牛α—s1酪蛋白基因3’端的克隆鉴定及序列分析

文用牛α—sl酪蛋白基因cDNA为探针,筛选了以EMBL3为载体构建的牛基因组文库2×10 5pfu,得到一个阳性克隆。分别以牛α—sl酪蛋白基因cDNA全长、终止符前后序列为探针鉴定了该克隆,制作了较为详细的限制酶谱,亚克隆了相应片段,并对含有终止符和poly A加成信号的有关亚克隆进行了序列分析,结果表明：该克隆含有牛α—sl酪蛋白基因终止符下游3．5kb及上游10．2kb片段,与现有的该基因的资料相比较,限制酶谱存在部分差异,DNA序列有多处点突变,并有少量缺失。点突变在内含子和外显子均有发生,这是限制酶图谱差异的原因。     

牛aS1-酪蛋白基因5’-调节区的分子克隆

用牛αsl－酪蛋白cDNA作探针,从牛基因组文库中筛选出一段αsl－酪蛋白基因序列。由限制内切酶图谱和souther印迹分析可以确定其中含有完整的αs1-酪蛋白基因的5’调节区。     

雄牛特异的SRY同源序列的扩增和分析

利用人、兔、鼠SRY序列设计引物,应用PCR扩增牛的SRY序列,获得200bp的雄牛特异的扩增片段。克隆该扩增片段,获得重组质粒pCH21,进行序列分析,并与人、兔和鼠SRY的对应区域比较,具有高度同源性。用pCH21 DNA作探针与牛的基因组DNA酶切图谱杂交,显示了雄牛特异的I．7kb的杂交带。分析200bp的PCR扩增片段是牛的SRY基因片段。用同一对引物扩增人和山羊的DNA样品,也获得雄性特异的200bp的扩增片段。     

大鼠肝脏脂酶基因的PCR扩增、序列分析和克隆

报导了应用聚合酶链式反应（PCR）技术,扩增大鼠肝脏脂酶基因及其克隆和序列分析的结果．经31个循环的扩增,得到大鼠肝脏脂酶及其N端结构域的cDNA,前者为1508bp的片段,后者为1076bp的片段．克隆后,对此二片段进行了限制性内切酶物理图谱分析,测定了DNA序列,并已将它们克隆到表达载体pGT－d中．     

简并PCR结合RACE技术克隆申克孢子丝菌未知过氧化氢酶基因

目的 克隆孢子丝菌未知过氧化氢酶基因,命名为Sscat基因.方法 根据生物信息库中7种已知真菌过氧化氢酶氨基酸序列的高度保守区域设计简并引物,PCR扩增获得部分Sscat基因cDNA片段,随后应用RACE技术分别扩增其3’端和5’端未知序列.结果 Sscat基因cDNA序列全长1746 bp,其中包括5’端121 b...     

连续3步基因抓捕构建牛αS1酪蛋白-人tPA杂合基因座

目的:构建一个利用牛αS1酪蛋白基因座完整的上下游调控序列指导人组织型纤溶酶原激活剂(tPA)基因组序列在乳腺特异性高效表达的牛αS1酪蛋白-人tPA杂合基因座。方法:采用连续3步基因抓捕的方法。首先,以pBR322载体作为骨架,插入预先无痕连接在一起的6个同源臂,构成能连续进行3次基因抓捕的抓捕载体;然后,在大肠杆菌内利用Red同源重组系统介导的缺口修复技术,第一步从含牛αS1酪蛋白基因座的细菌人工染色体(BAC)上亚克隆9 kb的牛αS1酪蛋白基因3'端侧翼序列到抓捕载体上,第二步从人tPA BAC上亚克隆17 kb的从起始密码子(ATG)到终止密码子(TGA)的人tPA基因组序列,第三步从牛αS1酪蛋白BAC上亚克隆20 kb的牛αS1酪蛋白基因5'端完整侧翼序列,并使这3个基因片段在抓捕载体上自动无痕地连接在一起,形成一个长约46kb的牛αS1酪蛋白-人tPA杂合基因座。结果:经过PCR扩增、限制性内切酶消化和序列测定验证,构建的杂合基因座中,原牛αS1酪蛋白基因组编码序列从起始密码子到终止密码子被人tPA基因组序列精确置换。结论:连续三步基因抓捕构建杂合基因座乳腺表达载体的技术,为乳腺生物反应器高效表达大载体的制备提供了探索性研究。     

