拟南芥干旱胁迫诱导型启动子RD29B驱动AtCKX1基因植物表达载体的构建

从拟南芥基因组中分别克隆AtCKX1基因和RD29B基因5′-侧翼1705bp启动子区域序列,生物信息学表明,AtCKX1含有黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和细胞分裂素的结合位点;RD29B启动子片段中存在ABA响应元件(ABA response element;ABRE)、Myb结合位点、TATA-盒、CAAT-盒等顺式作用元件。分别将AtCKX1和RD29B插入载体pCAMBIA1390,构建了由RD29B驱动的AtCKX1的植物双元表达载体p1390RD29BAtCKX1。     

逆境诱导型启动子rd29A的克隆及植物表达载体的构建

根据文献上发表的逆境诱导型启动子rd29A 序列设计并合成了一对引物, 通过PCR 的方法从拟南芥基因组中扩增到rd29A 的启动子序列。根据GenBank 中已发表的转录因子DREB1A基因的cDNA 序列设计并合成了一对引物, 通过RT-PCR 的方法从低温处理的拟南芥总RNA 中扩增出DREB1A 基因的全长cDNA 片段。以植物表达载体pBch 为基础, 构建了由rd29A 调控的DREB1A 基因的植物表达载体pBDR29A, 为利用DREB1A 基因改良植物抗逆性奠定了物质基础。     

Prd29A及DREB1A的克隆和干旱诱导型植物表达载体的构建与鉴定

从拟南芥中克隆了RD29A基因的启动子(Prd29A)及DREB1M基因的DNA片段,构建Prd29A:DREB1A融合基因,采用合成的接头将该融合基因插入到植物表达载体pBI121中,经鉴定,确认正确.     

启动子RD29A对转雪莲SikCDPK1基因烟草抗逆性的影响

探究逆境诱导启动子RD29A对转雪莲SikCDPK1基因烟草抗逆性的影响,为SikCDPK1基因在植物遭遇低温、干旱时更好发挥作用奠定基础。采用基因重组技术构建RD29A启动子驱动SikCDPK1基因的植物表达载体,通过农杆菌介导法遗传转化烟草,分别观察、测定和比较分析低温、干旱处理后,RD29A::SikCDPK1转基因烟草、35S::SikCDPK1转基因烟草和非转基因烟草的表型、POD活性、SOD活性、叶绿素含量、MDA含量和相对电导率的差异。结果显示,干旱和低温胁迫后,RD29A::SikCDPK1转基因烟草的生长状况优于35S::SikCDPK1转基因烟草,更优于非转基因烟草;同时,RD29A::SikCDPK1转基因烟草的POD活性、SOD活性、叶绿素含量显著高于35S::SikCDPK1转基因烟草,极显著高于非转基因烟草;但MDA含量与相对电导率显著低于35S::SikCDPK1转基因烟草,极显著低于非转基因烟草。表明启动子RD29A可通过减缓叶绿素降解速率、提高抗氧化系统酶活性、减小膜通透性,使转基因烟草表现出更强的干旱、低温耐受性。     

Rd29A启动子驱动AtCDPK1基因转化马铃薯的研究

为获得抗旱性强、生长正常的转基因马铃薯植株,以野生拟南芥生态型(Col-0)为材料,利用PCR和DNA重组技术,克隆了拟南芥Rd29A(responsive to dehydration)基因ATG上游+83bp至-1 441bp共1 524bp的启动子区域,其DNA序列与已知拟南芥Rd29A 5'端启动子序列同源性为100%;构建了Rd29A启动子驱动AtCDPK1基因表达的植物表达载体pCHFRd-CDPK1。以马铃薯品种‘费乌瑞它’的试管微型薯为材料,利用农杆菌介导法,将构建成功的pCHFRd-CDPK1载体转入马铃薯中,经筛选与植株再生,获得抗性再生植株。通过PCR和Southern blot检测显示,Rd29A启动子驱动的AtCDPK1基因已整合在马铃薯的基因组中。利用PEG模拟干旱胁迫后,经RT-PCR分析证实,当用20%的PEG胁迫转基因马铃薯植株时,Rd29A启动子驱动AtCDPK1基因表达的转基因马铃薯各个株系中AtCDPK1基因表达量明显增强,而在无胁迫的条件下,植株中AtCDPK1基因基本不表达;同时发现35S控制AtCDPK1转基因植株在PEG胁迫前后,基因转录未见明显差异。形态学观察还表明,在30%PEG胁迫下,转基因植株能正常生长,其长势优于未转基因的对照,且对照植株略有萎焉。该结果可为进一步利用逆境诱导型启动子驱动抗逆基因在农作物中的表达研究及其遗传改良提供依据。     

