不同方向内含子对重组CHO细胞中神经生长因子表达的影响

为了研究不同方向的嵌合体内含子对重组神经生长因子 (Nerve growth factor,NGF) 基因表达的影响,以人β-珠蛋白第一内含子5?端剪接序列和人免疫球蛋白重链可变区内含子3?端剪接序列组合而成的嵌合体内含子作为研究对象,在NGF基因5?端插入不同方向的嵌合体内含子,构建含不同方向内含子的NGF基因表达载体。转染至CHO细胞后,G418筛选稳定转染的细胞,荧光定量PCR、ELISA和Western blotting检测不同载体NGF基因的表达情况。结果显示内含子可以大幅度提高NGF基因的表达,且正向内含子对NGF基因表达的增强作用无论是在mRNA水平还是在蛋白水平都要高于反向内含子。所以内含子能够提高外源NGF基因的表达,且内含子调控转基因表达具有方向性。     

内含子中正筛选标记neo基因在转录中的剪切研究

目的:研究插入内含子中的正筛选标记基因neo在转录中的剪切情况。方法:克隆了猪血清白蛋白基因5'端调控序列,以猪基因组DNA为模板,P10/P11为引物,PCR扩增猪血清白蛋白基因翻译终止密码子后2.9kb的3'端调控序列;以pEGFP-1为模板,P400/P401为引物PCR扩增绿色荧光蛋白(EGFP)基因,插入猪血清白蛋白基因5'端调控区之后,在3'端调控序列的内含子中靠近N端的序列中插入正筛选标记基因neo,构建了表达EGFP的真核表达载体pEXp11。转染人肝癌细胞系HepG2,通过G418药物筛选获得稳定转染的抗药性细胞克隆。提取抗性细胞克隆基因组RNA并进行反转录,获得cDNA序列。结果:用引物D400/D401及分别位于neo基因和3'端调控序列上的一对引物D394/D357进行PCR检测,其中D394/D357并未扩增出目的条带。结论:插入内含子中的neo基因在转录过程中可随内含子一起被剪切。     

核基质结合区的位置对转基因表达的影响

为研究核基质结合区 (MAR）序列不同插入位置对转基因表达作用的影响,PCR扩增人β 珠蛋白MAR分别插入到含氯霉素乙酰转移酶（chloramphenicol acetyltransferase,CAT）报告基因真核表达载体pCATG表达盒两侧、5′端及3′端.酶切鉴定后,用阳离子聚合物转染CHO细胞,G418筛选出阳性细胞克隆,ELISA分析CAT基因的表达水平,半定量PCR分析CAT基因相对拷贝数.结果表明,表达盒两侧含MAR序列的载体能提高介导的转基因表达水平平均提高10.4倍,5′端含MAR序列的载体表达水平平均提高3.9倍,3′端含MAR序列的载体反而降低转基因表达水平.5′端含MAR序列的表达载体其转基因相对拷贝数高于其它两组载体的基因拷贝数,转基因表达量与基因拷贝数不成正比.     

一种快速筛选人目的基因反义片段的简单有效方法

本文选取人elp3基因三个不同的区段(基因全序列、5'端非HAT区、3'端HAT区)构建了反义质粒pRS313al 644、pRS314al 107、pRS314a450,通过与人elp3基因共转化酵母后的功能互补和基因表达检测,筛选出可显著抑制人Elp3表达的5'端非HAT区1107bp有效反义片段.该片段在随后的HeLa细胞转染实验中被检测出可显著抑制Elp3的mRNA水平.表明利用该方法可避开繁琐的细胞培养和转染步骤,快速筛选到人类兴趣基因的有效反义片段.     

内含子对真核基因表达调控的影响

大多数真核基因都含有非编码的间隔序列--内含子,根据剪接机制的不同,可将内含子分为3类:真核mRNA内舍子、自我剪接内含子和真核tRNA内含子.在多数情况下,真核mRNA内含子的存在可以提高基因的表达水平.因为其剪接过程会影响mRNA新陈代谢的多个阶段,包括转录、RNA编辑、pre-mRNA的加工、mRNA的出核运输、翻译和无义衰变等.真核mRNA内含子在真核生物基因表达调控中起着重要的作用,是转基因研究中提高外源基因表达的重要元件之一.就真核mRNA内含子的特性、剪接机制及其对真核基因表达调控的影响作一概述.     

