猪口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体间接ELISA方法的建立

将口蹄疫病毒(FMDV)的VP1基因,通过pPROex-HT表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达,获得大小为31ku的融合蛋白,Western blot检测证实表达的该蛋白具有良好的生物学活性。以纯化的融合蛋白为抗原建立了猪FMDV VP1蛋白间接ELISA检测方法。通过对80份田间血清样品的检测表明,该方法与FMDV液相阻断ELISA（国标试剂盒）的总符合率为96.25%,表明建立的VP1蛋白间接ELISA检测方法具有很好的特异性和敏感性。     

猪O型口蹄疫病毒抗体化学发光酶联免疫检测方法的建立

表达并纯化猪O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1重组蛋白作为检测抗原,建立了一种快速检测猪O型口蹄疫病毒抗体的化学发光酶联免疫(CLEIA)检测方法。建立的VP1-CLEIA方法特异性为100%,板内变异系数在1.10%–6.70%之间,板间变异系数在0.66%–4.80%之间,具有较好的特异性和重复性,且灵敏度高于ELISA方法。通过对山东、辽宁、河北地区采集的250份临床血清的检测表明,该方法与间接ELISA试剂盒的符合率为93.50%,与液相阻断ELISA试剂盒的符合率为94.00%,表明本次建立的VP1-CLEIA检测方法可以用于猪O型FMDV感染或疫苗免疫后抗体水平检测。     

鸭病毒性肝炎病毒VP1基因表达及其抗体检测ELISA方法的建立

[目的]研究DHV VP1基因在大肠杆菌中的表达,并以纯化的重组蛋白为抗原建立鸭病毒性肝炎抗体检测ELISA方法.[方法]采用RT-PCR技术,扩增VP1基因,与Pmd18-T载体进行连接,构建DHV VP1基因克隆重组质粒.然后定向插入到Pet-32a( )表达载体,筛选原核表达载体Pet-32a-VP1,进行ITPG诱导表达分析.以纯化的重组蛋白为抗原建立间接ELISA方法并初步应用于临床.[结果]DHV VP1基因可在大肠杆菌中稳定、高效地表达.Western blot检测表明,表达的重组蛋白能与鸭肝炎阳性血清发生特异性反应.确定间接ELISA方法的抗原最佳包被浓度为5 ug/孔,血清最佳稀释度为1:100,临界值为OD450值≥0.302,建立的ELISA方法具有较好的敏感性、特异性和重复性.通过对80份血清样品的检测表明,该方法与中和试验的符合率为97.5%,初步临床应用结果表明该方法可用于雏鸭母源抗体和免疫后抗体的消长变化的检测.[结论]以大肠杆菌表达的DHV VP1重组蛋白为抗原建立的间接ELISA方法可用于鸭病毒性肝炎抗体的检测.     

鸭甲肝病毒1型和3型间接ELISA方法的建立与应用

【目的】研究鸭甲肝病毒(Duck hepatitis A virus,DHAV)1型VP3和3型VP1串联基因在大肠杆菌中的表达,并以纯化的重组蛋白为抗原建立鸭病毒性肝炎抗体检测的间接ELISA方法。【方法】设计2对特异性引物,提取鸭甲肝病毒1型(DHAV-1)和3型(DHAV-3)的RNA,分别RT-PCR扩增得到714bp的DHAV-1VP3和720bp的DHAV-3 VP1基因,并克隆至p MD18-T载体中,然后依次将DHAV-1 VP3和DHAV-3 VP1定向插入p ET-32a(+)表达载体,获得重组表达载体p ET-1VP3-3VP1,进行IPTG(Isopropyl-beta-D-1-thiogalactopyranoside)诱导表达分析,以纯化的重组蛋白为抗原建立间接ELISA方法并应用于临床。【结果】经IPTG诱导表达,在大肠杆菌中可稳定、高效地表达DHAV-1VP3-3VP1蛋白。Western blot检测结果表明,表达的重组蛋白与DHAV-1和DHAV-3阳性血清均能发生特异性反应。确定间接ELISA方法的抗原最佳包被浓度为1.0μg/孔,血清最佳稀释度为1∶200,临界值为OD6 50值≥0.38,建立的间接ELISA方法具有较好的敏感性、特异性和重复性。该方法与中和试验分别检测DHAV-3阳性血清,两种方法的符合率各为96.3%和96.7%;初步临床应用结果表明该方法可用于雏鸭母源抗体和免疫后抗体的消长变化的检测。【结论】以大肠杆菌表达的DHAV-1VP3-3VP1重组蛋白建立的间接ELISA方法可用于DHAV-1和DHAV-3抗体的检测。     

