中国狂犬病疫苗生产株CTN-1全基因序列分析

本文首次对我国现行狂犬病疫苗生产用毒株CTN-1进行全长基因组序列测定和分析,为CTN-1疫苗在我国实际应用中的优势提供理论基础。利用RT-PCR方法分段扩增CTN-1全基因组序列,随后将PCR产物克隆到T载体、测序、拼接,用MegAlign软件比较CTN-1全基因组序列与国内外狂犬病疫苗株和街毒株全基因组序列的同源性;再以糖蛋白(G)基因为模板,用ClustalX和MEGA4软件进行系统进化分析。测序结果表明CTN-1全基因组序列的长度为11925nt(GenBank登录号FJ959397),序列分析表明CTN-1为基因Ⅰ型;CTN-1株全基因组序列与国内外狂犬病疫苗株和街毒株全基因组之间的同源性是81.5%～93.4%;与美国蝙蝠分离株SHBRV18的同源性最低,仅为81.5%;与新近从中国国内分离的野毒株HN10株的同源性最高,达93.4%。系统进化分析结果表明,CTN-1与国内不同地区大多数分离的狂犬病街毒株聚类于同一组内;而我国另一疫苗株aG株与国外疫苗株如Flury、PM、PV、ERA、RC-HL和个别中国街毒株分在另一组内。G基因氨基酸对比也显示CTN-1株与国内大多数街毒株的同源性高于其他疫苗株,结果说明CTN-1株较其他疫苗株病毒更适合制备用于预防中国狂犬病的灭活疫苗。     

C亚型SHIVCHN19P4强毒株在中国恒河猴体内的传代研究

目的研究C亚型SHIVCHN19P4强毒株在中国恒河猴体内传代中病毒学和免疫学等反应的变化特点,分离制备SHIVCHN19P4中国恒河猴传代适应株病毒。方法选择4只健康成年恒河猴,其中两只经后肢静脉感染SHIVCHN19P4病毒,60 d后,分别采集EDTA抗凝全血静脉途径传代至另两只猴,使用流式细胞术、PCR、结合抗体检测和序列分析等方法研究传代动物病毒学、免疫学和序列变异特点。选择性从传代动物感染急性期外周血中分离PBMC,CD8＋T细胞敲除后与正常PBMC共培养分离病毒。结果 4只传代动物均获得系统性感染,且传代后病毒毒力明显增强,序列分析发现SHIVCHN19P4病毒序列在传代过程中发生适应性改变;同时,成功分离制备SHIVCHN19P4传代适应性病毒株。结论 SHIVCHN19P4在中国恒河猴体内适应性传代研究为进一步建立C亚型SHIV强毒株/SAIDS模型奠定了良好的实验基础,为研究C亚型HIV-1流行株致病特点以及预防性黏膜疫苗和杀微生物的有效性评价提供了数据支持。     

中国急性弛缓性麻痹(AFP)病例中脊髓灰质炎病毒疫苗株VP1区基因变异的研究

为研究中国急性弛缓性麻痹(AFP)病例中脊髓灰质炎(简称脊灰)病毒分离株的分子特征,为中国继续维持"无脊灰野毒状态"提供理论依据,对2002年所有省级疾病预防控制中心送检的脊灰分离株,用PCR-RFLP法及ELISA法进行型内鉴定.用PCR-RFLP法筛查出与疫苗株相比有异常酶切图谱的毒株共24株,其中Ⅰ型毒株1株,Ⅱ型毒株21株,Ⅲ型毒株2株;用ELISA法筛查出与疫苗株相比有不同的抗原抗体反应的毒株共22株,其中Ⅰ型毒株7株,Ⅱ型毒株4株,Ⅲ型毒株11株,在7株Ⅰ型毒株中有3株为非疫苗类似株(NSL),其余为双反应毒株(DRV).随后对这46株毒株进行了全VP1区的基因序列分析.结果表明:2002年脊灰分离株都是疫苗株或疫苗衍生株,没有发现野毒株,中国继续保持着"无脊灰野毒状态";口服减毒活疫苗(OPV)株与其它野毒株在稳定性性质方面是类似的,即通常是不稳定的,在人体肠道内有很强的选择性;在人体肠道内,病毒复制产生的基因变异导致毒力升高,是引起疫苗相关麻痹病例(VAPP)的重要原因,但宿主本身的因素也有很大的作用;在局部地区有疫苗株的循环或脊灰疫苗衍生株(VDPV)的存在;最终消除疫苗株引起的AFP病例可能还需要脊灰灭活疫苗(IPV)的介入.     

