磷脂酰肌醇3-激酶对心脏的调节

磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatklylinositol 3-kinase,P13K）是体内很多生理过程中起关键作用的信号分子,P13K介导的信号转导通路调节细胞的增生、分化、凋亡等活动。以往研究较多的是P13K与肿瘤发生发展的关系,最近很多研究发现P13K介导的信号转导通路对心脏具有重要的调节功能。本文就近年来关于P13K的结构和功能以及P13K对心脏的调节的研究作一综述。     

羽衣甘蓝S_(13-b)位点受体激酶基因的克隆及激酶结构域的原核表达

目的:分离羽衣甘蓝S13-b位点受体激酶(SRK13-b)基因并进行序列及结构域分析,构建SRK13-b结构域的原核表达载体并进行重组蛋白质的原核表达和纯化。方法:提取羽衣甘蓝S13-bS13-b自交不亲和系花期柱头的RNA,用RT-PCR法分离SRK13-b基因;将编码SRK13-b激酶结构域的序列插入大肠杆菌表达载体pET-14b中,构建原核表达质粒pET-SRK13-bCT,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS菌株,经0.1mmol/LIPTG诱导,用Ni-NTA亲和层析柱对SRK13-b激酶结构域蛋白进行纯化。结果:分离获得羽衣甘蓝SRK13-b基因的长度为2571bp,编码856个氨基酸,GenBank收录号为EU180597;对SRK13-b激酶结构域蛋白进行诱导表达及纯化,SDS-PAGE显示相对分子质量约43×103的蛋白质特异表达,对表达产物进行分离纯化,获得了SRK13-b激酶结构域的融合蛋白。结论:羽衣甘蓝SRK13-b基因的克隆及激酶结构域的原核表达,为研究SRK的功能及自交不亲和性奠定了基础。     

名刊封面

混乱的十字路口 随着病理学研究的不断深入，现在人们已经明确原癌基因的异常突变是癌症发生的主要原因。美国多家单位的科研人员以磷脂酰肌醇-3激酶（P13K）为突破点，在癌症机理研究方面获得了一些进展。P13K是一种在细胞正常生殖生长过程中起广泛调节作用的蛋白，其活性同时受到p110a和p85a基因的调节。     

名刊封面

混乱的十字路口 随着病理学研究的不断深入,现在人们已经明确原癌基因的异常突变是癌症发生的主要原因。美国多家单位的科研人员以磷脂酰肌醇-3激酶（P13K）为突破点,在癌症机理研究方面获得了一些进展。P13K是一种在细胞正常生殖生长过程中起广泛调节作用的蛋白,其活性同时受到p110a和p85a基因的调节。     

激酶调控PKB／Akt活性的机制

PKB／Akt是胞内信号转导通路网络的中心分子。活化的PKB参与多种生物学效应的调控过程,调控PKB活性作用机制的研究一直是信号转导通路领域的难点。新近的研究结果确定了若干新的调控PKB活性的激酶,从多方面解释了PKB活化和作用的分子机制。其中mTORC2、ATM和DNA—PK均通过磷酸化PKB的Ser^473位点以依赖于P13K的方式全面活化PKB;此外,其它以不依赖P13K的方式调控PKB活性的激酶包括,RET／PTC通过磷酸化PKB的Tyr^315位点、JNK通过磷酸化PKB的Thr^450。位点以及CK2通过磷酸化PKB的ser^129位点活化PKB,Brk通过磷酸化PKB的Tyr^474位点以及GRK2均可通过磷酸化PKB抑制其活性。     