嵌合内含子对抗bFGF抗体基因在293T细胞中表达的影响

目的：构建含嵌合内含子和抗bFGF抗体基因的真核表达载体并在293T细胞中表达,探讨嵌合内含子对抗体表达的影响。方法：设计引物分别从载体pCl-neo和pComb3-Fab25中扩增出内含子和抗体Fd段、κ链基因序列,按不同组合构建到含人免疫球蛋白IgG1恒定区Fc段基因的表达载体pIgG中。重组质粒经脂质体PEI转染293T细胞,荧光显微镜观察质粒转染情况,采用夹心ELISA和Western blot检测细胞上清中抗体的表达。结果：DNA测序和酶切分析表明,内含子和抗体基因成功插入pIgG,获得了重组质粒pIgG-Fd-κ、pIgG-Fd-intron-κ、pIgG-Fd-κ-intron和pIgG-Fd-intron-κ-intron。倒置荧光显微镜下可观察EGFP大量表达,Western blot分析上清中有抗体的表达,夹心ELISA检测pIgG-Fd-κ、pIgG-Fd-intron-κ、pIgG-Fd-κ-intron和pIgG-Fd-intron-κ-intron抗体表达量分别为1.21mg/L、0.468mg/L、7.39mg/L、0.601mg/L。结论：成功构建了含嵌合内含子和抗体基因的真核表达载体并在293T细胞中得到表达。嵌合内含子插入κ链基因5’端可提高抗体的表达,插入Fd段5’端则抑制抗体的表达。     

鸡卵清蛋白基因第一内含子和3′-调控区对外源基因表达的调控作用

探明鸡卵清蛋白基因(ov)第一内含子和3′-调控区对目的基因表达水平的影响, 为鸡输卵管表达载体的构建提供科学依据。用牛生长激素基因(BGH)poly A序列替换鸡输卵管表达载体中ov 3′-调控区, 用限制酶消化法逐步删减第一内含子序列, 获得5个表达人组织激肽释放(hK1)cDNA的鸡输卵管表达载体, 分别命名为pOV2K、pOV3K、pOV4K、pOV5K和pOV6K。经翅静脉给产蛋鸡注射聚乙烯亚胺包裹的相同拷贝数重组载体, 通过蛋清中酶活性定量检测评价不同载体的表达水平。结果表明: 受控于3.0kb ov 5′-和3′-调控区的pOV2K表达的重组酶活性明显高于用BGH poly A 替换3′-调控区的pOV3K; 无内含子的pOV6K表达水平显著低于含不同长度第一内含子的pOV3K、pOV4K和pOV5K, 重组酶表达水平随第一内含子的缩短呈逐渐下降趋势。该试验结果表明ov第一内含子和3′-调控区对目的基因在鸡输卵管细胞中的表达具有正调节作用, 应当包括在鸡输卵管表达载体中。     

5′端非翻译区对LT-B基因表达的影响

mRNA5＇端非翻译区的不同结构可影响基因表达,为了改善编码人毒素源性大肠杆菌热敏感肠毒素B亚单位的LT-B基因的表达水平,我们把该基因置于pBV220载体的P_RP_L串联启动子下游,构建了带有不同核苷酸组成的5＇端非翻译区的重组体。这些重组体分别在大肠杆菌HB101和DH5α中表达。结果表明,起始密码前有两个连续串联SD序列的LT-B基因的表达水平低于只有单个SD序列下的表达水平,而翻译偶联可使表达改善;用不同的SD序列LT-B基因的表达水平也有所不同,用基因本身SD序列可能要比用pBV220P_L启动子下游的SD序列好;在只含单个LT-B基因SD序列的重组体中,5＇端非翻译区序列的长短对LT-B基因表达没有什么影响;重组体在HB101中的表达水平高于在DH5α中的表达水平。     

