芜菁花叶病毒（TUMV）核酸cDNA的合成与克隆

从接种芜菁花叶病毒后发病芥菜(Brassica Juneaen)中提取病毒,然后提取其核酸(TuMV-RNA)。以纯化的TuMV-RNA为模板,以Oligo(dT)_(12-18)及小牛胸腺DNA水解物为引物,合成双链cDNA,双链cDNA长度约500—4300bp。将双链cDNA补齐后,钝端连接到pUC19质粒的Smal位点,转化E.coli DH,获得500多个白色克隆。菌落原位杂交及酶切分析表明,重组质粒中的插入片段大多数为芜菁花叶病毒RNA的互补DNA,长度为500—4000bp。     

侵染菠菜的芜菁花叶病毒鉴定

菠菜病毒分离物Ta-1可侵染甘蓝等8科25种植物,但不侵染心叶烟。病汁液和芜菁花叶病毒抗血清呈阳性反应。光学显微镜下观察到受病毒侵染的细胞内有不定形内含体。从超薄切片见到细胞质中有风轮状内含体存在。电镜观察其粒子形态为均一的线状病毒,大小为700—760×10—12.5nm。部分提纯病毒紫外吸收呈典型核蛋白吸收曲线。SDS—PAGE法测得病毒外壳蛋白亚基分子量为35,500。     

抗芜菁花叶病毒转基因甘蓝型油菜的研究

以子叶柄为材料,建立了甘蓝型油菜（ＢｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓＬ．）双低品种的再生体系。通过子叶柄与农杆菌（ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓＬＢＡ４４０４）共培养,将表达载体ｐＢＴｕ中芜菁花叶病毒外壳蛋白（ＴｕＭＶ－ＣＰ）基因以整合方式导入甘蓝型油菜,然后用卡那霉素进行筛选,获得了油菜再生植株。经ＰＣＲ特异性扩增、点杂交和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹分析,证明再生植株基因组ＤＮＡ中整合了ＴｕＭＶ－ＣＰ基因。攻毒实验表明,有ＴｕＭＶ－ＣＰ基因插入的工程油菜对ＴｕＭＶ均有不同程度的抗性。     

芜菁花叶病毒分子生物学研究进展

芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)是马铃薯Y病毒属(Potyvirus)的一个重要成员, 在世界上分布广泛,主要危害十字花科植物。本文对芜菁花叶病毒的分子生物学相关研究,如基因组结构和功能、株系变异与进化、寄主植物抗性以及抗病毒转基因工程等的研究进展作一阐述。     

芜菁花叶病毒(TuMV)特性的研究进展

芜菁花叶病毒(TuMV)是世界范围内广泛分布的重要病毒。从生物学和理化特性、基因组结构、侵染和繁殖、变异及利用转基因技术提高病毒抗性等方面对TuMV的国内外研究现状进行了阐述。     

分泌抗芜菁花叶病毒株系特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及抗体理化性质测定

用经芜菁花叶病毒(TuMV)免疫的BALB／c小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(Sp2／0－Agl4)融合,经3次克隆化培养和ELISA筛选,建立了5类分泌抗TuMV的单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株。其中4类分别对TuMV－CI株系、TuMV—C3株系、TuMV—C4株系和TuMV－c5株系具有特异性反应,第5类对TuMV 5个株系均有反应。以双抗体夹心ELISA和间接ELISA检测,上述McAb同CaMV、CMV、TMV、PVX和PVY等均不产生交叉反应,小鼠腹水McAb的滴度在1：256000--2048000之间,多为1：1024000,比常规多抗血清高400倍左右。对上述杂交瘤细胞系和McAb的生物学特性及理化性质进行了鉴定。用SDS—PAGE、Western—blotting对TuMV外壳蛋白亚基、McAb识别位点进行了分析,并就McAb区分TuMV株系进行了讨。     

芜菁花叶病毒单克隆抗体的制备及检测应用

先以芜菁花叶病毒（TuMV）免疫BAL B/C小鼠,然后取其脾细胞使之与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合,经筛选、克隆,获得4株能稳定传代并分泌抗TuMV单克隆抗体（Mab）的杂交瘤细胞,并以之制备腹水单抗。4株单克隆抗体腹水ELISA效价在10-5～10-6之间,仅对TuMV起特异性反应。Western blot分析表明,4株单抗都能与TuMV 34kD的外壳蛋白亚基起特异反应。利用TuMV的多抗兔血清和单抗腹水建立了三抗体夹心ELISA检测TuMV的方法,检测病叶的灵敏度为1∶5120倍,检测提纯TuMV病毒绝对量为21.9 ng。利用三抗体夹心ELISA测定出7种作物上有TuMV侵染。      

