巴西固氮螺菌 Yu62 draTG 基因启动子区域的核苷酸序列及其功能分析

对巴西固氮螺菌ｄｒａＴＧ上游区域进行了全序列分析,结果表明该区域除了编码部分ｎｉｆＨ基因外（ｎｉｆＨ与ｄｒａＴＧ转录方向相反）,不编码任何其它已知的基因。但在该区域发现了一些可能的调控序列,它们包括上游激活序列（ＵＡＳ）、下游启动子组份（ＤＰＥ）和富Ａ＋Ｔ区。这说明：ｎｉｆＨ与ｄｒａＴ间的区域可能主要起调控功能而非编码功能;ｄｒａ操纵元的启动子很可能是ＲｐｏＮ－依赖型。用ｐＡＦ３００做载体,构建了     

花椰菜花叶病毒(CaMV)的基因表达调控

花椰菜花叶病毒（CaMV）是一种具有重要经济价值和生物学意义的植物双链DNA病毒,它有7个开放阅读框（ORF）,其中6个呆各自编码一种蛋白产物。35S启动子区域含有3个转录因子专一的结合位点;RNA多腺苷化位点具有AAUAAA特征序列,它和其上游序列对35SRNA的加工和翻译有影响作用;下游ORFI在转录激活因子存在时可被翻译。由此表明,CaMV的表达调控表现在不同调控机制工作的基础之上。     

AB5肠毒素A、B亚基比例表达调控机理的研究

霍乱毒素（ＣＴ）及大肠杆菌势不稳定甩的毒素（ＬＴ）的Ｂ亚基基因的表达水平是Ａ亚基的５￣７倍,研究发现Ａ基因内部存在着１个８０ｂｐ长的翻译控区,含有３个翻译起始序列（ＴＩＲ）,其第２个翻译起始序列的终止密码与第３个翻译起始序列的起始序列的起始密码重叠,因而形成翻译偶联,继续翻译至Ａ基因的终止密码。将ＴＩＲ３的超始密码ＡＴＧ突变为ＡＴＣ后ＴＩＲ２及ＴＩＲ３失去功能,这时下游报告基因（类似于ｃｔｘＡ、Ｂ     

斜纹夜核多角体病毒DNA XbaⅠ4.0kb片段锌指蛋白基因及重复序列分析

测定了斜纹夜核多角体病毒（Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus,SpltNPV)中山大学分离株基因DNA XbaI4.0片段全序列,该片段包括一个锌指蛋白基因及三个区域的DNA重复序列（SR1、SR2、SR3）。该锌指蛋白基因读码框为2196个核苷酸,编码731个氨基的蛋白质,分子量为83．09KD,该蛋白的等电点为4．61,在其5‘非编码区内有一个杆状病毒早期启动子基序GAGT5及一个TATA盒,在其终止密码的下游有5个真核生物转录mRNA时poly(A)加尾信号AATAAA。在223－241氨基酸残基之间有一个锌指蛋白基序,这一基序属于锌指蛋白基序中的C3HC4类,即环指（Ring finger)类基序,在323－340氨基酸残基区域为一个核定位信号,该蛋白可能为一个高度折叠的蛋白质。在该片段中存在三个DNA重复序列区域（SAR1、SR2、SR3）,其中SR1与SR3区或存在更大量的重复序列,SR1区域其中的一个重复序列长达41bp,SR1,SR3重复序列区域可能作为该病毒转录的增强子,或者作为DNA复制的起始点。     

巴西固氮螺菌 Yu62 draTG 基因启动子区域的核苷酸序列及其功能分析

对巴西固氮螺菌ｄｒａＴＧ上游区域进行了全序列分析,结果表明该区域除了编码部分ｎｉｆＨ基因外（ｎｉｆＨ与ｄｒａＴＧ转录方向相反）,不编码任何其它已知的基因。但在该区域发现了一些可能的调控序列,它们包括上游激活序列（ＵＡＳ）、下游启动子组份（ＤＰＥ）和富Ａ＋Ｔ区。这说明：ｎｉｆＨ与ｄｒａＴ间的区域可能主要起调控功能而非编码功能;ｄｒａ操纵元（ｏｐｅｒｏｎ）的启动子很可能是ＲｐｏＮ－依赖型。用ｐＡＦ３００做载体,构建了ｄｒａＴ∷ｃａｍ转录融合质粒ｐＡＴ１,并通过检测Ｃｍｒ以检测ｄｒａＴ在大肠杆菌和巴西固氮螺菌中的表达,结果表明ｄｒａＴ在ＬＤ丰富培养基上,好氧条件下,只在巴西固氮螺菌中才表达。这说明,ｄｒａＴ的转录需要某种大肠杆菌中没有的因子,同时也表明ｄｒａＴＧ上游区域有启动子功能。利用启动子探针质粒载体ｐＣＢ１８２,构建了ｄｒａＴ∷ｌａｃＺ转录融合质粒ｐＣＴ１。在大肠杆菌中测定肺炎克氏杆菌ＮｉｆＡ对ｄｒａＴ∷ｌａｃＺ的转录激活作用。结果表明ｎｉｆＡ并不参与ｄｒａＴ的转录调控。     