口蹄疫病毒VP1基因转化马铃薯及其块茎专一性表达

报道了FMDV VP1基因与马铃薯块茎专一性表达class Ipatatin基因5′区融合,经农杆菌介导导入马铃薯植株,PCR、RT-PCR证实了其整合及转录表达。ELISA结果进一步表明,VP1在转基因马铃薯块茎中具有免疫活性。为探讨在马铃薯块茎中高表达VP1蛋白及进一步开发其作为FMDV口服疫苗生物反应器奠定基础。     

O型口蹄疫病毒VP1 T细胞、B细胞表位双拷贝基因与大肠杆菌LTB、STⅠ肠毒素基因融合表达产物的免疫应答

合成O型口蹄疫病毒VP1蛋白中与细胞免疫(21～40表位肽)及体液免疫(141～160表位肽)相关的基因序列2020VP1,运用基因工程技术构建了含有肠毒素大肠杆菌LTB、STⅠ基因及双拷贝2020VP1的融合表达载体r2020-B-2020-STⅠ,转化宿主菌 BL21(DE3) RIL后的表达产物经SDS-PAGE分析,结果显示重组融合蛋白的分子量约为45 kDa,表达量较高.ELISA实验结果显示,融合蛋白能与霍乱毒素(cholera toxin)CTB抗体特异结合.动物实验表明,融合蛋白能够诱发兔体产生较强的FMDV中和抗体,免疫豚鼠在低浓度FMDV刺激下能够产生特异性T淋巴细胞增殖反应,说明融合蛋白能诱导机体产生FMDV特异性细胞及体液免疫反应;同时,融合蛋白免疫雌鼠能够抵抗大肠杆菌强毒株攻击,免疫兔体能够产生STⅠ中和抗体,且融合蛋白不具STⅠ毒性,证明融合蛋白具有良好的LTB、STⅠ免疫原性.实验结果表明,此融合蛋白具有开发成为口蹄疫及肠毒素腹泻联合疫苗的应用价值.     

O型口蹄疫病毒VP1 T细胞、B细胞表位双拷贝基因与大肠杆菌LTB、STI肠毒素基因融合表达产物的免疫应答

合成O型口蹄疫病毒VP1蛋白中与细胞免疫（21～40表位肽）及体液免疫（141～160表位肽）相关的基因序列2020VP1,运用基因工程技术构建了含有肠毒素大肠杆菌LTB、STI基因及双拷贝2020VP1的融合表达载体r2020-B-2020-STI,转化宿主菌BL21(DE3)RIL后的表达产物经SDS-PAGE分析,结果显示重组融合蛋白的分子量约为45kDa,表达量较高。ELISA实验结果显示,融合蛋白能与霍乱毒素（choleratoxin）CTB抗体特异结合。动物实验表明,融合蛋白能够诱发兔体产生较强的FMDV中和抗体,免疫豚鼠在低浓度FMDV刺激下能够产生特异性T淋巴细胞增殖反应,说明融合蛋白能诱导机体产生FMDV特异性细胞及体液免疫反应;同时,融合蛋白免疫雌鼠能够抵抗大肠杆菌强毒株攻击,免疫兔体能够产生STI中和抗体,且融合蛋白不具STI毒性,证明融合蛋白具有良好的LTB、STI免疫原性。实验结果表明,此融合蛋白具有开发成为口蹄疫及肠毒素腹泻联合疫苗的应用价值。     

口蹄疫病毒P1基因在大肠杆菌中的高效表达及其生物活性的初步分析

将口蹄疫病毒 (FMDV)结构蛋白基因P1的完整cDNA序列插入原核表达性载体pGEX KG中 ,使P1基因与GST融合 ,获得融合表达质粒pKG P1,转化E .coliBL₂₁ (DE3) ,经IPTG诱导 ,SDS PADE结果表明GST P1融合蛋白获得高效表达 ,Western blot检测证实表达的融合蛋白具有免疫学活性 ,表达产物主要存在于细菌裂解液上清中。进一步采用GST纯化试剂盒纯化P1蛋白并作为诊断抗原 ,建立了P1 ELISA诊断方法 ,与FMD间接血凝 (IHA)检测方法平行检测 86 4份血清样品 ,总的符合率达87%。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3A、3B和2C基因的表达及产物纯化与活性检测

