霉酚酸产生菌原生质体转基因方法的建立

摘要:【目的】建立霉酚酸产生菌短密青霉菌的遗传转化体系。【方法】以腐草霉素抗性为选择标记,利用聚乙二醇介导原生质体融合,进行外源基因转化。【结果】聚乙二醇介导的短密青霉菌原生质体转化效率为每微克DNA 2－3个转化子;转化子的PCR检测结果显示外源基因已经整合到短密青霉菌基因组中,转化子抗性稳定。【结论】霉酚酸产生菌短密青霉菌转基因体系的建立为该菌进行分子生物学研究以及基因工程育种奠定了基础。     

水稻植物内生链霉菌中线型和环型质粒的检测

以广东番禺和五山地区水稻植株中分离到的内生链霉菌为对象,调查可能存在的内源质粒.利用脉冲电泳技术从8个菌株中检测到大小在60 kb～410 kb的线型质粒,其中4个菌株的线型质粒可能有保守的端粒复制基因.该结果与土壤链霉菌中检测到线型质粒和具有保守端粒复制基因的比例相似,表明水稻植物组织内部的独特环境不会造成链霉菌线型质粒的多样性分布产生大的变化.此外,从13个菌株中检测到6 kb～60 kb的环型质粒.     

大豆疫霉菌ITS分子检测程序的建立及其应用

依据GenBank中登录的大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)、近缘种及相似种rDNA的ITS区序列差异,进行多重比较后设计合成一对大豆疫霉菌特异引物,并在PCR反应体系和扩增条件优化的基础上,对包括大豆疫霉菌在内的共140个菌株进行PCR检测。结果表明,电泳后只有大豆疫霉菌扩增出一条288bp的特异性条带。运用设计的大豆疫霉菌专用引物(专利申请号200610089105.4)及建立的检测程序对大豆疫霉菌纯培养游动孢子、接种于土壤中的游动孢子和卵孢子以及接种发病的大豆染病组织进行了检测应用,结果显示该检测程序对接种于土壤中的大豆疫霉菌游动孢子和卵孢子的检测理论精度分别达0.3和0.06个孢子,对染病组织检测也表现出了较高的灵敏度。     

庆丰链霉菌的致死接合现象

庆丰链霉菌各种衍生菌株的平板或斜面能自发产生麻点现象(pock),而当种内或种间杂交时,这种现象出现得更频繁。从麻点中心和周围孢子中可分别分离到具有产生麻点能力的菌株(Ltz~+)和本身虽然不能产生麻点但却可以作为检测麻点产生的指示菌株(Ltz~-)。 本文的研究结果表明,庆丰链霉菌的麻点现象是Ltz~+菌株和作为指示菌的Ltz~-菌株细胞之间在接合过程中的一种致死接合作用(lethal zygosis),致死率可达99％以上。决定这种致死能力的遗传因子能感染转移,可用已知质粒消除因子(如吖啶黄、高温预培养)处理及原生质体再生过程诱发消除。据此,我们认为庆丰链霉菌中产生麻点的能力很可能由质粒基因所决定。对于这种质粒的可能来源进行了讨论。     

食品中霉菌、酵母菌检测分析

食品中霉菌、酵母菌的检测是食品检测中非常重要的一个检测环节。但随着科技和经济的快速发展,传统检测方法的效率已经不能够满足社会需求,需要朝着快速化、简便化和准确化方向发展。对此,本文将对食品中霉菌、酵母菌检测的方法和实验结果进行分析。     