马立克氏病病毒I型CVI988/Rispens疫苗株UL13激酶结构域分析及其偏嗜密码子片段在大肠杆菌中的表达

摘要：目的 寻找MDV-1UL13激酶催化中心,并体外表达UL13,以便研究UL13蛋白激酶的功能。方法 用PCR方法从CVI988疫苗株基因组中扩增UL13基因,利用GENEART（www.gcua.de）分析UL13在大肠杆菌中表达时密码子的偏嗜性;通过DNAstar抗原性分析确定UL13的高抗原性片段,进行原核表达,并以切胶免疫方法免疫小鼠制备多抗血清;通过NCBI的protein blast功能及Cn3D 4.1在线软件分析UL13保守结构域。结果 PCR扩增出UL13基因,序列分析结果表明, UL13的259-400aa、431-513aa两个片段抗原性强,且稀有密码子较少;保守结构域分析发现UL13催化中心主要位于152-297氨基酸残基间,且在激酶Subdomain Ⅶ的保守甘氨酸残基被丝氨酸替代,SubdomainⅧ的保守非极性脯氨酸残基被极性半胱氨酸残基替换。利用大肠杆菌表达的UL13第259～400 aa片段免疫小鼠制备出多抗血清能与真核表达产物反应。结论 MDV-1 UL13催化中心主要位于152-297氨基酸残基间,体外表达的基因产物诱导机体产生了抗UL13激酶的特异性抗体。     

P27（Kipl）的研究进展

本文主要综述了细胞周期依赖性激酶特异性抑制蛋白P27(Kipl)的基因、蛋白分子特征,P27(Kipl)蛋白的晶体结构及其和周期素、周期素依赖性激酶的作用方式,从而对细胞周期产生的负调控作用。以及P27(Kip1)蛋白水平的调节、亚细胞定位,P27(Kip1)与凋亡的关系、临床应用价值等。     

法舒地尔对急性心肌梗死大鼠心肌组织中Rho激酶的影响及心肌保护作用(英文)

目的:分析急性心肌梗死(AMI)后大鼠心肌组织Rho激酶表达的变化及心肌细胞凋亡情况,观察法舒地尔对急性心肌梗死(AMI)后大鼠心肌组织Rho激酶表达的影响,探讨法舒地尔对心梗后心肌的保护作用。方法:选取雄性Wistar大鼠,随机分为三组:治疗组、AMI组、假手术组。治疗组及AMI组均结扎左前降支(LAD)制作AMI模型;假手术组只在其LAD下穿线不结扎。治疗组给予法舒地尔5mg/kg,腹腔注射,每日两次;对照组和假手术组给予等量生理盐水。1周后,EvensBlue及NBT双染色确定缺血面积及梗死面积,RT-PCR法测定rho激酶mRNA的表达,DNA断裂的原位末端标记法(T UNEL法)检测缺血区心肌细胞凋亡指数(AI),免疫组化测定凋亡相关蛋白bcl-2及bax表达的变化。结果:1周后,AMI组与假手术组相比,AMI组大鼠Rho激酶mRNA表达增加(P0.01),凋亡相关蛋白bax表达增加(P0.01),bcl-2表达减少(P0.01),AI明显增加(P0.01)。治疗组与AMI组相比,梗死面积显著减小(P0.05),Rho激酶mRNA及bax表达显著减少,AI显著降低,bcl-2表达显著增加(均P0.01)。结论:大鼠AMI后,心肌组织中Rho激酶的表达增加,心肌细胞凋亡指数增加,连续应用法舒地尔1周能有效减少心肌细胞凋亡指数,起到心肌保护的作用。     

PI3-K/AkT信号转导通路与瘢痕形成研究进展

临床上组织损伤2—3天后即可出现肉芽组织,进而由于成纤维细胞和血管内皮细胞的增殖逐渐形成纤维性瘢痕。瘢痕的形成与血管再生和细胞增殖及凋亡密切相关。常见的病理性瘢痕主要是增生性瘢痕和瘢痕疙瘩,他们不仅影响患者关键伤口的活动,而且在美观上给患者带来莫大的痛苦。但是由于对瘢痕的形成原因及发病机制仍不甚清楚,至今临床上实行地以手术为主的对瘢痕的治疗方法仍未取得较满意效果。磷脂酰肌醇3激酶（P13K,phosphoinositide3．Kinase）／Akt（P13．K／Akt）通路广泛存在于人体的多个生理功能中,其在细胞因子作用下介导细胞生存已被证实,目前研究表明,P13-k／Akt信号通路在瘢痕形成中也发挥了重要作用,这可能会为瘢痕的治疗带来新的前景。本文将就近年来关于P13-k／Akt通路在中发挥的作用机制作一综述,并对未来利用此通路彻底治疗瘢痕的可能方式做一展望。     