[目的]口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白(NSP)3A、3B和2C基因的表达及产物纯化与活性检测.[方法]利用原核表达系统表达了FMDV NSP 3A、3B和富含B细胞抗原位点序列的2C蛋白.利用高浓度尿素裂解包涵体,采用稀释法和氧化型、还原型谷胱甘肽系统相结合方法对2C蛋白进行复性.用金属鳌合亲合层析的方法对表达的FMDV NSP 3A、3B和2C进行纯化.采用ELISA方法对比检测了3种纯化蛋白在检测羊血清NSP抗体的效果.[结果]检测得知3A和3B为可溶性表达蛋白,2C以包涵体形式表达.通过Western-blot分析,表明纯化后蛋白能与FMDV感染动物血清发生特异性反应.纯化的3A、3B和复性后的2C融合蛋白与3ABC抗原的检测结果具有很高的符合性.[结论]该研究为建立鉴别FMDV自然感染动物和灭活疫苗免疫动物的酶联免疫电转移印迹技术(EITB)提供了所需的材料.     

猪嵴病毒结构蛋白VP0与VP1原核表达及间接ELISA方法的建立

分别建立基于猪嵴病毒(PKV)结构蛋白VP0与VP1的间接ELISA检测方法。对PKV结构蛋白VP0与VP1的基因进行合成并连接至原核表达载体pET-32a后,转入感受态细胞BL21中,用IPTG诱导表达的重组蛋白经Ni柱纯化后,分别以重组蛋白pET-32a-VP0与pET-32a-VP1作为包被抗原,采用棋盘滴定法建立两种间接ELISA检测方法,并进行重复性、敏感性、特异性实验和临床检测。结果显示重组蛋白pET-32a-VP0与pET-32a-VP1抗原的最佳包被浓度分别为2 mg/mL和2.5 mg/mL,反应条件均为37℃、1 h;封闭液最佳条件为5%脱脂乳,37℃、2 h;血清最佳孵育条件为1∶200,37℃、1 h;二抗最佳孵育条件分别为1∶20 000和1∶15 000,37℃、1 h;最佳显色时间为10 min,两种间接ELISA检测方法临界值分别为0.306和0.277。试验结果表明本研究成功建立了能够有效检测PKV血清特异性抗体的间接ELISA方法,且方法具有重复性好、敏感性高、特异性强、稳定性好等特点,对今后PKV的临床诊断及抗体检测试剂盒的开发奠定了重要基础。     

B cell epitopes within VP1 of type O foot-and-mouth disease virus for detection of viral antibodies

In this study, the coding region of type O FMDV capsid protein VP1 and a series of codon optimized DNA sequences coding for VP1 amino acid residues 141–160 (epitope1), tandem repeat 200–213 (epitope2 (+2)) and the combination of two epitopes (epitope1–2) was genetically cloned into the prokaryotic expression vector pP_ROExHTb and pGEX4T-1, respectively. VP1 and the fused epitopes GST-E1, GST-E2 (+2) and GST-E1-2 were successfully solubly expressed in the cytoplasm of Escherichia coli and Western blot analysis demonstrated they retained antigenicity. Indirect VP1-ELISA and epitope ELISAs were subsequently developed to screen a panel of 80 field pig sera using LPB-ELISA as a standard test. For VP1-ELISA and all the epitope ELISAs, there were clear distinctions between the FMDV-positive and the FMDV-negative samples. Cross-reactions with pig sera positive to the viruses of swine vesicular disease virus that produce clinically indistinguishable syndromes in pigs or guinea pig antisera to FMDV strains of type A, C and Asia1 did not occur. The relative sensitivity and specificity for the GST-E1 ELISA, GST-E2 (+2), GST-E1-2 ELISA and VP1-ELISA in comparison with LPB-ELISA were 93.3% and 85.0%, 95.0% and 90%, 100% and 81.8%, 96.6% and 80.9% respectively. This study shows the potential use of the aforementioned epitopes as alternatives to the complex antigens used in current detection for antibody to FMDV structural proteins.     