鱼类基因内含子研究进展

内含子是指断裂基因中的非编码区序列,在编码蛋白质前被去除。在高等生物中,内含子的长度远大于外显子,大部分随机突变会发生在内含子中。因此,内含子的存在使高等生物对突变的耐受能力大大增强了。研究表明,内含子可以提高基因表达效率;影响RNA的转录、剪接加工、出核孔以及翻译等过程;启动某些基因的表达;并通过选择性剪接调控基因的表达。内含子功能的研究成果给当前鱼类免疫基因研究开拓了全新的视野。对内含子的分类、剪接、功能以及鱼类内含子研究的新进展进行了综述,并展望了内含子在鱼类免疫基因研究中的应用。     

neuronatin shRNA真核表达载体的构建及其生物学功能

目的:获得能持续干扰neuronatin（nnat）基因表达的细胞,观察nnat基因沉默对神经细胞发育与分化的影响,为研究基因功能奠定基础。方法:构建含nnat基因短发夹RNA(shRNA)表达质粒,将质粒转染大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞PC12,RT-PCR方法筛选出最有效干扰质粒,稳定转染PC12细胞后观察细胞表型变化,免疫荧光检测nnat蛋白表达,NGF诱导观察nnat表达下调对细胞分化的影响。结果:成功构建并筛选出有效的靶向nnat基因的shRNA真核表达载体;载体稳定转染PC12细胞之后能特异性沉默nnat基因的表达,PC12细胞长出突起,向神经元方向分化,加入诱导因子NGF后能促进突起生长。结论:nnat可能是作为神经分化抑制因子在神经发育与成熟过程中发挥作用。     

含GDNF基因的慢病毒载体的构建和其在人胚胎神经干细胞中的表达

利用含胶质源性神经营养因子(Glial cell derived neurotrophic factor, GDNF)基因的慢病毒(Lentivirus)载体转染了人胚胎来源的神经干细胞, 探讨了转染后GDNF在神经干细胞中的体外表达水平及其影响因素。首先GDNF基因被克隆入慢病毒载体, 通过瞬时转染法包装出病毒上清, 经滴度鉴定后分别按拷贝数分别为 1、2.5、5、10转染神经干细胞。转染后细胞经过潮霉素筛选得到均一表达GDNF的神经干细胞体系。其后分别利用酶联免疫吸附(ELISA)方法和Real-time PCR方法测定不同转染组细胞在不同时间点GDNF的蛋白分泌水平和基因表达水平。实验中构建了表达GDNF基因的慢病毒载体, 包装出的病毒上清在体外培养条件下成功转染了神经干细胞, 经潮霉素筛选可以得到均一的持续表达分泌GDNF的人胚胎皮层神经干细胞体系。实验结果表明转染拷贝数可以影响GDNF的分泌水平, 相同条件下转染拷贝数越高, GDNF分泌量越多, 其基因表达水平越高。因此, 含GDNF的慢病毒载体可以成功转染人胚胎来源的神经干细胞, 使其持续表达GDNF, 转染过程中可以通过拷贝数在一定水平上控制GDNF的蛋白分泌水平和基因表达水平。     

Cre重组酶表达载体的构建及其在转基因小鼠胰腺中的表达

组织特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠是进行组织特异性条件敲除研究的关键。采用PCR扩增大鼠胰岛素基因705bp启动子指导发胰岛细胞中特异表达;同时采用改构的Cre重组酶基因,在其5'端添加有真核核糖体结合序列和核定位序列使Cre重组酶能穿越核膜在细胞核能发挥功能;同时,为了保证原核基因Cre能在真核系统顺利表达,在其3'端添加含内含子的人生长激素基因。构建的表达载体在去除原核序列后用显微注射方法转基因小鼠,在出生的27只仔鼠中,PCR检测共获得7只Cre整合阳性的转基因小鼠,整合率26％。这种Cre转基因小鼠与基因组小携带LoxP位点的条件基因打靶小鼠交配,在胰腺组织中可以检测到Cre介导的重组,表明Cre在转基因小鼠胰腺中有表达。     

5’端非翻译区对LT—B基因表达的影响

RNA 5’端非翻译区的不同结构可影响基因表达,为了改善编码人毒素源性大肠杆菌热敏感肠毒素B亚单位的LT—B基因的表达水平,我们把该基因置于pBV220载体的PRPL串联启动子下游,构建了带有不同核苷酸组成的5’端非翻译区的重组体。这些重组体分别在大肠杆菌Hblol和DH5a中表达。结果表明,起始密码前有两个连续串联SD序列的LT—B基因的表达水平低于只有单个SD序列下的表达水平,而翻译偶联可使表达改善;用不同的SD序列LT—B基因的表达水平也有所不同,用基因本身sD序列可能要比用pBV220 PL启动于下游的SD序列好;在只含单个LT－B基因SD序列的重组体中,5’端非翻译区序列的长短对LT—B基因表达没有什么影响;重组体在HB101中的表达水平高于在DH5α中的表达水平。     