一株罗布泊盐湖链霉菌的鉴定及其代谢产物对酪氨酸酶活性、黑色素生成的抑制效应CSCD

本研究采用多相分类法对一株分离自新疆罗布泊盐湖链霉菌89-2-2进行鉴定,通过CCK-8法、L-多巴氧化法和NaOH溶解法检测该菌株乙酸乙酯提取物对小鼠黑色素瘤B16细胞增殖、细胞内酪氨酸酶活性及黑色素含量的影响。以抑制酪氨酸酶活性为指标,应用LC-MS代谢组学方法检测链霉菌89-2-2发酵条件优化前后所产生的差异代谢物,分析可能具有抑制活性的代谢产物类型。结果初步鉴定该菌株为西唐氏链霉菌(Streptomyces setonii)89-2-2。S.setonii 89-2-2乙酸乙酯提取物在100~1000μg/mL浓度范围内几乎无细胞毒性,但能有效抑制B16细胞内酪氨酸酶活性和黑色素生成,与空白组相比均具有显著性差异(P<0.05)。代谢组学实验的结果显示S.setonii 89-2-2产生的差异代谢物主要为维生素类化合物、芳香类化合物和羧酸类化合物。本研究为从新疆罗布泊链霉菌中开发酪氨酸酶抑制剂和黑色素合成抑制剂提供重要的科学依据。     

水霉菌环介导等温扩增检测方法的建立

【目的】建立一种快速简单检测水霉病病原菌的方法。【方法】针对水霉菌ITS区基因序列设计4条特异性引物,包括两条外引物和两条内引物,优化反应条件,观察检测结果。对该方法的特异性和敏感性进行研究。【结果】建立了环介导等温扩增技术检测水霉菌的方法,确定了其最适反应条件。该方法能够检测到浓度低至103个/mL的水霉菌孢子,其灵敏度是普通PCR方法的100倍。【结论】建立的检测水霉菌的LAMP技术,具有操作简便快速等特点,可用做特异性水霉及其孢子的快速鉴定。     

赤霉素

赤霉素(Gibberellin)有二大类:植物赤霉素(Plant Gibberellin)和霉菌赤霉素(Fungal gibberellin)本篇着重介绍霉菌发酵生产的赤霉素。赤霉素产生菌和赤霉素命名赤霉素是植物生长刺激素之一,又称九二○。目前已发现62种,其中霉菌赤霉素二十余种。Wollenweber(1931)首先对霉菌赤霉素产生菌株进行分类研究,由于其产生菌孢子形似镰刀,故属于镰刀菌属,又将其无性生殖分生孢子期菌命名为Fusarium moniliforme     

高效检测分析玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63线性质粒

【目的】建立一种高效检测和分析玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63内源质粒的方法。【方法】根据“链霉菌线性质粒5′末端都结合有共价蛋白”这一性质,通过改进琼脂糖包埋块制作方法,发明了一项快速高效检测链霉菌质粒种类、构型及大小的技术,称为“包埋块二次处理法”,该方法还能从正反两方面表明共价蛋白的存在与否。【结果】利用此方法高效检测出了玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63中存在两种线性质粒,双向电泳验证了该方法的正确性,推测质粒大小分别约为 47 kb和53 kb。【结论】利用本研究发明的方法首次成功地检测了玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63中的内源线性质粒。     

山东半岛农药污染点源放线菌多样性及抑菌活性

【目的】探究山东半岛农药污染点源放线菌多样性及非链霉菌抑菌活性,试图发现新放线菌和新抗生素。【方法】通过16S rDNA序列对已分离得到的154株纯培养放线菌进行初步分类鉴定并进行系统发育分析;采用管碟法和菌丝生长速率法检测10株非链霉菌的抑菌活性。【结果】154株放线菌覆盖7个科,8个属,有一株非链霉菌(205)可能为潜在的新种。10株非链霉菌的发酵液均对供试的植物病原真菌和细菌有不同程度的抑制作用,尤其是菌株Microbacterium oxydans JN853773和Kocuria rosea JN192402对所有供试病原菌都有强烈的抑制作用。【结论】农药污染点源可以作为开发新型抗生素产生菌的重要来源。     

一种产生纤溶酶的链霉菌C—3662的鉴定与发酵研究

对一株从土壤中分离的纤溶酶产生菌链霉菌C-3662的形态、培养、生理生化和化学分类特征进行了研究,发现其与泛温链霉菌（Streptomyces eurythermus Corbaz et al.1968)的特征很相符。通过对链霉菌C-3662的16SrDNA序列进行测定与比对,发现它与泛温链霉菌的16SrDNA序列也有高达98.19%的同源性。根据多相分类原则,认为链霉菌C-3662属于泛温链霉菌。对链霉菌C-3662的发酵培养基组成等的研究表明,合适的发酵培养基中应含有氮源黄豆饼粉2.0%、碳源淀粉1.0%和葡萄糖2.5%以及少量的无机盐类和硫酸镁。链霉菌C-3662的发酵过程研究表明,纤溶酶是菌丝体生长停止之后才大量产生。     