不同抗性的榨菜在芜菁花叶病毒感染后细胞超微结构的研究

超薄切片观察表明,在三种感染芜菁花叶病毒的榨菜叶肉细胞内均发现有各种形状的内含体和病毒粒子的存在。内含体形状有风轮状、束状、管状、环状和板状聚集体,且不同抗性的榨菜品种细胞内所含的内含体数量、种类及所占的比例亦不同,抗性较弱的９０－１４９榨菜品种叶肉细胞内内含体数量较多,以管状及环状内含体所占比例为多,束状及风轮状内含体所占比例较少;抗性较强的９０－１３９榨菜品种叶肉细胞内内含体数量较少,且以束状及风轮状内含体所占比例较多,环状及管状内含体所占比例较少。而抗性中等的９０－１４６榨菜品种叶肉细胞内内含体数量及所占比例介于上述两者之间。病毒粒子也以易感病的９０－１４９榨菜叶肉细胞内含量最多,均以束状或拟晶格状存在。此外感病初期细胞内线粒体及粗面内质网数量有不同程度的增多,且以易感病的品种叶肉细胞内这些细胞器增加明显,但健康植株内以抗性较强的品种含这些细胞器较多。随着病毒症状的发展,叶绿体畸形,肿大,基质消失,外膜破裂直至解体。     

大麦条纹花叶病毒新疆株血清学及基因同源性检测

在我国新疆从小麦上分离到的大麦条纹花叶病毒(Barley stripe mosaic Virus,BSMV),可以侵染大麦、小麦、玉米等重要粮食作物。主要以带毒种子传播病毒。大麦、小麦种子带毒率达70％以上。BSMV曾一度使世界主要的大麦产区减产25～30％,是影响农业生产的重要病毒。从预防病害流行和探索该种子传RNA病毒作为植物基因工程载体的可     

表达黄瓜花叶病毒外壳蛋白的转基因番茄抗黄瓜花叶病毒侵染

通过土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导将黄瓜花叶病毒外壳蛋白(CMV CP)的cDNA成功地引入番茄(Lycopersicon esculentum)植株中,并得到转基因植株。用强致病力CMV株系接种后,表达CMV外壳蛋白的转基因植株表现出对CMV侵染的抗性。转基因植株RI代的抗性基因以接近3:1比例分离。对R_1代接种CMV后,表达CMV CP的植株病症减轻,发病率、病情指数及病毒积累量明显低于对照。病症出现推迟1个多月。     

芝麻花叶病的病毒病原鉴定

从患芝麻花叶病的病叶中提纯了一种线条状病毒颗粒,长700～800nm,宽13nm。经汁液摩擦接种可感染心叶烟、大豆,甜菜等9种植物,不感染西瓜,苋色藜、豇豆等。主要传毒介体是发生在芝麻田的桃蚜。病土、病种均不传病。该病毒与西瓜花叶病毒、芜菁花叶病毒及马铃薯Y病毒的抗血清无反应。超薄切片中可见到风轮形和纸卷形的圆柱状内含体以及结晶状内含体。结晶状内含体分布在细胞质和叶绿体中,其它内含体均见于细胞质中。同时,细胞质中还可见到大量聚集的线状病毒颗粒。初步认为此病毒可能是马铃薯Y病毒群中的一个新成员,暂称为芝麻花叶病毒。国内外均未见报道。     

利用交换接头技术构建大麦条纹花叶病毒新疆株RNA_2的全长cDNA克隆

本文采用双股交换接头(Crossover linker)技术对已建立的大麦条纹花叶病毒新疆株(BSMV-XJ)RNA_2 cDNA重组质粒pUBS_(112)进行修饰。使cDNA两端不必要的poly(dG):poly(dC)尾准确地缺失,同时补上了cDNA中相对于RNA_2 5’端区缺少的三个核苷酸TAA,并在cDNA末端插入了预定的限制酶切顺序。通过原位杂交筛选、酶切图谱分析、cDNA两端序列测定等手段,证明已获得BSMV-XJ RNA_2组分的全长cDNA克隆。     

鸡蛋花花叶病毒3'端序列的克隆与分析

根据烟草花叶病毒组（Ｔｏｂａｍｏｖｉｒｕｓｅｓ）３’端非编码区保守区域,人工合成下游引物Ｐ１,Ｐ２,Ｐ３,分别以这些引物引导在反转录酶作用下合成双链ｃＤＮＡ,并克隆到ｐＢＳ载体上。ＨｉｎｄⅢ＋ＰｓｔⅠ双酶切分析重组子后,得到１５个阳性重组子,其中重组子ｐＢＦ３含有２ ４３２ ｂｐ外源ＤＮＡ。序列分析结果表明：该２ ４３２ ｂｐ的序列含２个开放读框,即鸡蛋花花叶病毒移动蛋白基因序列和外壳蛋白基因序列     

辽宁省番茄花叶病主要病毒和株系的研究

从辽宁南部及沈阳地区采集番茄花叶病样本111个(1985-1987),经鉴定得知主要毒原为番茄的烟草花叶病毒(TMV)占总调查的59.46％。黄爪花叶病毒(CMV)亦有发生仅占总调查的9.00％。还有一些系混合侵染(TMV和CMV)占21.62％。尚未认清毒原种的约占2.70％,接种无症的占7.20％。通过试验认为我省番茄上主要毒原为烟草花叶病毒,并进行了常规鉴定、提纯、电镜观察、光谱测定和血清测定等。对番茄上烟草花叶病毒16个分离物做了株系分化研究,按照Pelbam(1970,1972)〔14、15、16、17〕的抗性分类法应用番茄GCR一套品种接种观察,得知辽南及沈阳地区分布很广的番茄TMV分离物,均属TMV-O株系。故在番茄抗TMV育种中尚应考虑到抗1及2株系的能力。