狂犬病病毒CTN-1V株在人二倍体细胞Walvax-2株的适应传代

目的建立狂犬病病毒固定毒CTN-1V株在人二倍体细胞Walvax-2株上的传代适应株。方法用狂犬病病毒固定毒CTN-1V株经昆明小鼠鼠脑回传后的病毒接种Walvax-2细胞,连续传代,检测各代次病毒的滴度及免疫原性。结果 CTN-1V株能较好地适应Walvax-2细胞,通过连续带毒传代至第7代,病毒滴度可达6.78 lg LD50/mL,并在第10~15代内滴度维持在7.0 lg LD50/mL以上,15~30代滴度稳定在7.0 lg LD50/mL左右。以15代适应毒株CTN-1V-HDC P15制备的疫苗原液,各项指标均符合《中华人民共和国药典》三部(2010版)的要求,疫苗效力在6.0IU/剂以上。结论所获人胚肺二倍体细胞Walvax-2株传代适应狂犬病毒固定毒株CTN-1V-HDC可用于人用狂犬病疫苗的生产开发。     

仙台病毒黑龙江省地方株的分离与鉴定

目的自本省普通级实验动物中分离并鉴定出仙台病毒地方毒株,为建立仙台病毒血清抗体检测方法奠定基础。方法通过鸡胚尿囊腔传代自普通级小鼠肺脏分离病毒,经血凝实验、血凝阻断实验和结构基因序列测定对分离得到的病毒进行鉴定;大量繁殖病毒并通过蔗糖密度梯度离心纯化,免疫动物制备阳性血清,用标准试剂盒检测阳性血清效价。结果自150份小鼠肺脏分离到2株有血凝性的病毒,经形态学、血清学和结构基因序列测定鉴定为仙台病毒,命名为SV-HLJ。SV-HLJ与标准毒株Fushimi核蛋白基因(N)的核苷酸、氨基酸同源性分别为99·6%和99·0%。结论分离并鉴定出了仙台病毒黑龙江省地方毒株,为检测试剂盒的研制奠定了基础。     

北京地区猫疱疹病毒Ⅰ型的分离及鉴定

了解北京地区猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)毒株特点,为猫疱疹病毒Ⅰ型的进一步研究及对猫的感染预防控制奠定基础。经特异性PCR检测为FHV-1阳性临床猫眼鼻拭子,经过处理,接种CRFK细胞,通过细胞培养分离病毒。通过间接免疫荧光试验、电镜形态观察、病毒毒力测定及基因序列分析等对分离株进行鉴定。PCR检测FHV-1阳性的14只猫眼鼻拭子接种CRFK细胞,有6只猫样本能使CRFK细胞发生圆缩、拉网集聚等病变;6个样本接种的CRFK病变细胞滴片进行免疫荧光试验,均产生绿色荧光反应;经传代培养,有5株分离株能够稳定传代,其中有2株弱毒,3株强毒;电镜下5株分离株均可见直径100~160nm的球型病毒粒子;5株分离株与FHV-1标准株C-27及2个不同公司来源疫苗株gB、gD基因核苷酸比较同源性均为99%以上。实验室成功分离保存5株能稳定传代的FHV-1毒株,5株分离株与FHV-1标准株及2个疫苗株亲缘关系很近。     