45份活性乳酸菌饮料微生物指标检测结果的分析

目的：对辽宁21家生产企业生产的活性乳酸菌饮料进行了微生物指标检测结果的分析。方法：共采集活性乳酸菌饮料45份,对其进行了乳酸菌数、大肠菌群数、致病菌、霉菌及酵母菌的测定,并对霉菌及酵母菌的菌相进行了分析。结果：17份样品乳酸菌数未达到食品卫生国家标准的要求,合格率为62.22%,有5份样品的霉菌数及4份样品的酵母数超过了食品卫生国家标准的要求,霉菌及酵母菌的合格率分别为88.89%、91.11%。本次调查共检出霉菌280株,占比例较大的是青霉、曲霉、镰刀菌、木霉、毛霉等,其中大部分可产生对人体有害的霉菌毒素。检出酵母菌1240株,主要为汉逊酵母、红酵母。结论：45份活性乳酸菌饮料中乳酸菌数合格率是比较低的。乳酸菌数量对产品质量优劣起着重要的作用,因此,通过对乳酸菌的分离培养与计数技术经常检测其活性是非常必要的。     

放线菌分类主要参考书

链霉菌鉴定手册,中国科学院微生物研究所放线菌分类组编著,1975年,科学出版社。本书将七百多个链霉菌的种和变种,按形态和培养特征分为14个类群。拟定了简便的查索方法,并附有链霉菌产生     

一种产生纤溶酶的链霉菌C-3662的鉴定及发酵研究

对一株从土壤中分离的纤溶酶产生菌链霉菌C-3662的形态、培养、生理生化和化学分类特征进行了研究,发现其与泛温链霉菌(Streptomyces eurythermus Corbaz et al. 1968)的特征很相符。通过对链霉菌C-3662的16S rDNA序列进行测定与比对,发现它与泛温链霉菌的16S rDNA序列也有高达98.19%的同源性。根据多相分类原则,认为链霉菌C-3662属于泛温链霉菌。对链霉菌C-3662的发酵培养基组成等的研究表明,合适的发酵培养基中应含有氮源黄豆饼粉2.0%、碳源淀粉1.0%和葡萄糖2.5%以及少量的无机盐类如硫酸镁。链霉菌C3662的发酵过程研究表明,纤溶酶是在菌丝体生长停止之后才大量产生。     

阿维莲霉菌中aveD基因缺失对阿维菌素合成的影响

利用aveD基因的缺失载体pCZ8(pKC1139::△aveD)对阿维菌素（Avermectin）的产生菌阿维链霉菌（Streptomyces avermitilis)76-9的aveD基因进行缺失获得aveD缺失突变株。经摇瓶发酵和HPLC检测,发现该突变株只产生阿链菌素B组分。说明将阿维链霉菌的aveD基因缺失,并不影响下游aveF的表达。缺失突变株的阿维菌素的总产量与出发菌株的总产量基本相同,突变株中B1的产量略有提高,阿维菌素B2的含量显著提高。     

透明颤菌血红蛋白基因在阿维链霉菌中的表达

将含有自身启动子的透明颤菌血红蛋白基因（ ｖｈｂ） 克隆至大肠杆菌—链霉菌穿梭质粒载体ｐＩＪ６５３ 中构建成表达载体ｐ ＷＹ１０１ 和ｐ ＷＹ１０２ ,用它们转化阿维菌素（ａｖｅｒｍｅｃｔｉｎｓ） 产生菌———阿维链霉菌（ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ） ,经Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ 分析并未检测到ｖｈｂ 基因表达,但用穿梭载体ｐＨＺ１２５２（ 其中的ｖｈｂ 基因位于受硫链丝菌素诱导的链霉菌强启动子ＰｔｉｐＡ之下） 转化阿维链霉菌并经硫链丝菌素诱导,则在该菌中表达出了有活性的ＶＨｂ 蛋白。ｐＨＺ１２５２ 在阿维链霉菌中发生了重组缺失,但缺失的ｐＨＺ１２５２ 上仍含有完整的ｖｈｂ 基因及诱导型强启动子,且可在阿维链霉菌中稳定遗传,却不能再转化大肠杆菌。     