小鼠cAMP应答元件结合蛋白基因在大肠杆菌中的表达

采用PCR技术,删除了小鼠CREBcDNA5′端和3′端非编码序列,并引入便于基因操作的酶切位点。经30次循环的扩增,得到改造后的CREBcDNA,全长1071bp。亚克隆后,对此扩增片段进行了限制性内切酶物理图谱分析,测定了DNA序列,并以其为插入物,构建了pBV220-PCR-CREB重组表达载体。经Western印迹法分析证明,在大肠杆菌中的表达获得成功 。     

应用RD-PCR技术制备HIV基因芯片探针

利用限制性显示 (RD PCR)技术快速分离HIV 1基因片段制备DNA芯片探针 .以Sau3AⅠ酶切HIV基因 ,得到许多大小适合芯片的限制性酶切片段 .然后在片段两端接上接头 ,根据酶切位点、接头的序列设计通用引物 .在该通用引物的 3′端分别延伸一个碱基后 ,通过引物间的两两组合 ,将PCR反应分成 10个亚组 .纯化各组PCR产物 ,克隆到T载体上 .阳性克隆经鉴定、扩大培养后提取质粒 .以质粒为模板扩增靶片段并进行序列分析 .每个亚型得到了十几个 10 0～ 10 0 0bp的HIV基因片段 .研究表明 ,RD PCR技术是一种有效的快速制备基因芯片探针的方法     

牛β-酪蛋白5′端上游调控序列的克隆和序列分析

该文用PCR扩增了牛β－酪蛋白基因5′－端上游调控序列,并对其进行了克隆和序列分析。采集成年母牛肝,提取DNA。在牛β－酪蛋白基因外显子1和上游调控区内设计引物,扩增其上游调控序列。两条引物长均为19个核苷酸,引物间跨度为635bp。以牛肝DNA为模板,进行PCR扩增,扩增产物在2％琼脂糖凝胶上电泳,可见特异的目的条带。从凝胶中回收目的片段,克隆到pGEM－T载体中。重组质粒提取DNA,进行序列分析。测序结果与文献发表的类似序列相比,仅有4个碱基不同,同源性达99．4％。表明获得了牛β－酪蛋白基因5′－端上游调控序列的克隆。     

人Ha-ras基因中蛋白质特异结合DNA位点的鉴定

利用迁移率改变法和DNaseⅠ足纹法观察了Ha-ras癌基因5’端上游序列与特异结合蛋白的相互作用。用限制性内切酶XmaⅠ消化6.6kb Ha-ras基因得到约10个片段,进行3’-末端标记,与T24细胞核提取液反应,经低离子强度聚丙烯酰胺凝胶电泳,发现与蛋白质特异结合的416bp片段,位于Ha-ras基因5’-端上游1230—1646区域内,靠近转录起始点1660bp处(CAP位置)。另一个与蛋白质特异结合的389bp片段,位于转录起始点上游162—551处。     

谷氨酸棒状杆菌启动子在枯草芽孢杆菌中的克隆及其序列分析

利用枯草芽孢杆菌启动子探针质粒pPL 603为载体,从谷氨酸棒状杆菌1014—6染色体DNA上克隆到一个有较强启动功能的DNA片段。生物素标记的DNA—DNA分子杂交实验证明该片段确实来自谷氨酸棒状杆菌1014—6染色体DNA。在绘制该片段限制酶酶切图谱的基础上,经另一个启动子探针质粒pPL 703的亚克隆,将其启动子功能区定位在Bamm酶切片段中。对后者进行了核苷酸序列分析,发现它具有棒状杆菌类启动子的－35区和－10医序列。     

牛β-酪蛋白基因的克隆及乳腺特异性表达载体的构建

利用PCR技术分3段克隆了长约9．7kb的牛β-酪蛋白基因,分别克隆在pGEM-T easy Vector的T位点。经NCBI Blastn分析,与牛β-酪蛋白基因相应区段的同源性为98％。这3段序列包含完整的5’侧翼序列、前8个外显子及第8个内含子的部分序列。以此构建了两个乳腺特异性表达载体：利用第1段和第2段共有的酶切位点将两段融合,作为5’调控区（6．8kb）,第3段和实验室已有的600bp的加尾信号通过重组PCR拼接作为3’调控区（3．4kb）构建了一乳腺特异性表达载体;以第一段作为5’调控区,实验室已有的600bp加尾信号作为3’为调控区构建了另一乳腺特异性表达载体。可以应用于进一步乳腺生物反应器的研制。     

