灯盏花chi的克隆及其生物信息学分析

查尔酮异构酶(CHI)是调控黄酮生物合成的关键酶,分离和克隆这一酶的功能基因,对利用转基因技术进行灯盏花黄酮生物合成的调控具有重要意义。本研究采用RT-PCR和RACE技术,获得了chi cDNA全序列,GenBank登录号为GU208823.1,序列全长996 bp,开放阅读框为594 bp,编码197个氨基酸,3-Race有一个多聚腺苷酸加尾信号。应用软件预测该基因编码蛋白分子量约为21.6 kD,理论等电点为4.78。该基因编码的蛋白无跨膜结构域,其二级结构的主要构件为α-螺旋和随机卷曲。对其三级结构进行了建模,表明其结构与苜蓿chi的三级结构相似。同时根据灯盏花chi N端序列变化的特征,提出了灯盏乙素的合成可能与chi在细胞亚结构的定位及其与合成代谢相关酶形成复合酶的特异性有关。研究为利用基因工程定向改变灯盏花黄酮代谢产物奠定了基础。     

慈竹C3H基因克隆及其生物信息学分析

香豆酸-3-羟化酶(C3H)是调控植物木质素生物合成的关键酶,本文以慈竹为材料,利用RT-PCR技术克隆慈竹C3H基因,并对其进行生物信息学分析,为通过基因工程手段降低工业用竹木质素含量奠定基础。结果表明,该cDNA序列全长为1 581 bp,编码区为1 539 bp,编码512个氨基酸,蛋白分子量为58.33KD,等电点为9.09;氨基酸序列和结构分析显示C3H有一个保守区域,即P450结构域。系统进化分析表明,该基因与毛竹和水稻的C3H基因具有很高的同源性。慈竹与毛竹和水稻C3H基因编码蛋白为亲水性蛋白,这三种编码蛋白很可能定位在内质网(膜)上,其编码蛋白的二级结构及三级结构都含有丰富的α-螺旋和无规卷曲,β-转角和延伸链的含量较少,都含有2个相对保守的无序化区域。该基因已在GenBank上注册,基因序列登录号为JF693629,可能与慈竹木质素的生物合成有关。     

药用植物灯盏花rbcL基因的克隆、生物信息学及适应性进化分析(英文)

目的:克隆药用植物灯盏花叶绿体rbcL基因,该基因编码二磷酸核酮糖羧化酶大亚基,并对该基因序列、蛋白质特性和适应性进化进行分析。方法:根据相关文献设计引物,利用PCR方法扩增并克隆完整rbcL基因序列,对rbcL蛋白进行结构建模和评价。结果:灯盏花rbcL基因长度为1 458bp,编码485氨基酸(GenBank登录号为KF482865)。通过与GenBank库中Erigeron tenuis氨基酸序列比较相似性超过95%。RbcL蛋白二级结构含有21个α-helices、7个β-sheets和一些卷曲。通过适应性进化分析在rbcL蛋白上有3个氨基酸正选择位点(76 E、131 Q和422 E)。结论:灯盏花rbcL基因的完整克隆有助于更深的研究灯盏花对特殊生境的适应,rbcL蛋白大亚基正选择位点的空间结构对于维持核酮糖结构具有重要的作用。     

罗汉果色氨酸转氨酶基因SgTAR2的克隆及表达分析

色氨酸转氨酶基因家族,是直接参与植物生长素生物合成途径的关键酶基因。该研究在罗汉果转录组测序的基础上,结合RACE技术克隆罗汉果色氨酸转氨酶基因SgTAR2的全长cDNA序列和DNA序列;并对其进行生物信息学分析和时空表达分析。结果表明:克隆所得SgTAR2的cDNA全长序列2078bp,最长ORF为1332bp,编码443个氨基酸,Gen Bank登录号为KU949381,其编码蛋白具有2个蒜氨酸酶保守结构域和多个5'-PLP结合位点,推测其可能参与催化色氨酸转氨基作用、化学防御作用、生长素生物合成等生物学过程;SgTAR2基因DNA长为4103bp,含有4个内含子和5个外显子,其内含子具有多个高水平转录调控因子和多个与激素、环境等胁迫响应相关的作用元件,暗示SgTAR2基因内含子协同调控罗汉果生长素合成、抗胁迫反应、形态发育等生物学过程。实时荧光定量结果显示,SgTAR2基因在罗汉果各组织器官均有表达,在雌蕊和15d幼果期表达量较高,暗示该基因参与罗汉果果实早期发育。该研究结果表明SgTAR2参与了生长素介导的罗汉果不同生长发育过程,特别对幼果及花的起始发育和器官形态建成等具有重要意义。     