大肠杆菌-链霉菌穿梭表达载体pMF的构建及其应用

【目的】构建能定点整合到链霉菌(Streptomyces)染色体上的高效表达载体。【方法】以链霉菌自杀型表达载体pLSB2为基础,通过插入链霉菌噬菌体ΦC31整合酶基因int和attP位点(Phage attachment site),构建了能在大肠杆菌和链霉菌之间进行接合转移并定点整合到链霉菌染色体上的表达载体pMF。将pMF转化大肠杆菌ET12567(pUZ8002),并分别接合转移天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolorM145)、变铅青链霉菌(Streptomyces lividansTK24)和红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea2338),挑取接合子进行PCR和Southern杂交检测。将来自刺糖多孢菌S08-4的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因(SAM-s)克隆到载体pMF的启动子下游,接合转移到天蓝色链霉菌中。【结果】表明pMF成功整入链霉菌染色体,并且检测到目的蛋白的表达。【结论】构建的pMF载体可作为外源基因定点整合表达的有效工具,为后续的基因功能研究以及链霉菌的遗传改造奠定了基础。     

食用槟榔中霉菌和酵母的测量不确定度评定

近年来槟榔的食用安全引起了社会的广泛关注,槟榔行业对微生物控制的要求也进一步提高,微生物检测的准确性和可靠性越来越受到重视。然而,目前尚无槟榔微生物的分析报道。本研究建立了槟榔中霉菌和酵母定量检测测量不确定度评定的方法。结果表明,霉菌与酵母的扩展不确定度分别为0.342 4和0.286 4,其中,重复检测引入的不确定度远高于其他因素引入的不确定度。此外,本研究还发现,霉菌和酵母的不确定度评定应该分开进行。     

霉菌毒索引起肠毒性的机制

霉菌毒素是主要由曲霉菌、青霉菌或镰刀菌类等真菌产生的次级代谢产物,它们是人类和动物食物中最常见的天然食品污染物.摄入受霉菌毒素污染的食物会引起以急性死亡、生殖紊乱、生长障碍和对传染病的抵抗力降低等为特点的毒理学改变.此外,霉菌毒素还具有致畸、致癌和致突变的风险.肠道是霉菌毒素摄入机体的首要屏障,与其他器官相比,霉菌毒素...     

番茄灰霉病生防链霉菌筛选及鉴定

【背景】由灰葡萄孢侵染所致的番茄灰霉病是一类重要的真菌病害,生物防治具有环境友好、病原菌不易产生抗药性等特点,是果蔬灰霉病绿色防控的有效措施。【目的】筛选对番茄灰霉病具有防病作用且能促进番茄种子发芽的广谱拮抗性链霉菌,并明确该菌株种级分类地位。【方法】采用琼脂块法筛选拮抗番茄灰霉病菌的链霉菌菌株,采用对峙培养法和生长速率法检测菌株T22抑菌谱,通过产胞外酶活性检测、离体叶片防效和种子发芽试验明确该菌株的防病促生相关特性,根据形态学特征、生理生化特性和分子生物学方法对该菌株进行种类鉴定。【结果】从分离的56株放线菌中筛选到14株对番茄灰霉病菌具有拮抗效果的放线菌菌株,其中链霉菌T22对番茄灰霉病菌抑制作用最强,且具有较广抑菌谱,同时菌株T22具有产生纤维素酶和几丁质酶的能力。菌株T22无菌发酵滤液对番茄灰霉病菌、桃褐腐病菌、黄瓜枯萎病菌抑菌率分别为84.6%、81.5%和79.1%;其无菌发酵滤液原液对番茄灰霉病离体防效为55.1%;100倍稀释液处理番茄种子,胚轴、胚根和种子活力指数分别增加15.1%、29.7%和43.9%。根据形态学特征、生理生化特性和多基因聚类分析将链霉菌T22鉴定为白黑链霉菌(Streptomycesalboniger)。【结论】白黑链霉菌T22具有较强的抗真菌、产胞外酶、防病和促生活性,在番茄灰霉病生物防治中具有较好的开发应用潜力。