古菌信使RNA 5′和3′非编码区特性研究

利用x^2分析方法,对6种古菌起始密码子上游和终止密码子下游各50位非编码区进行了分析。结果表明,Methanopyrus kandleri和Aeropyrum pernix中存在一个与大肠杆菌SD序列极为相似的高保守区（φ区）。但φ区的核苷酸并不能和其16S rRNA 3′端序列的反SD序列很好的配对;Pyrobaculum aerophilum缺乏φ区,但在其起始密码子上游20～30核苷酸处却存在另一个高度保守的区域,该区域在大肠杆菌和酵母中均缺乏;而其它3种古菌却同时存在这2个区域。6种古菌在终止密码子下游第一位的核苷酸非常保守,存在四核苷酸终止信号;在终止密码子后约20个核苷酸范围内保守性相对较高,其中某些核苷酸在翻译终止过程中可能发挥调控作用。     

采用定位基因缺失突变技术在大肠杆菌中高效表达肿瘤坏死因子

肿瘤坏死因子α(TNF)为157个氨基酸组成的细胞因子,在克隆的全良cDNA的5’端有480bp的非编码区包括76个氨基酸信号肽编码区。本文采用寡核苷酸指导下的定位基因缺失突变方法,删除了这一非编码区及信号肽序列,并在成熟TNF分子第一个氨基酸密码前插入一个翻译起始密码(ATG),形成一个限制酶NcoI的识别位点ccATGG。然后取出含有成熟TNF全基因的Nc0I—Pst I片段,插入到原核表达载体pBv220中,获得了肿瘤坏死因子的高效表达菌株。活性检测结果表明,肿瘤坏死因子的表达量可达3．42×10。Μ／L菌液。sDs－PAGE电泳凝胶扫描结果显示,肿瘤坏死因子在大肠杆菌的表达量可占细菌可溶性总蛋白量的22．8％。抗呻瘤坏死因子单克隆抗体可以中和大肠杆菌表达的肿瘤坏死因子对L929细胞的细胞毒性。sD和ATG间插入31个核苷酸可使TNF表达量降低约10倍。     

微小RNA正调控基因表达的分子机制

microRNAs（miRNAs）是近年来发现的普遍存在于动植物体内的一类非编码RNA,传统观点认为,它们通过其种子序列定位于靶mRNA的3′非编码区,并发挥抑制靶mRNA翻译的作用.最新的研究揭示少数miRNAs也可以活化翻译,且这些现象的发生均与miRNA和翻译调控元件的相互作用有关.这些发现进一步扩展了对微小RNA功能的认识领域.     

非编码RNA与X脆性综合征

X脆性综合征（fragile X syndrome,FXS）是由X脆性智力低下1（FMR1）基因5＇端非翻译区CGG重复序列的异常扩增,导致X脆性智力低下蛋白（FMRP）缺失引起的.非编码RNA是除编码蛋白质的mRNAs以外的其他所有RNA分子,已被发现在中枢神经系统中具有重要的作用,如微RNA与BC1/BC200 RNA参与了X脆性智力低下蛋白的翻译抑制.认识非编码RNA与X脆性综合征的关系不但能加深对X脆性综合征的分子机制的理解,而且有助于揭示学习与记忆的奥秘.     

花椰菜花叶病毒（CaMV）的表因表达调控

花椰菜花叶病毒是一种具有重要经济价值和生物学意义的植物双链ＤＮＡ病毒,它有７个开放阅读框（ＯＲＦ）,其中６个可各自编码一种蛋白产物。３５Ｓ启动子区域含有３个转录因子专一的结合位点;ＲＮＡ多腺苷化位点具有ＡＡＵＡＡＡ特征序列,它和其上游序列对３５Ｓ ＲＮＡ的加工和翻译有影响作用,下游ＯＲＦ Ｉ在转录激活因子存在时可被翻译。由此表明,ＣａＭＶ的表达调控表现在不同调控机制互作的基础之上。     