EV71小鼠适应株制备及体内外感染特点

目的用1日龄ICR小鼠传代制备EV71小鼠适应株,研究EV71亲代株与小鼠适应株的体内外感染特点,建立EV71感染ICR小鼠动物模型,为病毒疫苗和抗病毒药物的研究提供实用的动物评价工具。方法用1日龄ICR小鼠进行EV71病毒(Fuyang-0805)的传代,得到小鼠传代株。以一定浓度亲代株和传代株病毒分别接种RD、Vero、SY5Y、Caco-2四种细胞,定量方法检测各时间点不同毒株在四种细胞上的复制数量,CCK8方法测定各时间点细胞的存活率;同时,两毒株分别腹腔注射感染1日龄小鼠,定期安乐死动物,采集肺、小肠、骨骼肌、大脑四种器官组织,进行动物体内病毒半定量和定量分析,同时进行各器官组织病理学观察、免疫组织化学鉴定。结果与亲代毒株相比较,小鼠传代株(EV71-MMP4)表现出更强的肌肉来源细胞嗜性与毒性;同时,两毒株腹腔注射感染1日龄小鼠后,EV71-MMP4感染的小鼠体重增长较正常小鼠体重增长缓慢;半定量和定量RT-PCR显示,在小鼠肌肉中的病毒载量于感染后1d和5d达到高峰。EV71-MMP4感染组感染率较高、病毒组织分布较广、感染持续性较好、病毒载量较高,高剂量病毒感染后小鼠小肠、心肌和骨骼肌可观察到细胞空泡变性、淋巴细胞浸润等病理变化。免疫组织化学显示感染后小鼠骨骼肌有EV71病毒特异分布。结论阜阳EV71小鼠适应株表现出较亲代毒株更好的小鼠易感性、细胞毒性,所建立的动物模型可用于EV71病毒致病机制、感染特点的研究和病毒疫苗及药物的评价。     

人轮状病毒的细胞培养分离

用CV-1细胞从急性腹泻病儿7份粪便标本中直接分离出4株人轮状病毒(HRV),并适应传代14代。感染细胞出现特征性细胞病变,经电镜、ELISA、免疫荧光染色及病毒RNA电泳等试验证实HRV毒株在CV-1细胞中的繁殖及抗原特异性。病毒滴度为10~(6.0)TCID_(60)。分离的4株HRV毒株均为RNA电泳型长型,经CV-1细胞传7～14代后,RNA图型与原粪样相比未见变异。     

甲型H1N1流感监测及其HA1基因特性分析,以2013~2014年新余市为例

因HA基因的头部重链区(HA1)是流感病毒的抗原位点和受体结合位点,所以了解流感病毒的HA1基因特性可以评估当前WHO推荐的疫苗株的预防效果。本文选取新余市2013~2014年通过狗肾传代细胞(MDCK)培养分离到的H1N1流感毒株12株,提取病毒RNA,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增HA1基因片段。对序列分析发现2013~2014年新余市甲型H1N1流感病毒HA1基因序列与疫苗推荐株有较高的同源性,核苷酸同源性97.9%~98.5%。2013年的6株毒株HA1区与疫苗株比较,氨基酸变异位点7~11个,其中3株有2个变异位点在不同的抗原决定簇区。而2014年毒株单独集中在进化树的一支。以上提示,目前流感疫苗对2014年的流感人群仍有保护作用,对2013年的部分流行的H1N1预防效果有限;甲型H1N1爆发流行的可能性很大,应加强防控。     

水痘-带状疱疹病毒分离和鉴定

本文报告了用7份水痘或带状疱疹病人的皮肤病变水泡液,在人胚肺二倍体细胞(2BS)中培养传代,分离到7株病毒分离物,第一株是由带状疱疹病例分离到的,经细胞病变、核内包涵体和电镜形态学观察,认为此分离物属于疱疹病毒科成员;经血清学鉴定,证实为水痘-带状疱疹病毒(VZV),其宿主范围与疱疹病毒(HSV)不同,余6株分离物经ELISA、IFA及CF血清学试验鉴定均为VZV。     