促红细胞生成素产生肝细胞受体A2(EphA2)SAM结构域对激酶结构域的脂质体结合能力与激酶活性的调控研究

促红细胞生成素产生肝细胞受体(Eph receptor) 是受体酪氨酸激酶(RTK)家族中最大的亚家族,其介导的双向信号传导对细胞的形态、黏附、运动、增殖、生存及分化都有重要的调控作用。EphA2是Eph受体家族中一个被广泛研究的重要亚型,在白内障和乳腺癌等病理发生过程中发挥了重要作用。既往研究发现:EphA2受体的激酶结构域可结合细胞膜,其激酶活性受磷脂膜的调控,但是相邻的SAM结构域对激酶结构域与脂膜的相互作用以及激酶活性的影响尚不清楚。在此项研究中,通过与磷酸酶PTP1B1-301活性片段共表达的方式,表达、纯化了EphA2受体的胞内段激酶-SAM串联结构域,通过比较胞内段激酶-SAM串联结构域与单独激酶结构域的脂质体结合能力,以及测定对应的激酶活性,发现:EphA2受体胞内段的SAM结构域使其激酶结构域与脂质体(4 mg/mL)的结合能力增强约6倍(P＜0.001);磷酸化后的EphA2胞内段激酶-SAM串联结构域结合脂质体(4 mg/mL)的能力比非磷酸化的胞内段激酶-SAM串联结构域提高2.5倍(P＜0.05);而结合脂质体后,激酶结构域的激酶活性也被进一步提高,从而形成正反馈。综上所述,本研究的发现提示:EphA2胞内段的酪氨酸激酶结构域与相邻的SAM结构域可形成一个完整的结构功能单位,其激酶活性和脂质体结合能力与单独的激酶结构域相比都形成了明显的差异,我们的这一发现对进一步理解Eph受体家族其他亚型的激酶结构域的活性调控提供了参考与思路。     

多功能的蛋白:糖原合成酶激酶-3

糖原合成酶激酶-3(GSK-3)是一个多功能的丝氨酸／苏氨酸类激酶,在真核生物中普遍存在。在哺乳动物中包括两个亚型,即GSK-3a和GSK-3β。GSK-3至少在三条细胞通路上有作用：Wnt/wingless,P13-kinase以及Hedgehog信号通路,该酶的作用主要包括调节糖原的合成代谢,参与细胞的分化与增殖等。研究发现,GSK-3在某些疾病,如阿尔茨海默病和非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)中,其活性会异常升高。现已发现了几种针对该酶的抑制剂,如aloisine,paullones和马来酰胺类化合物等。这些抑制剂的确在分子水平特异性地抑制GSK-3的活性,而对其他激酶几乎没有作用。关于这些抑制剂的研究工作也已经在细胞水平和动物模型上开展起来,为开发以GSK-3为靶点的新的治疗药物创造了良好的基础。     

P13K信号通路通过Skp2、p27调节肝癌细胞的增殖

探讨磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）信号通路调节肝癌细胞增殖的机制．用LY294002特异性阻断P13K信号通路后,人肝癌细胞（SMMC-7721）的增殖明显被抑制．RT-PCR及蛋白质印迹结果显示,LY294002增加了p27蛋白的表达,但不影响p27的mRNA表达．在LY294002处理的细胞中转入p27的RNAi质粒以干扰p27蛋白的表达后,肝癌细胞的增殖能力可部分恢复．放线菌酮（Chx）处理实验表明,阻断P13K信号通路使p27蛋白的半衰期延长,稳定性增加．进一步研究发现,LY294002可抑制介导p27蛋白降解的关键分子Skp2的rnRNA表达,还可缩短Skp2蛋白的半衰期,降低Skp2蛋白的稳定性．但在SMMC-7721中分别转染P13K下游重要靶分子Akt的持续激活和失活突变体,却并不影响p27蛋白的表达．这些结果表明,P13K信号通路在转录及翻译后水平调节Skp2的表达而影响p27蛋白的降解,从而调节肝癌细胞的增殖,但Akt并没有参与这种调节．     