拟南芥PR-1基因启动子的克隆与植物表达载体的构建

根据已报道的拟南芥（Arabidopsis thaliana L.）病程相关蛋白基因（PR-1）序列设计引物,通过PCR技术从拟南芥中扩增得到水杨酸诱导表达的PR-1基因启动子片段,序列分析表明,该启动子含910bp核苷酸,与已报道的序列比较,核苷酸的同源性为99．7％：将该启动子构建到植物表达载体pB1121上,获得病程相关蛋白基因（PR-1）启动子驱动的GUS报告基因的植物表达载体pBI-prlp,将其转入根癌农杆菌GV3101,通过农杆菌介导转化拟南芥,获得转基因拟南芥植株,为深入研究寄主-病原物相互作用的分子机理奠定基础。     

结缕草胁迫诱导型启动子Rd29A的克隆及功能鉴定

以结缕草基因组DNA为模板,根据已报道Rd29A启动子序列设计了一对特异引物,在优化的PCR反应条件下扩增出了Rd29A启动子的基因片段,通过序列分析与文献报道的基因序列有41.65％的同源性.在GenBank上的登录号为EU346948.利用GFP基因作为报告基因,构建了用于比较鉴定所克隆启动子活性的pBIG (35S-GFP)和pBIRG (Rd29A-GFP)两个植物表达载体,进而采用基因枪法对洋葱表皮细胞进行遗传转化,检测Rd29A启动子在受体细胞中调控基因表达的活性.结果表明,克隆到的Rd29A启动子活性强于组成型的35S启动子,利用GFP瞬时表达的分析方法有效的筛选到用于进行草坪草抗逆育种的启动子.     

Col生态型拟南芥AP3基因启动子克隆及植物表达载体构建

隶属于MADS-Box基因家族的拟南芥花器官B类特征基因APETALA3 (AP3)在花瓣和雄蕊中特异性地表达;AP3基因编码转录因子,与A类和C类特征基因协同作用控制双子叶植物花瓣和雄蕊的发育.研究表明AP3基因启动子为花特异表达启动子.因此,AP3基因启动子的克隆及功能鉴定对于园林植物与花相关的商业性状的定向改良具有重要作用.本文根据GenBank数据库报道的Ler生态型拟南芥(Arabido-psis thaliana) AP3基因启动子序列(U30729)设计了一对特异性扩增引物,基于PCR技术,用高保真的KOD-plus DNA聚合酶扩增了长度为1 767 bp的Col生态型拟南芥AP3基因启动子,并命名为pAtAP3,其GenBank登录号为FJ619533.Bl2seq在线分析表明pAtAP3与U30729序列的相似性达98%,与Col生态型拟南芥BAC克隆T12E18 (AL132971) 9 264～11 030之间的碱基序列相似性达100%,且该段序列的下游基因编码AP3蛋白(CAB81799),说明克隆序列为Col生态型拟南芥AP3基因的启动子.PLACE在线分析表明pAtAP3具有基本的启动子元件TATA-box和CAAT-box,还包含大量与花特异表达相关的顺式元件CArG1、CArG2、CArG3和anther-box等.本试验进一步构建了植物表达载体pAtAP3::GUS,为该启动子的功能鉴定奠定了基础.     

苦瓜中与AGAMOUS相似基因启动子的克隆和表达载体的构建

McAG2基因是苦瓜中分离得到的与AGAMOUS相似基因,在花器官和果实中特异表达,参与花的第三轮和第四轮器官的形成.文章采用染色体DNA步移技术克隆得到长为1 417 bp的McAG2基因5'上游片段.序列分析显示此片段含有典型的TATA-box、CAAT-box、丰富的激素应答调控元件.为了研究这些调控元件,还构建了McAG2基因5'侧翼缺失和内含子缺失表达载体.     

拟南芥AtNCED2基因启动子区域序列克隆及其活性分析

目的:克隆拟南芥AtNCED2基因启动子区域序列,并分析其组织器官特异性及对外界刺激的响应.方法:通过PCR从拟南芥基因组中克隆AtNCED2基因5'侧翼2295bp启动子区域序列(AtNCED2p),并进行生物信息学分析.构建AtNCED2p驱动GUS的植物双元表达载体pAtNCED2p::GUS,通过根癌农杆菌介导法将其转化野生型拟南芥,检测转基因植侏中GUS表达的组织器官特异性.结果:该启动子序列中存在TATA-box、CAAT-box、根器官特异性元件、ABA响应元件、低温响应元件、昼夜节律响应元件等顺式作用元件.GUS活性主要集中在转基因拟南芥根尖及侧根发生部位.外源ABA处理的转基因植株根中GUS活性为174.8nmol 4-MU min-1 mg-1蛋白,明显高于对照值91.7nmol 4-MU min-1mg-1蛋白.结论:AtNCED2基因可能在根的生长和发育中起作用,且外源ABA处理增强其在根中的表达.     