茶尺蠖小RNA病毒5'端非编码区的克隆和测序及与哺乳动物小RNA病毒的比较分析

用Trizol从纯化的茶尺蠖Ectropis oblique小RNA病毒（EoPV）中提取病毒基因组RNA,逆转录后加poly(dT),然后进行两步PCR扩增基因组5′端。克隆测序后,对其5′端非编码区的核苷酸序列进行分析,发现具有哺乳动物小RNA病毒的5′端非编码区的一些特征：A/T含量丰富、起始密码子上游AUG和小顺反子多。利用mfold预测了EoPV 5′端非编码区的二级结构,存在4个茎环结构,有哺乳动物内部核糖体进入位点（IRES）的保守区域,即含保守基序GNRA的茎环A和A/C丰富的环B及多聚嘧啶区域。据此推测EoPV基因组翻译采用IRES起始机制。     

大肠杆菌表达质粒pSM43及pSM53的构建

利用已成功高表达ｅｒａ基因的质粒ｐＣＥ３１翻译起始码上游的序列,去构建大肠杆菌新的外源基因表达载体。先合成特定序列的单链脱氧寡核苷酸,以改进的实验程序插入ｐＪＬ６,其后再加上限制酶多克隆位点。所构建的ｐＳＭ４３和ｐＳＭ５３分别适合於不带翻译起始码（ＡＴＧ）和带起始码的基因插入、表达非融合目的蛋白质之用。并已成功用於人肿瘤坏死因子、人骨形成蛋白、ＨＩＶ蛋白酶、Ｄｕｃｈｅｎｎｅ肌营养不良等ｃＤＮＡ基因的高表达。     

一种双顺反子表达载体的构建及应用的研究

将表达载体pEC34中的一段寡核苷酸序列,其中包括翻译增强子序列、SD序列、终止码、起始码及两端的限制性内切酶位点,插入GST基因后,构建成双顺反子的表达载体．利用此载体表达了非融合的人骨形成蛋白2A(hBMP2A)和人骨形成蛋白3(hBMP3)C端肽段,将第一顺反子基因（GST基因）切小到原来的1／3时,则位于下游的第二顺反子基因编码的蛋白质在大肠杆菌中的表达量增加一倍。     

二色补血草OEE2基因的克隆和表达

从二色补血草中分离出一条含有完整开放读码框（ORF）序列的OEE2基因。该基因全长994bp,其中5’非翻译区27bp,3’非翻译区160bp,ORF全长807bp,共编码264个氨基酸,编码蛋白的分子量为28．2kDa,理论上的等电点为7．66。BlastP分析表叽二色补血草OEE2与马铃薯OEE2序列同源性最高,与喇叭水仙OEE2序列同源性最低,从9个物种的氨基酸多序列比对中可以看出,OEE2的氨基酸序列保守性较高。实时定量RT．PCR方法检测该基因对低温、NaCl和聚乙二醇（PEG）胁迫的基因表达模式的结果表明,PEG和低温能诱导OEE2基因在二色补血草叶中表达,这两种处理的OEE2基因表达量于胁迫48h后都达到高峰,而在NaCl胁迫下OEE2在二色补血草根和叶中表达都受抑制。     

大肠杆菌表达质粒pSM43及pSM53的构建

利用已成功高表达ｅｒａ基因的质粒ｐＣＥ３１翻译起始码上游的序列,去构建大肠杆菌新的外源基因表达载体。先合成特定序列的单链脱氧寡核苷酸,以改进的实验程序插入ｐＪＬ６,其后再加上限制酶多克隆位点。所构建的ｐＳＭ４３和ｐＳＭ５３分别适合於不带翻译起码（ＡＴＧ）和带起始码的基因插入、表达非融合目的蛋白质之用。并已成功用於人肿瘤坏死因子、人骨形成蛋白、ＨＩＶ蛋白酶、Ｄｕｃｈｅｎｎｅ肌营养不良等ｃＤＮＡ基因的     

球孢白僵菌热休克蛋白基因Bbhsp70的cDNA及上游序列克隆与分析

运用SMART RACE RT-PCR技术与DNA步移技术,首次从球孢白僵菌中克隆出完整的热休克蛋白基因Bbhsp70编码区序列及上游序列。该基因cDNA全长2405bp,5′端非翻译区171bp,3′端非翻译区263bp,开放阅读框(ORF)1971bp,编码656个氨基酸。成熟蛋白理论分子量为71.3kDa,理论等电点为4.92。上游序列长度3559bp,其中有305bp序列与cDNA序列重叠。分析表明,上游序列中没有明显的TATA-盒和CAAT-盒,但含有CCAAT-bindingfactor、GC-box等重要的转录因子结合位点,以及热激应答元件(HSE)和GATA元件等启动子顺式调控元件。     