鸡β-肌动蛋白第一内含子对EIAV转移载体外源蛋白表达能力的影响

以马传染性贫血病毒（equine infectious anemia virus, EIAV）基因转移载体pcPPTWPRE为基础,用含不同长度片段的鸡β-肌动蛋白启动子替换原有的人巨细胞病毒立即早期启动子（CMVIEp）启动外源基因的表达,分别构建了2个基因转移载体,含部分第一内含子的pWCAGP0.8和含全长内含子的pWCAGP1.6。连同在其它研究中构建的不含内含子的质粒pcPPTWCAG（另文发表）,采用磷酸钙法分别转染HEK293细胞和DF-1细胞, 利用荧光显微镜观察报告基因eGFP蛋白的表达。并利用流式细胞仪定量。统计学分析结果表明,在HEK293细胞中,pcPPTWCAG、pWCAGP0.8和 pWCAGP1.6表达阳性率分别为47.9%、46.1%和23.8%,转染后48h,收获细胞,利用流式细胞仪比较转染细胞中EGFP表达阳性细胞的百分率。结果表明,在HEK293细胞中,pcPPTWCAG、pWCAGP0.8 和pWCAGP1.6的阳性细胞分别占计数细胞的47.9%、46.1%和23.8%;在DF-1细胞中,依次分别为12.4%、9.5%和4.2%,pcPPTWCAG与pWCAGP1.6差异显著。本研究表明不含内含子的EIAV载体质粒表达EGFP的能力高于含部分和全长内含子的载体。     

人CD46启动子真核表达载体的构建

为了构建人CD46（hCD46）启动子指导目的基因表达的真核表达载体,提取HeLa细胞基因组DNA,用PCR扩增出hCD46基因的启动子区域,序列分析结果表明其与GenBank中hCD46基因5’端某片段的同源性为99.9％。用此启动子替换pcDNA3EGFP中的CMV启动子,并在hCD46启动子和EGFP基因之间插入兔β-球蛋白基因第二内含子（RGI）,得到的重组表达载体转染CHO和SP2/0两种鼠源细胞,流式细胞术检测表明CHO细胞EGFP的表达量高于SP2/0细胞,表达特性与人体CD46相似;RGI可以增强EGFP的表达量,但不改变其表达的组织特异性,提示克隆的hCD46启动子可以用于研制模拟人体CD46基因表达特性的转基因小鼠。     

牛β-酪蛋白基因控制的人凝血Ⅸ因子基因在小鼠乳腺组织中的表达调控

构建牛β 酪蛋白基因控制的人凝血Ⅸ因子 (hFⅨ )乳腺组织特异性表达载体pCⅨm,pCiⅨ ,pCⅨ和报告基因 (LacZ)乳腺表达载体 pCiLacZ ,pCLacZ ,利用Stearylamine(SA)阳离子脂质体包埋 5种载体 ,通过尾静脉注射的方法直接转染哺乳期母鼠的活体组织 .在DNA ,mRNA以及蛋白质水平对实验小鼠的检测结果表明 :转染处理后hFⅨ基因和LacZ基因在小鼠乳腺获得表达 ,hFⅨ蛋白在乳汁中的最高分泌表达量为 80 .2 8ng/mL ,其中 85 %以上已经羧基化并具有生物学活性 ;对 5种载体表达调控的研究证实牛β_酪蛋白基因 5′端 2 .0kb的片段能够驱动人凝血Ⅸ因子基因在小鼠乳腺组织中分泌表达 ,β_酪蛋白基因内含子 1能够提高Ⅸ因子基因在乳腺组织中的表达水平 ,并能影响该基因表达的组织特异性 ;和hFⅨcDNA相比 ,hFⅨ基因自身的内含子 1能够提高该基因在活体乳腺组织中的表达水平 3倍以上     