浙江省麻疹病毒分离株的基因特性与免疫原性研究

为了研究浙江省1999～2003年麻疹病毒分离株的抗原性变化以及基因特性,阐明其基因特性与麻疹流行的关系,以及抗原性变化对疫苗免疫效果的影响。我们从麻疹患者含漱液中分离麻疹病毒株,制备大鼠免疫血清,与疫苗株沪191和Edmonston株等进行交叉中和试验,测定各毒株之间抗原比;并采集儿童麻疹疫苗免疫前后血清,分别测定其对不同毒株的中和抗体滴度;采用RT-PCR法扩增麻疹毒株血凝素蛋白(H)及核蛋白(N)基因,进行核苷酸序列测定。结果浙江99-1和浙江02-2株与沪191株之间的抗原比分别为3.0和7.3;儿童免疫后血清对浙江02-2株的麻疹中和抗体平均几何滴度(GMT)为15.03,明显低于沪191疫苗株(GMT为68.12);浙江省1999～2003年麻疹分离株之间,H基因氨基酸同源性为99.8%,N基因氨基酸同源性为98.5%～100.0%;与沪191疫苗株的H基因和N基因相比较,分离株与其在氨基酸水平上同源性分别为95.5%～95.7%和95.9%～96.3%。从基因进化树显示,1999～2003年浙江省分离到的麻疹毒株属于H1基因型,但与疫苗株沪191在抗原性和基因特性上已存在明显的差异。     

山东恙虫病立克次体弱毒株分离方法研究

恙虫病立克次体（Rt）弱毒株分离问题一直是较难解决的问题。分离过程中主要采取了以下措施：选择适当的病例;降低小鼠免疫力;严格掌握传代时间（接种后12～14d）;所有传代小鼠均作腹膜涂片及肝、脾、肾印片以免漏检;严格控制动物饲养室温度等。结果成功地从恙虫病人全血、3种鼠类、4种恙螨中分离到38株Rt,成功率在25％～100％。毒株接种小鼠后可引起弓背、耸毛、发烧等症状,并引起肝肿大及脾肿大（2～5倍）。     

浙江省麻疹病毒分离株的基因特性与免疫原性研究

为了研究浙江省1999～2003年麻疹病毒分离株的抗原性变化以及基因特性,阐明其基因特性与麻疹流行的关系,以及抗原性变化对疫苗免疫效果的影响.我们从麻疹患者含漱液中分离麻疹病毒株,制备大鼠免疫血清,与疫苗株沪191和Edmonston株等进行交叉中和试验,测定各毒株之间抗原比;并采集儿童麻疹疫苗免疫前后血清,分别测定其对不同毒株的中和抗体滴度;采用RT-PCR法扩增麻疹毒株血凝素蛋白(H)及核蛋白(N)基因,进行核苷酸序列测定.结果浙江99-1和浙江02-2株与沪191株之间的抗原比分别为3.0和7.3;儿童免疫后血清对浙江02-2株的麻疹中和抗体平均几何滴度(GMT)为15.03,明显低于沪191疫苗株(GMT为68.12);浙江省1999～2003年麻疹分离株之间,H基因氨基酸同源性为99.8%,N基因氨基酸同源性为98.5%～100.0%;与沪191疫苗株的H基因和N基因相比较,分离株与其在氨基酸水平上同源性分别为95.5%～95.7%和95.9%～96.3%.从基因进化树显示,1999～2003年浙江省分离到的麻疹毒株属于H1基因型,但与疫苗株沪191在抗原性和基因特性上已存在明显的差异.     

用金黄仓鼠肾细胞长期传代培养弓形体株

弓形体株常规用小白鼠传代保存,强毒株每3—4天即需传代,动物死亡又容易使虫株丢失。多年来,我们用金黄仓鼠(Mesocricetus auratus)肾细胞培养保存了2株弓形体,并结合对其在体外细胞长期传代后的生物学特性作了相应观察,现简报如下:     

7例水痘患者水痘带状疱疹病毒的分离与鉴定分析

目的对7例临床水痘患者的疱疹液样本,进行水痘带状疱疹病毒(varicella-herpes zoster virus,VZV)的分离及鉴定分析。方法对7例临床水痘患者的疱疹液,用2BS细胞进行病毒分离及病毒滴度检测;用特异性引物分别对病毒分离株及疫苗株(Oka株)的ORF68、ORF54、ORF38进行聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)扩增及测序,用DNAMAN软件对病毒分离株的ORF68序列与Dumas株序列进行比对鉴定,并对病毒分离株和Oka株的ORF54、ORF38进行限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)分析。结果从7例临床水痘患者的疱疹液样本中,分离到4株VZV病毒株;病毒分离株的细胞病变(cytopathic effect,CPE)及病毒滴度随传代次数的增加而增强;4株病毒分离株的ORF68序列与Dumas株完全一致;ORF54、ORF38的RFLP结果显示,4株病毒分离株均为BglⅠ+PstⅠ+型,Oka株为BglⅠ+PstⅠ-型。结论成功分离的4株病毒分离株均为VZV野生毒株。     