3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1激活AGC家族激酶的机制研究进展

3磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(3phosphoinositidedependentproteinkinase1,PDK1PDPK1)是蛋白激酶B(proteinkinaseB,PKBCAKT)的上游激酶,通过与3,4,5三磷酸磷脂酰肌醇[PtdIns(3,4,5)P3]作用激活相邻的PKB分子.同时,PDK1被称为AGC激酶的掌管者(master),能够激活包含PKB在内的一系列的AGC激酶家族成员.PDK1磷酸化这些激酶的保守区域Tloop区,使它们充分激活,从而调节细胞代谢,生长,扩散,生存,抗凋亡等诸多生理过程.本文就PDK1调节AGC激酶的活性,与功能上命名的PDK2的关系,PDK1分子自身的调节,PH结构域对自身活性及AGC激酶活性的影响,PDK1定位以及作为一个新药物靶标等方面做了综述.     

人FGFR1的BacMam系统构建、表达、纯化与鉴定

目前激酶类蛋白的表达大多由昆虫细胞表达系统实现,采用BacMam系统来表达受体型酪氨酸激酶人FGFR1,旨在获得更接近天然结构与功能的重组蛋白.首先,将pDEST20载体的多角体蛋白启动子替换成CMV enhancer启动子,获得BacMam表达载体pDEST20-CMVe.通过Gateway系统,将FGFR1具有酪氨酸激酶活性的区域克隆至改造后的载体中.利用昆虫细胞Sf9产生病毒,P2代病毒转导哺乳动物细胞FreeStyle 293-F进行表达,经亲和纯化后,成功获得了75 kD的融合蛋白.通过磷酸化底物的反应检测此FGFR1激酶的活性.结果表明,BacMam系统是一个良好的表达重组激酶FGFR1的平台,并且所表达的激酶活性高于昆虫细胞表达的激酶蛋白.     

高等植物6-磷酸海藻糖信号调控研究进展

6-磷酸海藻糖(T6P)在植物体内广泛分布,对植物的生长发育起着重要的调节作用,其信号途径伴随植物胚胎发育直至衰老的整个过程。T6P是海藻糖的代谢前体物质,其主要通过抑制蔗糖非酵解相关激酶1(SnRK1)的催化活性,进而调控植物生长代谢,故称为T6P/SnRK1信号。在T6P/SnRK1信号调控植物代谢过程中,转录因子b ZIP11、己糖激酶HXK及PIF信号途径也参与到植物T6P/SnRK1信号调控路径。     