结构域Ⅰ缺失的丙型肝炎病毒5'NCR调控荧光素酶基因的表达

目的:分析丙型肝炎病毒(HCV)5'端非编码区(NCR)的结构域Ⅰ序列在其翻译启动活性中的作用.方法:以质粒pCMVNCRluc为模板,PCR扩增分别得到缺失5'端20nt和43nt的HCV 5'NCR片段,并分别替换pCMVNCRluc中的完整HCV 5NCR,构建结构域Ⅰ缺失的HCV 5'NCR调控萤火虫荧光素酶(luc)基因表达的真核表达质粒(pCNl-d1、pCNl-d2).以脂质体方法转染人肝癌细胞株HepG2,用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶相对于内参考的海肾荧光素酶表达活性,同时采用RT-PCR方法检测转染后细胞中萤火虫荧光素酶基因的相对表达水平.结果:酶切和测序结果表明,各重组质粒构建成功.各重组质粒转染细胞后luc mRNA的相对表达水平与pCMVNCRluc相比差异无显著性(P＞0.05);pCNl-d1、pCNl-d2表达的荧光素酶活性与pCMVNCRluc差异无显著性(P＞0.05).结论:HCV 5NCR的5'端20nt和43nt序列缺失不影响它的翻译启动活性.     

人乳铁蛋白cDNA 基因乳腺表达载体的构建与鉴定

为了构建人乳铁蛋白基因 (hLF) 的乳腺表达载体并验证其在乳腺细胞中的表达情况,本载体以山羊β-casein基因上游包括启动子、外显子1、内含子1、部分外显子2作为5′端调控序列,下游包括部分外显子7、内含子7、外显子8、内含子8、外显子9及3′部分基因组片段作为3′端调控序列,长度分别为6.2 kb和7.1 kb,将hLF基因 (目的基因) 和Neo基因 (筛选标记) 分别插入到5′端调控序列和3′端调控序列的下游,构建成pBC1-hLF-Neo载体,其全长为25.348 kb。为了检测该载体的生物学     

NGF基因重组慢病毒载体的构建及其在人脐带血间充质干细胞的表达

目的:构建神经生长因子(NGF)的慢病毒表达载体,并观察其转染人脐带间充质干细胞后的表达情况。方法:采用实时定量PCR(RT-PCR)方法获取NGF基因编码片段,并将构建的慢病毒载体质粒与包装质粒和包膜质粒共转染293T细胞,包装生产慢病毒。应用相同滴度的慢病毒转导等量间充质干细胞(MSCs),观察转染后细胞的生长形态及生长曲线,再采用RT-PCR、Western Blot方法检测NGF m RNA、蛋白质的表达水平。结果:经PCR、酶切和测序结果证明成功构建NGF基因重组慢病毒载体。同时NGF基因重组慢病毒载体能够成功转染人脐带间充质干细胞,转染率达95.35%,转染后干细胞在NGF m RNA及蛋白质的表达方面较对照组明显升高,同时经倒置显微镜观察及生长曲线实验证实转染后干细胞的生长与对照组相比无明显差异。结论:重组NGF的慢病毒表达载体能够高效的转染人脐带间充质干细胞,基因转染后干细胞的增殖分化能力与未转染细胞差异无统计学意义,可作为一种高效的干细胞转染方法。     

人SDCT2β3'-非翻译区基因表达负调控序列对mRNA稳定性的影响

为探索人高亲和力钠离子依赖性二羧酸转运蛋白基因(high affinity sodium-dependent dicarboxylate transporter,SDCT2)3'端非翻译区是否在基因表达调控中起作用,首先通过生物信息学分析发现,在SDCT2β mRNA的3'端非翻译区内存在585 nt的Au富含区(AU-rich region,AUR),其中包括3个AU富含元件(AU-rich element,ARE),然后将SDCT213的AU富含区DNA片段插入报告基因GFP表达载体pcDNA-GFP的下游,构建pcDNA-GFP-AUR表达载体并转染HEK293、HKC和LLC-PK1细胞系,用Western blot和流式细胞仪检测细胞中GFP的表达水平.结果显示,SDCT2β的AU富含区序列可显著降低GFP的表达水平(P＜0.01).利用放线菌素D阻断RNA转录后,每隔2 h从稳定转染的HEK293细胞中提取总RNA,用RNA印迹分析GFP mRNA的稳定性.结果显示GFP-AUR mRNA较GFP mRNA不稳定.这些结果提示,在SDCT2β3'非翻译区的AU富含区内存在基因表达负调控区,该区可降低mRNA的稳定性、促进mRNA的降解,从而在转录后水平调控基因的表达.