噬菌体Ψ297切除酶(xis)基因的克隆和序列分析

目的：克隆噬菌体ψ297切除酶(xis)基因,并对其进行遗传与变异研究。方法：提取埃希氏大肠杆菌O157：H7菌株EH297染色体DNA,采用步移PCR方法寻找目的基因,并通过克隆、亚克隆、DNA测序等分子生物学方法获得切除酶基因,通过序列分析软件对此基因进行分析。结果：克隆获得噬菌体ψ97编码的切除酶基因(xis)的完整序列,它的长度是255bp,编码了一个84个氨基酸组成的蛋白质(xis),将它们的序列与λ噬菌体的切除酶家族的其它成员进行了比较。其结果是噬菌体ψ297的切除酶基因(xis)与噬菌体VT1-Sakai的切除酶基因(xis)只有4个核苷酸的不同,而Xis蛋白与噬菌体VT1-Sakai的Xis蛋白是一样的,与噬菌体933W的Xis蛋白只有47．2％的相似性。结论：噬菌体ψ297编码的切除酶基因(xis)与λ噬菌体的切除酶基因同源。     

日本蛇根草无色花青素双加氧酶基因的克隆及其序列分析

无色花青素双加氧酶(LDOX)是花青素合成途径末端的一个关键酶,在该酶的催化作用下,能将无色花色素转变为有色花色素。本研究采用RT-PCR方法成功克隆出日本蛇根草LDOX基因的cDNA序列后,并对其进行了生物信息学分析。分析结果显示,日本蛇根草LDOX基因的cDNA全长为1 041 bp,编码346个氨基酸,理论等电点为5.50,预测其蛋白分子量为38.63 k D,LDOX蛋白为不稳定蛋白,不存在信号肽,很可能定位在细胞质中。二级结构分析显示,其无规则卷曲的含量最高,与三级结构预测结果相符合。日本蛇根草LDOX基因的克隆与生物信息学分析对于进一步研究该类酶的结构和功能以及植物花青素的生物合成具有重要意义。     

维药新塔花(Ziziphora bungena)zbHDS基因克隆及组织表达分析

对维药新塔花(Ziziphora bungena)萜类化合物生物合成途径中,关键酶1-羟基-2甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸合成酶HDS基因克隆,进行组织表达特异性分析,为研究新塔花萜类化合物生物合成途径与基因调控提供基础。结合新塔花转录组数据库,根据编码区序列设计引物,通过RT-PCR方法对Z. bungena基因HDS (zbHDS)的编码区cDNA进行克隆,对其进行相关生物信息学分析,通过Real-Time进一步分析其组织表达特异性。RT-PCR扩增了一个长2 465 bp的zbHDS (登录号:MG065856)基因片段,含一个2 229 bp的开放阅读框,编码742个氨基酸。进化树分析结果显示,与丹参(Salvia miltiorrhiza)具有较近的亲缘关系。Real-Time PCR结果显示zbHDS基因在各器官中均有表达,在茎和叶中表达量较高,根和花中表达量相对较低。本研究首次从新塔花中克隆HDS基因并获得其编码区序列,zbHDS基因具有组织表达特异性,为进一步研究新塔花中萜类化合物生物合成途径提供数据支持。     

烟草二脂酰甘油酰基转移酶基因(NtDGAT2)的克隆与功能分析

二脂酰甘油酰基转移酶(diacylglycerol acyltransferase,DGAT2)是植物储存油脂生物合成过程中的关键酶,对种子储存油脂累积具有重要的生理作用。本文采用电子克隆与实验相结合的方法,从烟草种子cDNA中克隆到DGAT2基因的开放阅读框序列,命名为NtDGAT2(GenBank登录号JX843807),其序列长999bp,编码332个氨基酸。多序列比对和进化分析表明该基因编码蛋白与其他植物DGAT2具有较高相似性和典型的DGAT2结构域。利用Real-time PCR定量表达分析显示Nt-DGAT2在烟草种子、花、茎、叶和根里面都有表达,且在发育中的种子和花的发育过程大量表达。酵母互补实验证实该基因编码蛋白具有DGAT酶活性。     