胰岛素保护缺血/再灌注心脏:PI3-K/Akt和JNKs信号通路间的交互作用

我们前期研究表明胰岛素可激活细胞内信号转导机制如磷脂酰肌醇3．激酶．蛋白激酶B．内皮型一氧化氮合酶．一氧化氮（P13-K-Akt-eNOS-NO）信号通路,减轻心肌缺血／再灌注（ischemia／reperfusion,I／R）损伤,改善缺血后心肌功能恢复。然而c-Jun氨基末端激酶（c-JunNH2-terminal kinase,JNK）信号通路在胰岛素保护I／R心肌中的作用尚不清楚,本研究旨在探讨JNK信号通路在胰岛素保护I／R心肌中的作用及其与P13．K／Akt信号通路间的相互关系。离体Sprague-Dawley大鼠心脏缺血30min后施行2h或4h的再灌注,缺血前用LY294002（15mmol／L）和SP600125（10mmol／L）灌注15min,分别阻断P13．K／Akt和磷酸化JNK（phosphorylated．JNK,p-JNK）活化,观测心脏功能、心肌梗死、细胞凋亡和蛋白磷酸化水平。与对照组相比,胰岛素再灌注2h后,心率、左心室发展压和左心室收缩／舒张最大速率均明显增加,梗死面积减少约16．1％[（28．9±2．0）％vs（45．0±4．0）％,n=6,P〈O．01],细胞凋亡指数从（27．6±113）％减少到（16．0±0．7）％（n=6,P〈O．01）,Akt的活性增加1．7倍（n=6,P〈0．05）,同时JNK活性增加1．5倍铆=6,P〈O．05）。用LY294002处理后,胰岛素对I／R心肌的保护作用消失;而用SP600125处理可增强胰岛素的保护作用,且可部分逆转LY294002的抑制作用。进一步观察发现SP600125减弱了Akt的磷酸化m=6,P〈0．05）。上述结果表明,在I／R心肌中,胰岛素可同时激活P13．K／Akt及JNK信号通路,且通过后者进一步增加Akt活化,从而减轻I／R损伤,改善心肌功能。这种P13．K／Akt与JNK信号通路交互机制对胰岛素保护I／R心肌有重要意义。     

疫苗

母30494猪瘟病毒作为运送免疫原的载体[会,英]/Foley,P.L.…,Atin.N.Y.Acad.Sci.-1991,646.一220,~222["译自DBA,1992,11(13),92-07365"] 建立了一种标准化方法,用于在朐苷激酶(TK)-阴性细胞系中增殖和定量猪痘病毒(SV)。试验SV Kasza株在4种哺乳类TK-阴性细胞系上传代。人骨肉     

P13K／Akt及其靶蛋白FOXO1与非酒精性脂肪性肝病

FOXO转录因子是Forkhead蛋白大家族的一个亚群,在人类的4个同源基因中包括Fox01、Fox02、Fox03a和Fox04。FoxO蛋白质通过丝氨酸或苏氨酸以及赖氨酸残基的磷酸化和乙酰化等后转录修饰后而发挥作用。其中Foxol是含有高度保守DNA结合位点的核转录蛋白,其主要功能是磷脂酰肌醇3。激酶（P13K）／蛋白激酶B（Ala）的底物,在胰岛素信号转导中起负性调节作用,Foxol通过介导胰岛素依赖性微粒体甘油三酯转运蛋白（MTP）的表达,影响肝脏装配和分泌极低密度脂蛋白（VLDL）,维持脂代谢稳定。在胰岛素抵抗和脂肪肝状态下,肝细胞核内Foxol表达明显升高,引起高甘油三酯血症和脂肪肝。有针对性的干预P13姒啵t及Foxol的表达,可能从分子机制上为非酒精性脂肪肝的防治提供广阔前景。     

激酶组学在原核生物中的研究进展

激酶组学是近年研究较多的一类组学。激酶的磷酸化在调控细胞代谢和生理进程等方面起到重要作用,但原核生物激酶组学研究存在研究时间比真核生物晚、组氨酸激酶磷酸化无法检测等问题。通常通过对真核生物中激酶的研究,可以类比到原核生物中的激酶研究。对丝氨酸/苏氨酸激酶、酪氨酸激酶、组氨酸激酶在原核生物中的研究进展进行分析,并对激酶磷酸化的研究方法进行总结,阐明了激酶在原核生物中的重要调控作用。     

假激酶结构域的结构与功能

近年来在多种蛋白质结构中发现一个特定的结构域,假激酶结构域。假激酶结构域由于缺少一些对于激酶催化活性绝对必要的氨基酸残基而不具有激酶催化活性。以往同源建模的结果表明,一些假激酶结构域与激酶催化结构域的结构相似。已有的研究表明,蛋白质假激酶结构域一般可通过与激酶催化结构域相互作用而调节激酶的活性。