ACS和ACO基因克隆及植物转化

根据已知序列设计PCR引物,分别扩增氨基环丙烷羧酸合酶（ACS）和氨基环丙烷羧酸氧化酶（ACO）基因并克隆到中间载体,经限制性内切酶酶切图谱分析、部分序列分析以及Southern印迹鉴定后,将两个基因单个或相互串联后反向亚克隆至植物表达载体pBI121。经农杆菌LBA4404转化番茄子叶,在抗性培养基上得到8株ACS基因反义转化的生根小苗以ACS基因的酶切小片段作为探针,经Southern印迹分析,证明获得了两株阳性转化株。     

解淀粉芽胞杆菌启动基因的克隆及其对地衣杆菌α-淀粉酶基因的调控

用大肠杆菌启动基因探针质粒pHE5克隆了解淀粉芽胞杆菌的启动基因。供体菌DNA的HindⅢ片段与pHE5重组后转化大肠杆菌,获得一批带启动基因的抗四环素转化子,其中四株的抗性达到200μg/mL,从这四株高抗性转化子中提取质粒,并对其中的一个重组质粒pAE23的插入片段进行限制性图谱分析和缺失研究,获得了一个缺失了部份片段,四环素抗性仍达到200μg/mL的衍生质粒pAED23,经酶切分析证明其上的启动基因位于0.8kb的EcoR Ⅰ—HindⅢ片段上。点杂交分析证实该片段来自解淀粉芽胞杆菌的DNA。将地衣杆菌的α-淀粉酶基因亚克隆至pAED23启动基因下游的HindⅢ位点上能增强该基因在大肠杆菌中的表达。     

肝癌细胞AFP基因高水平的转录是受核蛋白成分的促进

利用大鼠甲胎蛋白(AFP)基因片段作为模板,分析大鼠肝癌细胞核蛋白成分对体外转录活性的影响,发现大鼠肝癌含有促进AFP基因体外转录的核蛋白。作为对照．没有发现任何成年大鼠肝核蛋白可以促进AFP基因的体外转录。为了确定促进AFP基因体外转录的核蛋白作用部位,对AFP基因模板5＇端上游序列进行了不同程度的删除,进一步分析核蛋白对删掉5’端上游序列后的模板体外转录的影响,结果表明,AFP基因转录的起始点到255bp这段DNA序列是大鼠肝癌核蛋白促进AFP基因转录必不可少的。以SV40DNA经Pst I酶酶切所得的DNA片段(1216bp和4027bp)代替AFP基因片段作为模板,不存在核蛋白促进体外转录的现象。用AFP基因转录的起始点到 255bp这段的DNA为探针,进行Southwestm印迹分析,结果发现了8种与探针结合的核蛋白。     

人淋巴细胞CD2基因5’侧翼序列的克隆和鉴定

本文报告以ＣＤ２ｃＤＮＡ５’端的片段作探针,从人Ｔ淋巴细胞基因组文库筛选阳性重组克隆,经限制性内切酶降解和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析,证明其中一个阳性克隆的插入片段中含ＣＤ２基因５’侧翼顺序。经插入片段的亚克隆、限制性内切酶图谱及ＤＮＡ序列分析,鉴定出一含转录起始点及其上游序列的４．０ｋｂ片段。将此片段中含转录起始点和两个ＤＮ（ａｓｅ）Ⅰ高敏感位点的２．５ｋｂ片段定向克隆到以虫萤光素酶为报告基因的表达载体ｐＭＧ３中,并用限制性内切酶对此２．５ｋｂ片段作不同程度缺失,构成一系列突变子。这些重组的表达质粒转染人ＪｕｒｋａｔＴ细胞后,以瞬时表达实验分析各突变子驱动虫萤光素酶基因的表达,结果发现在ＣＤ２基因５’上游具有很弱的启动子活性,初步测定该启动子位于－１．２ｋｂ～－９８ｂｐ域。ＣＤ２基因具有弱启动子、强增强子的特点与Ｔ细胞表面其它抗原分子基因是相似的。     

