产气肠杆菌EAM-Z1尿苷磷酸化酶的分离纯化及性质研究

从产气肠杆菌 (Enterobacteraerogenes)突变株EAM Z1中分离出一种具有较高转移酶活性的尿苷磷酸化酶 (UPase)。经测定这种Upase的分子量为 1 2 .8× 1 0 4,亚基分子量为 4 .3×1 0 4,由 3个同型亚基组成。N端氨基酸序列为 :MRMVDLIATKRDGGE。等电点为 4 .46。对尿苷的Km为 0 .2 9mmol L。酶反应的最适pH为 7.8,最适温度为 50℃。该酶能磷酸化尿苷、胸苷、5 氟尿苷、2′ 脱氧 5 氟尿苷及尿嘧啶 β D 阿拉伯呋喃糖 ,且具有较高的转移酶活性 ,能将尿苷和 5 氟尿嘧啶转化成 5 氟尿苷 (一种抗癌药物的中间体 ) ,其转化率为 47%。该酶的这些特性对于酶法合成核苷类抗肿瘤药物和抗病毒药物是十分有用的。     

卡瑞苯西思伯克霍尔德氏菌卤乙酸脱卤酶的分离纯化及性质

从云南西北部土样中分离到一株卡瑞苯西思伯克霍尔德氏菌(Burkholderia caribensis),它在氯乙酸培养基中能产生较高活性的卤乙酸脱卤酶。经硫酸铵盐析、DEAE SephadexA50柱层析、羟基磷灰石柱层析、Sephadex G200 凝胶过滤后,获得电泳纯酶。用SDSPAGE测定酶分子量为46kD。水解氯乙酸的Km值为3.7×10-3mol/L。酶反应的最适温度为40℃,最适pH值为9.5。金属离子及CN-、EDTA对该酶有不同程度的影响,Hg2+和CN-则对该酶有强烈的抑制作用。     

枯草芽孢杆菌中性内切β-甘露聚糖酶的纯化及性质

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BM9602产生的中性内切β甘露聚糖酶(endoβ1,4Dmannan mannanohydrolase,EC,3.2.1.78)经硫酸铵分级沉淀、DEAE纤维素(DE22)离子交换柱层析,得到电泳纯的样品,提纯了455倍,收率为59%。用SDSPAGE测得该酶的分子量为35kD。用PAGEIEF测得其等电点pI为45。酶反应的最适pH为5.8,最适温度为50℃。该酶在pH60～80,50℃以下稳定。金属离子Hg2+和Ag+对酶活性强烈抑制。酶对槐豆胶、羟丙基瓜胶、田菁胶和魔芋粉的Km值分别为38、149、113和24mg/mL,Vmax值分别为245、865、384和198μmol.min-1mg-1。酶水解甘露聚糖为甘露寡糖(不含单糖)。     

产气肠杆菌几丁质酶的分离纯化及性质研究

从自然罹病死亡的草原毛虫(Gynephorap ruoergnesis)体内分离到一株产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes),它在几丁质的诱导下能产生较高活性的几丁质酶。发酵液经硫酸铵盐析、DEAE纤维素柱层析和Sephadex G-100柱层析分离出几丁质酶。用SDSPAGE测得该酶的分子量为425kD。水解几丁质的Km值为2.88mg/mL-1。酶反应的最适温度为55℃,最适pH值为60,金属离子对几丁质酶活性影响较大,其中Zn2+、Ba2+、Ca2+和Mn2+对酶有较强的激活作用,而Hg2+、Co2+和Mg2+则有较强的抑制作用。     

