)突变位点的PCR-RFLP验证与PCR-SSCP检测结果一致,经与GenBank公布的猪CACNAIS基因EST小片段(Bx914582,Bx666997)比较,相应长度核酸序列内本实验检测到的11个SNP位点中,有8个位点的碱基突变与2个EST片段间存在的碱基差异相同. 相似文献
13.
染色质重塑复合物相关基因在癌症中频繁突变,这种现象逐渐引起研究者的重视。然而,染色质重塑活动如何引起癌症发生,对此机理研究甚少。ARID1A是SWl/SNF(BRG1相关因子)染色质重塑复合物中的一个亚基,具有DNA结合活性,可以与富含AT的DNA序列特异性结合。近来基因组测序发现,ARID1A在卵巢癌、肝癌、胃癌、乳腺癌等肿瘤中频繁发生突变,这些突变导致ARID1A在肿瘤中表达降低,表明ARID1A是个潜在的抑癌基因。该文将针对ARID1A在各种癌症中的缺失及失活机制、ARID1A的生物学功能和潜在抑癌机理以及与,临床预后之间关系等方面做一综述,以期为肿瘤诊断、治疗提供新思路。 相似文献
14.
15.
用瞬时表达分析等方法,证明牛泡沫病毒( B S V)3026 中国毒株能在体外激活牛免疫缺陷病毒( B I V) 基因表达, B S V3026 编码的反式激活因子 Borf1 行使这种激活作用。缺失突变分析表明, Borf1 在 B I V L T R 上靶序列位于- 410/ - 115( + 1 为转录起始位点) 区域,但其中的 N Fκ B 位点( - 367/ - 319) 与这种激活作用无关,包括转录起点下游( R U5 区) 在内的- 115/ + 204 区域也与这种激活作用无关。该结果对研究 B I V 致病机理及防治 A I D S 有重要意义。 相似文献
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目的:对分化抑制蛋白(Id)家族的N端序列进行保守性结构分析,并构建其基因突变体。方法:用ClustalX(1.81)软件对Id蛋白家族中的3个成员(Id1~Id3)的N端序列进行同源性分析,用Swiss-PdbViewer3.7(SP5)软件模拟高同源区域中关键性氨基酸突变前后的三维结构模型;用PCR方法将突变点引入Id序列,再通过重叠PCR方法扩增出全长编码序列,酶切与测序确证突变序列的准确性。结果:Id1~Id3蛋白的N端存在一个由11个氨基酸残基形成的高度保守的环-螺旋(Loop-Helix)结构,将其中最保守的丝氨酸与亮氨酸分别突变为甘氨酸与缬氨酸,将突变后的Id基因序列重组到pGEX原核表达载体中。结论:在Id1~Id3蛋白N端识别了一个保守的Loop-Helix结构,为深入研究其协同的功能特征提供了结构依据;突变其中的丝氨酸为研究Id蛋白潜在的磷酸化修饰及相应功能特征的改变奠定了基础。 相似文献
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以携带质粒pAM120(Ap^r,Tc^r/Tn916)的大肠杆菌(E.coli CG120)为供体菌株,与受体菌巴西固氮螺菌采用膜接合法进行接合转移,在选择平板上得到具较高频率的接合子(10^-5/每个供体菌,选择四环素抗性)。从846株四环素抗性接合子中进一步用奈氏法筛选得到氨分泌突变株3株。在无氮培养基上,其氨分泌量可达7.5 ̄14.0mmol/L。用乙炔还原法分析氨分泌突变株在不同浓度氮源 相似文献
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对7-木糖紫杉烷糖基水解酶Lxyl-p1-2基因进行定向进化的初步研究,确定易错PCR条件、优化克隆连接方法、建立基于48微孔板高通量筛选模型。利用易错PCR技术对Lxyl-pl-2基因进行随机突变,比较不同浓度M聋’进行易错PCR,每组随机挑取10个克隆进行测序。序列分析表明:在M聋’浓度为7mmol/L条件下,碱基平均突变率为0.12%,即对于Lxyl-p1-2基因(2.4kb)来说,每个基因序列平均有3个碱基突变,达到构建突变文库的频率要求,选择该条件作为易错PCR条件。利用in-fusion技术将Lxyl-p1-2突变基因克隆到pPIC3.5K载体中,获得大量重组突变质粒。该研究优化了in-fusion连接反应中基因片段和载体片段的摩尔比,并探讨了基因片段与载体片段问同源序列长度对in—fusion连接效率的影响。试验结果表明:基因片段与载体片段的摩尔比最佳梯度为5:1;同源序列长度的选择成为影响in—fusion连接效率的关键因素之一。当同源序列长度为100bp时连接效率达到最大值,且显著高于同源序列长度为15~50bp的连接效率,此时阳性重组率提高至90%左右。与常规酶切一连接法相比,in-fusion法具有明显优势,同时将克隆周期由3~4d缩短为1~2d。挑取单菌落,在48微孔培养板上进行培养、诱导表达2d后,取菌液进行酶活测定(底物PNP-Xyl)。以野生型为例,β-木糖苷酶的酶活013405均数μ=3.415,其数据组标准差为δ=±0.078,数值符合正态分布的原理,建立统计学野生型均数分布范围和48微孔板高通量筛选,为后续突变体筛选提供基础。 相似文献
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正常人外周血用~(60)Co射线分别进行1~8Gy照射后,在含6-TG的培养基上克隆和筛选人淋巴细胞hprt突变细胞。细胞的突变频率与γ射线的照射剂量呈正相关.获得42个hprt突变细胞株,用8对hprt寡核苷酸引物进行多聚酶链反应(PCR)从细胞粗提物中分别扩增hprt各个外显子,分析突变细胞的hprt基因突变,约60%(25/42)的hprt基因突变为基因缺失,其中13个突变是hprt基因全部缺失,而12个是部分hprt基因外显子缺失,约有40%(17/42)的突变无明显的PCR扩增变化.同时显示hprt基因外显子的缺失突变与辐射剂量有关,实验结果提示,此方法有可能用于估计辐射剂量和进行辐射远后效果观察,进而揭示辐射致突的分子机理. 相似文献
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目的:对临床诊断为眼皮肤白化病(OCA)患者的酪氨酸酶(TYR)基因进行突变筛查,了解我国大陆OCA患者TYR基因突变类型,探讨基因突变对人TYR蛋白结构和功能的影响。方法:应用PCR技术,扩增患者及其父母的TYR基因外显子、外显子-内含子交界区及启动子区;以DNA序列测定技术,进行突变筛查与鉴定;利用生物信息学方法,对突变引起蛋白结构和功能的改变进行预测与分析。结果:在15名患者的30个TYR等位基因内,查明11种突变;其中错义突变5种(W400L、R299H、E294K、R77Q和K142M),无义突变3种(R116X、R278X和G295X),插入突变2种(929insC和232insGGG),剪切位点突变1种(IVS1-3 C〉G);对4个突变W400L、R299H、929insC、232insGGG的生物信息学分析显示,突变的致病性与蛋白结构和功能的改变相关。结论:W400L占本研究所检出全部OCA1突变等位基因的30.0%(9/30),可能为中国大陆人群中较常见的TYR基因突变类型;应用生物信息学分析方法对TYR基因突变的致病性做出一些合理可能的解释是可行的。 相似文献