小鼠Daintain/AIF-1基因启动子的克隆及其荧光素酶报告基因载体的构建

目的：对Daintain/AIF-1（大炎肽/同种异体移植炎症因子-1）基因启动子进行克隆并构建荧光素酶报告基因载体,为进一步研究Daintain/AIF-1的转录调控作用提供了质粒资源。方法：提取单核巨噬细胞系RAW264.7基因组DNA,以其为模板采用PCR方法克隆出Daintain/AIF-1基因5＇端UTR区1.6 kb DNA序列,将该序列同源重组到pGL3-Basic载体上,转化感受态DH5α并酶切鉴定和测序。结果：PCR产物片段与预期结果一致,Daintain/AIF-1基因5＇端UTR区1.6 kb DNA序列连接到pGL3-Basic载体上,构建成pGL3-Basic-Daintain/AIF-1（pGL3-Basic-DT）载体,酶切结果与理论预测值一致,经测序证实无碱基突变。结论：Daintain/AIF-1基因报告基因载体的构建为进一步研究Daintain/AIF-1转录调控作用提供了载体资源。     

小鼠Daintain/AIF-1 基因启动子的克隆及其荧光素酶报告基因 载体的构建

目的:对Daintain/AIF-1(大炎肽/同种异体移植炎症因子-1)基因启动子进行克隆并构建荧光素酶报告基因载体,为进一步研究Daintain/AIF-1的转录调控作用提供了质粒资源。方法:提取单核巨噬细胞系RAW264.7基因组DNA,以其为模板采用PCR方法克隆出Daintain/AIF-1基因5’端UTR区1.6 kb DNA序列,将该序列同源重组到pGL3-Basic载体上,转化感受态DH5α并酶切鉴定和测序。结果:PCR产物片段与预期结果一致,Daintain/AIF-1基因5’端UTR区1.6 kb DNA序列连接到pGL3-Basic载体上,构建成pGL3-Basic-Daintain/AIF-1(pGL3-Basic-DT)载体,酶切结果与理论预测值一致,经测序证实无碱基突变。结论:Daintain/AIF-1基因报告基因载体的构建为进一步研究Daintain/AIF-1转录调控作用提供了载体资源。     

含p27启动子的荧光素酶报告基因的构建和活性测定

目的:克隆p27基因的启动子,插入荧光素酶报告基因载体中,并检测其活性。方法:采用PCR技术从人乳腺癌细胞系MCF-7基因组中扩增出p27启动子,插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,确定所扩增的DNA序列,在293T细胞中检测其活性。结果:测序结果显示扩增的p27启动子序列正确,活性实验表明构建的报告基因具有启动子活性,雌激素受体(ER)α能以剂量依赖的方式升高p27报告基因的转录。结论:克隆了p27启动子,为ERα共调节子的功能研究提供了重要基础。     

含p21启动子的荧光素酶报告基因的构建和活性测定

目的:克隆p21基因的启动子,插入荧光素酶报告基因载体中,并检测其活性。方法:采用PCR技术从人乳腺癌细胞系MCF-7基因组中扩增出p21启动子,插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,确定所扩增的DNA序列,在293T细胞中检测其活性。结果:测序结果表明扩增的p21启动子序列正确,活性实验表明构建的报告基因具有启动子活性,雌激素受体(ER)α能以剂量依赖的方式升高p21报告基因的转录。结论:克隆了p21启动子,为ERα共调节子的功能研究提供了重要基础。     

人p53启动子萤光素酶报告基因的构建及其活性测定

目的：克隆p53基因的启动子,插入萤光素酶报告基因载体,并检测启动子活性。方法：采用PCR技术从人肝癌细胞系HepG2基因组中扩增人p53启动子,插入萤光素酶报告基因载体pGL4．0-empty,将重组质粒转染293T、ZR75-1、HepG2、A549细胞,测定p53启动子的转录活性。结果：构建了p53启动子的萤光素酶报告基因;通过测序及质粒酶切鉴定,所构建的p53启动子正确;活性实验表明,报告基因在多种细胞中显示构建的p53启动子活性,并呈现一定的剂量效应;转录因子USF能以剂量效应方式提高p53报告基因的转录活性。结论：克隆了人p53启动子,为进一步研究调控p53的转录因子奠定了基础。     

血管内皮细胞生长因子启动子突变体萤光素酶报告基因载体的构建

目的：构建含有不同片段血管内皮细胞生长因子（VEGF）基因的启动子的萤光素酶报告基因载体,并定位缺氧诱导因子1a（HIF-1d）结合VEGF启动子的区域。方法：以VEGF全长启动子为模板,PCR扩增VEGF启动子的不同片段,插入萤光素酶报告基因载体pGL4-basic,确定所扩增的DNA序列后,将其与HIF-1a表达载体共转染293T细胞,定位HIF-1a结合VEGF启动子的区域。结果：测序结果表明扩增的不同片段的VEGF启动子序列正确;萤光素酶活性实验表明,-1128～-728bp片段是HIF-1a与VEGF相互作用激活VEGF启动子转录活性的区域。结论：克隆了VEGF启动子5’端缺失突变体报告基因表达载体,为调控VEGF表达的转录因子的筛选及功能研究打下了良好基础。