通过新基因计算机识别与实验确认对NCBI人类基因数据库一些模式参考序列错误的分析与纠正

采用生物信息学分析与实验确认相结合的技术路线,通过所识别的基因在非冗余数据库比对发现了网上公布的计算机注释人类基因组编码序列存在各种类型的多处错误,包括cDNA水平的一个或一段碱基插入、缺失或突变,或是这些错误的不同排列组合,其中以错误插入为多,往往导致编码氨基酸的移码突变。最先举证了NCBIGENOME Annotation Project预测人类新基因的下列错误类型：(1)开放读码框架(0RF)中错误插入一个碱基造成编码氨基酸移码;(2)错误拼接;(3)开放读框中错误插入一个或一段碱基造成该读框提前终止。只编码N-端氨基酸的cDNA序列而不完整;(4)只有编码c一端氨基酸序列的cDNA而不完整;(5)只是正确基因0RF中间的一段编码蛋白cDNA序列而不完整,缺N-端与C-端氨基酸序列,并且将不完整蛋白氨基酸序列的第一个非起始码氨基酸错误地预测为起始码氨基酸,如将L错误地预测为M;(6)开放读框中错误插入一个或一段碱基造成前面出现不该有的终止码,因而编码蛋白缺开头部分氨基酸;(7)可能将污染基因组序列当作完整基因cDNA序列对待而预测出所谓单一外显子基因。即便真是基因,也只是较长单一外显子mRNA中有一小0RF,而0RF起始码上游同一相位确实存在终止码,无其他特点符合基因条件;(8)所预测基因只有0RF,而0RF两端没有任何EST证据,可据此0RF拼接出受EST和人类基因组双重支持的完整基因cDNA(开放读框上游同一相位有终止码),预示所预测0RF参考序列可能不正确;(9)有EST实验证据支持存在基因的人类基因组序列范围内又被预测出一条相似但更小的蛋白编码基因,因而新预测基因有可能是错误的。     

水稻OsNRT1-d启动子的分离和功能分析

采用PCR技术,从水稻基因组中分离到OsNRT1-d读码框上游2 019 bp序列.序列分析表明:在起始密码ATG上游-189 bp和-127 bp处分别存在CAAT-box和TATA-box,具有典型的启动子结构.推测的转录起始位点CAC位于起始密码ATG上游-93 bp处.将OsNRT1-d启动子5′-端系列缺失后,分别与GUS报告基因融合,获得的NRT2019∷GUS、NRT1196∷GUS 和NRT719∷GUS转基因载体.农杆菌介导转化水稻,获得的转基因水稻均能启动下游GUS报告基因在水稻的根、叶、花颖和种子中表达;将转基因水稻幼苗放在滤纸上紧急干旱处理和用15% PEG6000进行模拟干旱处理,GUS基因的表达量明显升高,且干旱应答元件在-719 bp～-1 bp的范围内;GUS活性分析表明:OsNRT1-d启动子对ABA、NaCl、(NH4)2SO4、KNO3和Gln等信号没有应答反应.     

北京地区G1—G4型人轮状病毒地方株VP7编码基因的序列分析

本文报告了北京地区流行的４个轮状病毒地方株（Ｇ１－Ｇ４）ＶＰ７编码基因的核苷酸序列。４个地方株的该基因核苷酸全长均为１０６２ｂｐ,读码框架在已往的研究一致。地方株和相同血清型的标准株之间ＶＰ７氨基酸序列具有高度同源性（９２－９４％）,而不同血清型间则是较大（６９－８０％）。不同血清型间氨基酸序列的变异主要存在于高变区内,高变区以外的区域在不同血清型轮状病毒间保守。这一序列分析结果进一步从分子水平分     

靠近5′端帽子的上游AUG不影响t-PA mRNA的翻译

大多数真核生物mRNA的翻译起始都符合Kozak提出的扫描学说,即40s小亚基携带相应的起始因子进入mRNA的5′末端,沿mRNA线性滑动,至第一个AUG起始密码处与60s大亚基结合,形成第一个肽键,然后进入肽链延伸阶段。本课题组所构建的重组质粒pMM 5065含人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)cDNA。序列分析证明,该质粒中t-PA起始密码子ATG的5′端序列为:AAGCTTGCATGCCTGCAGGTC ATG GAT……,可见转录后t-PA mRNA起妈密码子AUG的5′端还有一个AUG三联体(即上游AUG),形成一个较长的与t-PA框架不同的阅读框