流行性乙型脑炎病毒减毒株免疫仔猪血清学反应和流行病学保护

1. 用乙脑病毒的减毒株C株和强毒株P,株免疫仔猪,接种P,株后48和72小时从仔猪血液中可检出病毒,用C株免疫的动物,检查病毒血症全属阴性。 2. 免疫前后检查和比较血清抗体的结果是：用P3株免疫的两只仔猪,免疫后抗体比免疫前明显增长;用C株疫苗10毫升和1.0毫升各免疫6只的两组动物中,免疫后分别有5只和2只抗体明显增长;接受灭活疫苗的6只动物,抗体全未增长。 3. 比较各组动物免疫前后血清抗体水平(见表2)还发现,对照组和灭活疫苗组内各有两只、C株疫苗10毫升免疫组内有一只动物,免疫后较免疫前的抗体水平反而有所降低。此种降低显然是母体被动抗体水平随年龄增大而下降的表现。 4. 在乙脑流行季节,从各组动物体内连续采取血管末梢血液,分离自然界散布的野生乙脑病毒,以观察流行病学保护效果。从对照组动物10只中有5只、灭活疫苗组6只中的2只分离到了野生乙脑病毒;而在用c株免疫的两组共12只,用P|株免疫的2只中,没有得到乙脑病毒。这些数据可以说明,C株病毒可用于免疫仔猪以防止自然界乙脑病毒造成的病毒血症,使用剂量小到1．0毫升仍有效。     

金黄仓鼠的繁育

金黄仓鼠(Mesocricetus aurafus)又称金黄色地鼠(以下简称地鼠)是一种有价值的实验动物。国内一些单位和部门已应用于病毒、立克次氏体、螺旋体及原虫的分离、繁殖、传代保存或流行性乙型脑炎疫苗等生物制品的生产。证实了它具有感受性广、抗原性强、病变典型等待     

老虎感染猫传染性鼻-结膜炎病毒的研究

用猫肾传代细胞从发病虎的病料中分到了一株杯状病毒粒子样病毒.该病毒大小为35～39nm、无囊膜、在胞浆中病毒前体呈晶格状排列,抗乙醚、不能被 5-IUDR所抑制,能被来源于标准疫苗的猫传染性鼻-结膜炎病毒(或杯状病毒Feline calicivirus, FCV)抗血清所中和,人工感染猫出现典型的FCV感染症状.RT-PCR能扩增出与设计值相符的电泳带,PC R产物直接测序结果与Genebank发表的FCV序列比较,具有较高的同源性.系统鉴定证明所分离的这株病毒为FCV强毒株,从老虎中分到FCV在世界上尚属首次报道.     

重组细胞高产型H3N2猪流感病毒株的拯救

为拯救出一株能够在动物传代细胞中高水平复制的H3N2亚型猪流感疫苗株,利用反向遗传操作技术,将A/Goose/Dalian/3/01(H9N2)毒株的PB1、PA、NP、M、NS基因和A/PR/8/34毒株的PB2基因作为内部基因与猪流感病毒A/Swine/Henan/S4/01(H3N2)毒株的HA、NA基因进行重组,成功拯救出了具有高度细胞适应性毒株rH3N2株,该毒株接毒MDCK细胞60h后,血凝价可以达到1∶512,表明该毒株具有高度适应细胞繁殖特性,为H3N2亚型猪流感病毒细胞培养型疫苗的研制奠定了基础。     

轮状病毒基因重配LH9株(G4型)传代稳定性研究

对兰州生物制品研究所自行构建的轮状病毒基因重配株G4型LH9株在Vero细胞中传代的稳定性进行研究。将基因重配LH9毒株接种于Vero细胞上从7代传至17代,经电镜检查、病毒滴度测定、病毒基因组RNA电泳图谱分析、基因序列测定分析、轮状病毒型别鉴定及其它相关检定,结果均符合药典要求。证实该毒株为A群G4P〔12〕型轮状病毒,在Vero细胞传代中具有良好的稳定性,为疫苗研制提供安全有效的依据。