阴沟肠杆菌B8拮抗活性基因‘admA’及上游调控序列的克隆与功能鉴定

为了阐明水稻白叶枯病拮抗菌阴沟肠杆菌B8的作用机理,文章采用转座子标签法和染色体步移技术克隆到突变株B8B中Tn5插入位点周边拮抗活性相关片段,并通过基因敲除验证了获得的拮抗相关片段admA’上游调控序列的功能。以转座子中Kan抗性基因为标签,克隆了B8B菌株中Tn5插入位点左侧2 608 bp序列,经两次染色体步移得到Tn5插入位点右侧的2 354 bp序列。序列拼接后获得B8菌株拮抗相关序列4 611 bp的Bcontig。生物信息学分析显示该序列含有7个ORF,分别对应于3-磷酸甘油醛脱氢酶(GADPH)基因的部分编码区、2个LysR家族转录调控因子、弧菌假设蛋白VSWAT3-20465及成团泛菌(Pantoea agglomerans)andrimid生物合成基因簇的admA、admB和部分admC基因序列。B8B菌株Tn5插入分别位于同源于弧菌假设蛋白的anrPORF及‘admA’基因上游200 bp和894 bp处。通过同源重组技术,借助敲除质粒pMB-BG,获得拮抗活性消失的突变株B-1和B-3。结果表明B8B突变株中Tn5的插入可能影响了anrP蛋白的转录和表达,进而调控拮抗物质编码基因簇的生物合成。B8菌株中拮抗物质相关基因是类似于andrimid生物合成基因簇的基因家族,其上游调控区对该抗生素的生物合成具有重要的作用。     

花生白藜芦醇合酶基因的克隆与生物信息学分析

利用Protparam、iPSORT prediction、ProtScale、SOPMA、Swiss-Modeling和Scan Prosite等生物信息学工具分别对其理化性质、信号肽、疏水性、亲水性、二级结构和三级结构进行分析。以花生粤油45总DNA和总RNA为模板,采用PCR和RT-PCR技术克隆花生白藜芦醇合酶基因的DNA和cDNA序列,并利用SWISS-PROT、DNAMAN等生物信息学工具对其基因和蛋白质序列进行了分析。测序结果显示,该基因的DNA和cDNA序列长度分别为1 498 bp和1 251 bp,cDNA序列具有完整的开放性阅读框,编码389个氨基酸的多肽。该白藜芦醇合酶氨基酸368-378位点上存在芪合酶家族的特征位点GVLFGFGPGLT。同源性分析表明,其碱基序列与已报道的花生白藜芦醇合酶基因的一致性为99%,其氨基酸序列与已报道的花生白藜芦醇合酶氨基酸序列的一致性为100%。     

Separation of scutellarin from crude extracts of Erigeron breviscapus (vant.) Hand. Mazz. by macroporous resins

Scutellarin, a flavone glycoside, popularly used in the treatment of heart disease, has been efficiently separated using macroporous resins from crude extracts of Chinese medicinal plant Erigeron breviscapus (vant.) Hand. Mazz. HPD-800 resin offered the best adsorption and desorption capacity for scutellarin among the eight macroporous resins tested, and its adsorption data at 25 degrees C fit best to the Langmuir isotherm. The dynamic adsorption and desorption experiments have been carried out on a HPD-800 resin packed column to optimize the separation process of scutellarin from the crude extracts of E. breviscapus. After one run treatment with HPD-800 resin, the scutellarin content in the product was increased 15.69-fold from 2.61% to 40.96% with a recovery yield of 95.01%. The preparative separation process via adsorption-desorption method developed in this study provides a new approach for scale-up separation and purification of scutellarin for its wide pharmaceutical use.     

Two-step purification of scutellarin from Erigeron breviscapus (vant.) Hand. Mazz. by high-speed counter-current chromatography

Scutellarin, a flavone glycoside, popularly applied for the treatment of cardiopathy, has been purified in two-step purification by high-speed counter-current chromatography (HSCCC) from Erigeron breviscapus (vant.) Hand. Mazz. (Deng-zhan-hua in Chinese), a well-known traditional Chinese medicinal plant for heart disease. Two solvent systems, n-hexane-ethyl acetate-methanol-acetic acid-water (1:6:1.5:1:4, v/v/v/v/v) and ethyl acetate-n-butanol-acetonitrile-0.1% HCl (5:2:5:10, v/v/v/v) were used for the two-step purification. The purity of the collected fraction of scutellarin was 95.6%. This study supplies a new alternative method for purification of scutellarin.     