山羊与牛乳腺差异表达基因的筛选及半定量RT-PCR分析

山羊和奶牛具有非常相似的泌乳过程,但在产乳量和乳成分(脂肪和蛋白含量)之间存在很大的差异,而且山羊奶还具有特殊的膻味。本研究根据山羊和牛在基因编码序列上具有非常高的保守性原理,利用抑制消减杂交技术对3只西农萨能奶山羊和3头荷斯坦奶牛泌乳末期的乳腺组织进行差异表达基因分析。分别提取山羊和牛乳腺组织总RNA,分离mRNA并合成cDNA,以山羊乳腺组织cDNA作为测试,牛的乳腺组织cDNA作为对照。cDNA经RsaⅠ酶切后将测试组cDNA分成两组,分别衔接两种不同接头,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次PCR反应,产物与T/A克隆载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增。随机挑选克隆经PCR鉴定发现有150个克隆具有200bp-1000bp插入片段,挑选50个差异片段不等的克隆进行测序及同源性分析,结果得到5个已知乳蛋白(αs2酪蛋白、β酪蛋白、К酪蛋白、α乳清白蛋白和β乳球蛋白)基因的编码序列和6个新的EST序列,EST序列已登录GenBank,登录号分别为EG588067、EG588068、EG588069、EG588070、EG588071和EG588072。通过半定量RT-PCR分析,发现β酪蛋白基因mRNA表达量在山羊乳腺中显著高于其在牛乳腺中的表达量,К酪蛋白在乳腺中的mRNA含量与其所表达的蛋白质在乳中含量存在很大差异,表明К酪蛋白虽然和其他酪蛋白具有相同的调控机制,但其在分泌和运输机制上与其他酪蛋白不同。     

蒙古冰草磷脂酶D基因cDNA 3'端的克隆及分析

目的：采用3’RACE方法对蒙古冰草磷脂酶D（PLD）基因3’端全序列进行了快速扩增和序列分析,为得到全序列及研究该基因的功能奠定基础。方法：实验以蒙古冰草幼叶为材料,利用RT-PCR技术得到PLD基因的部分cDNA序列,根据此序列设计一条特异性上游引物,反转录引物中的部分序列即M13PrimerM4作为下游引物,按3’RACE试剂盒（TaKaRa）操作流程进行PLD基因3’末端的快速扩增,成功获得993bp的3’RACE反应产物,采用DNAStar软件对扩增的PLD基因的3’RACE产物和中间片段进行拼接,最终获得2113bp的PLD基因3’端cDNA序列。结果：通过BLAST技术,发现该片段与许多植物磷脂酶D基因的同源性为47.0%～80.0%。结论：通过同源性比较,成功克隆了PLD基因cDNA3’端序列。     

黑曲霉糖化酶高产和低产菌株糖化酶基因调控区的克隆及其分析比较

以PCR合成的糖化酶高产菌株黑曲霉(Asp. Niger)T21糖化酶基因5’近端非编码区588bp(EcoRI-BamHI)的序列为探针,从T21染色体DNA中克隆到近2.0kb的糖化酶基因5’端非编码区序列,并以此序列为探针从糖化酶低产菌株黑曲霉3.795(T21的诱变出发株)的染色体DNA中克隆到1.5kb的糖化酶基因5’端非编码区序列。该二序列的分析测定结果表明,其结构特征与文献报道的黑曲霉糖化酶基因5’端非编码区的基本一致,被称为“核心启动子”(Core promoter)的TATAAAT框及GCAAT框,分别在翻译起始点的-109bp及-178bp处。此外,在曲霉amdS,amyB基因中已发现有调控功能的CCAAT序列存在于-449bp和-799bp处。高产和低产菌株糖化酶基因5’端非编码区序列的分析比较结果表明,有9个部位的碱基发生了变化。此实验结果为进一步研究黑曲霉糖化酶基因在转录水平上的调控规律打下了基础。     

犏牛FSHβ基因的5'端侧翼区的序列测定和比较研究

目的:为探求犏牛FSHβ基因的5’端侧翼区的序列特征,揭示该基因的变异和对家畜产仔率的意义,方法:根据奶牛FSHβ基因的5’端侧翼区的基因序列设计引物,应用PCR方法扩增并克隆了犏牛FSHβ基因的5’端侧翼区的序列,扩增序列长度为2022bp,包括5’端上游调控序列、第一外显子和部分第一内含子,并与奶牛该区段序列进行了比较研究。结果:序列分析结果表明:犏牛FSHβ基因的5’端侧翼区与文献报道的奶牛该基因的同源性为98.37%。结论:这为研究杂交一代犏牛雄性雄性不育,为开展牦牛功能基因组计划和分子育种提供了一定的科学的理论依据。