日本根霉IFO5318胞外β-葡萄糖苷酶的纯化及部分特性

采用硫酸铵沉淀及柱层析等步骤纯化了日本根霉IFO5318的β—葡萄糖苷酶,回收率为22％。该酶分子量约为4.0×10~5,由四个相同大小的亚基组成;最适反应温度55℃,最适反应pH5.5;对热较敏感,但能在较大的pH范围内保持稳定。用对硝基苯基—β-D-吡喃葡糖苷为底物,测得的K_m和V_(max)值分别为0.825mg·ml~(-1)和135.4μmol·min~(-1)·mg~(-1)。该酶对纤维二糖的水解能力最强,SDS、Fe³⁺、Hg²⁺等对酶活力有抑制作用。     

嗜碱菌(Bacillus sp.) ZBAW6的木聚糖酶的分离纯化及其性质

通过硫酸铵分级沉淀,阴离子交换层析,凝胶过滤3步从嗜碱菌Bacillus sp. ZBAW6纯化了木聚糖酶。结果表明该酶分子量为45kD。N末端序列为DPFAAAVAPL。在pH5.5～10.5范围内均具有较高酶活性和稳定性;最适反应温度为65℃,酶活力基本不变。该酶作用于Beechxylan的Km为0.11mg/mL,Vmax为 23.89μmol/(min·mg)。 Hg2+对该酶有强的抑制作用。     

华丽曲霉Z58有机磷农药降解酶的纯化和性质

华丽曲霉(Aspergillus ornatus)Z58有机磷农药降解酶经硫酸铵分级沉淀、Sephadex G100凝胶过滤、DEAE52离子交换层析得到了分离纯化,用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)鉴定为单一组分。凝胶过滤法测得分子量为67 000,提纯倍数为34.2,收率为17.8%。该酶的最适反应温度45℃,最适反应pH72,对热较稳定,并且能在pH6～10范围保持活性。重金属Cu2+对该酶具有明显的促进作用,而SDS对酶具有抑制作用。此酶对所试的有机磷农药都有较好降解作用。     

猪β干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其对伪狂犬病毒的抑制作用

了研制高活性的重组猪β干扰素,对PoIFNβ成熟蛋白第3、7和164位的3个氨基酸密码子进行毕赤酵母偏嗜性改造并构建了酵母表达载体pPICZαAPIB。pPICZαAPIB经SacⅠ酶切线性化后电转化导入毕赤酵母菌株X33。多株PCR鉴定为阳性的酵母转化子经甲醇诱导发酵分泌表达了PoIFNβ, 其中B1株酵母的PoIFNβ产量最高,约为2.5×10.5U/mL,其表达量约为60μg/mL,比活为4.17×10.6U/mg。将发酵上清液用PEG20000浓缩后进行SDSPAGE和Western blot检测,结果表明表达产物是分子量约为28kDa和25kDa蛋白的混合物,两者均可与PoIFNβ阳性抗血清发生特异反应。表达产物比PoIFNβ理论推导分子量（约20.8kDa）大,推测可能是表达产物发生了不同程度的糖基化。重组PoIFNβ对伪狂犬病毒在细胞中增殖可呈现抑制作用,并且rPoIFNβ对伪狂犬病毒在MDBK细胞上早期增殖的抑制效果最为明显。     

Sinorhizobium morelensS-5中N_氨甲酰基水解酶基因的克隆、表达和纯化

N_氨甲酰基水解酶是一种非常具有工业应用价值的水解酶,可用于制备光学纯氨基酸。通过LA PCR 从 Sinorhizobium morelens S_5 菌中克隆到13kb的DNA片段,测序表明该片段上含有一个完整的N_氨甲酰基水解酶的基因（hyuC）序列。将hyuC基因克隆到表达载体pET30a上,重组质粒pET30a_HyuC在大肠杆菌中获得了高水平表达。重组的N_氨甲酰基水解酶经过热处理和三步柱色谱分离而纯化。纯化倍数为16.1倍,收率21.2%。该酶为同源四聚体,亚基分子量是38kDa。最适温度是60℃,最适pH为7.0。该酶有较高的热稳定性和氧化稳定性。Fe²⁺和Ca²⁺对酶的活性有一定的促进作用,而金属螯合剂和巯基试剂对酶活无明显影响。