大花美人蕉查尔酮异构酶基因的cDNA克隆和序列分析

以高等植物查尔酮异构酶（CHI）基因的保守区域CKFVKFT、KFTAIGV、AVKWKGK及GPFEKFT、IIGKI-IGV设计简并引物和采用逆转录．聚合酶链式反应（RT-PCR）以及温度非对称交互PCR（TAIL．PCR）方法,从大花美人蕉花瓣组织中扩增查尔酮异构酶基因（倒）的全长cDNA（678bp）,编码226个氨基酸,其氨基酸组成与其它已知的高等植物CHI基因具有很高的同源性,与葡萄、草莓、丁香、柑桔、矮牵牛、洋葱及玉米的同源性分别为82％、79％、80％、80％、79％、81％和76％。     

灯盏花素的研究进展

灯盏细辛[Erigeron breviscapine(vant)Hand MaSS]是产于云南等地的一种具有良好抗心脑血管疾病作用的植物。从70年代开始,灯盏花中一系列化学成分被分离鉴定出来。其中,灯盏花素在治疗脑血栓、脑缺血、脑血管后遗症及对抗血小板凝聚等方面有很好的临床疗效,本文对灯盏花素的提取分离、药理、临床应用及灯盏花乙素的全合成等方面的研究进展进行综述。     

植物查耳酮异构酶生物信息学分析

查耳酮异构酶（CHI）是黄酮类化合物合成途径中的关键酶之一。利用生物信息学方法对该酶基因及编码蛋白进行系统的分析,将为深入开展研究打下基础。本文利用NCBI数据库中注册的CHI基因的核酸及氨基酸序列,以葡萄CHI为主,对其组成成分、疏水性／亲水性、翻译后修饰、蛋白质二级及三级结构等进行预测和推断。结果表明：葡萄CHI不具有明显的亲水或疏水区域;二级结构主要由α-螺旋、不规则卷曲和β-折叠组成,β-转角散布于整个肽链中;β3a—β3f连同α1—α7构成了蛋白三级结构的核心;包含CHI结构域;在高级结构、活性位点等方面具有较高的保守性。     

杜梨PbPEAMT的克隆、序列分析及表达特征

采用RT-PCR、cDNA末端快速扩增法和长片段PCR技术,从杜梨幼苗中获得1个磷酸乙醇胺N-甲基转移酶基因（Pb—PEAMT）,运用生物信息学方法分析它的序列特点,并通过跨内含子引物进行半定量RT-PCR研究其在非生物胁迫下的表达情况。结果表明：PbPEA臌因编码区DNA序列长为3320bp,由11个外显子和10个内含子组成,cDNA序列长1479bp,推导的多肽包括2个II型甲基转移酶保守结构域,与蓖麻PEAMT蛋白相似性最高（86％）,亲缘关系最近。PbPEA燃因在杜梨幼苗根和叶中均为诱导型表达,100mmol·L^-1氯化钠、10％（w／v）聚乙二醇、180mmol·L^-1甘露醇或20μmol·L^-1脱落酸处理后PbPEAMT表达水平上升,表明PbPEAMT对盐碱、干旱和渗透胁迫存在表达响应,可能参与ABA介导的逆境信号转导途径。     

Flavonoid components and flower color change in transgenic tobacco plants by suppression of chalcone isomerase gene

A cDNA encoding chalcone isomerase (CHI) was isolated from the petals of Nicotiana tabacum and the effect of its suppression on flavonoid biosynthesis was analyzed in transgenic tobacco plants. CHI-suppression by RNA interference (RNAi) showed reduced pigmentation and change of flavonoid components in flower petals. The plants also accumulated high levels of chalcone in pollen, showing a yellow coloration. Our results first demonstrated that suppression of CHI by genetic transformation is possible in higher plants. This suggests that CHI plays a major part in the cyclization reaction from chalcone to flavanone, and that spontaneous reactions are few, if any, in tobacco plants.     

Cloning of a cDNA encoding the Saussurea medusa chalcone isomerase and its expression in transgenic tobacco.

Chalcone isomerase (CHI; EC 5.5.1.6) is a key enzyme in the flavonoid biosynthesis pathway. We isolated a CHI gene (SmCHI) from a cDNA library derived from Saussurea medusa (Asteraceae) cell cultures. The cDNA and genomic sequences of SmCHI are the same; in other words, this gene is intronless. The coding region of the gene is 699 bp long, and its deduced protein consists of 232 amino acids with a predicted molecular mass of 24 kDa and a pI of 4.7. The deduced amino acid sequence of SmCHI shares 79.3% identity with CHI from Callistephus chinensis, a familial relative to S. medusa; this homology is higher than those with CHI's from any other plant species. A functional bioassay for SmCHI was performed by transforming Nicotiana tabacum plants in the sense or antisense orientation under the regulation of the cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter. Transgenic tobacco plants overexpressing sense SmCHI produced up to fivefold total flavonoids over wild-type tobacco plants, mainly due to an enhanced accumulation of rutin. Transgenic tobacco plants with antisense SmCHI accumulated smaller amounts of flavonoids; this is apparently brought about by suppressed expression of the endogenous CHI gene. CHI activities also positively correlated with the amounts of total flavonoids accumulated in the transgenic plants. It is concluded that overexpression of SmCHI can be used as a useful approach to increase flavonoid production in transgenic plants.