Foot-and-mouth disease virus VP1 protein fused with cholera toxin B subunit expressed in Chlamydomonas reinhardtii chloroplast

A Chlamydomonas reinhardtii chloroplast expression vector, pACTBVP1, containing the fusion of the foot and mouth disease virus (FMDV) VP1 gene and the cholera toxin B subunit (CTB) gene was constructed and transfered to the chloroplast genome of C. reinhardtii by the biolistic method. The transformants were identified by PCR, Southern blot, Western blot and ELISA assays after selection on resistant medium and incubation in the dark. The CTBVP1 fusion protein was expressed in C. reinhardtii chloroplast and accounted for up to 3% of the total soluble protein. The fusion protein also retained both GM1-ganglioside binding affinity and antigenicity of the FMDV VP1 and CTB proteins. These experimental results support the possibility of using transgenic chloroplasts of green alga as a mucosal vaccine source.     

口蹄疫病毒VP1基因在番茄中的表达及转基因番茄对豚鼠诱导免疫保护

构建克隆有O型口蹄疫病毒China99株VP1基因的植物双元表达载体pBin438/VP1。通过农杆菌介导法转化番茄子叶,经卡那霉素抗性筛选,获得60株抗性植株。对抗性植株分别做PCR、RT-PCR检测目的基因的整合与转录,ELISA筛选约40%的卡那抗性植株阳性,分别提取两株ELISA和Western blot检测阳性的转基因番茄叶片蛋白与弗氏佐剂乳化,于0、15、30d经肌肉途径免疫豚鼠,第三次免疫后28d用100ID50的同源强毒攻击,根据豚鼠抗体水平的消长动态和免疫豚鼠抗强毒攻击的保护率进行转基因植物疫苗免疫原性的评估。结果表明,双元表达载体pBin438/VP1构建正确,PCR、RT-PCR结果证实口蹄疫病毒VP1基因已整合到番茄基因组并在转录水平表达,ELISA和Western blot检测重组蛋白能够与FMDV阳性血清反应。转基因番茄第三次免疫豚鼠后21d血清效价最高可达1∶64,攻毒后两组免疫豚鼠保护率分别达80%和40%,证明转基因番茄表达的VP1蛋白具有良好的免疫原性。     

犬细小病毒VP2基因在大肠杆菌中的高效可溶性表达

目的:犬细小病毒VP2基因在大肠杆菌中高效可溶性表达,进而为其特异单克隆抗体的制备奠定基础。方法:以犬细小病毒VP2基因重组质粒为模板,通过蛋白质分析软件PROSPECT分析,根据VP2基因所编码的氨基酸的亲水性和抗原性,把VP2基因分成不同区段,设计相应引物并扩增出相应片段。按常规方法克隆入pGEX-4T-2载体谷光甘肽-S-转移酶(GST)基因的下游,获得的重组质粒转化大肠杆菌BL21,用IPTG诱导目的基因片段的表达,经超声处理后SDS-PAGE电泳。所得可溶性蛋白再经间接ELISA、western Blotting鉴定。结果:K2和K4片段获得了良好的可溶性表达,其表达的GST融合蛋白的分子质量分别为38.3 KD和41 KD,ELISA、Western Blotting结果表明所表达的融合蛋白具有与CPV阳性抗体特异结合的良好抗原性。结论:犬细小病毒VP2基因在大肠杆菌中的获得了高效可溶性表达。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5-M在大肠杆菌中的融合表达及其ELISA诊断方法的建立

利用谷胱甘肽-S-转移酶 (GST)表达系统将猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)的ORF5和ORF6基因依序串联于GST下游 ,并在大肠杆菌中成功表达 ,获得了大小约为60kD的融合蛋白GST-GP5-M ,Westernblot检测证实表达的融合蛋白具有良好的生物学活性。以纯化的融合蛋白为抗原建立了猪繁殖与呼吸综合征P56-ELISA检测方法 ,与国外试剂盒IDEXX-ELISA总符合率为 94.1% ,表明建立的P56-ELISA检测方法具有很好的特异性和敏感性。进一步分析了P56-ELISA检测结果与血清中和试验的相关性 ,经回归函数分析 ,发现在临床送检猪血清中的抗融合蛋白GP5 M抗体水平 (OD_630nm)与中和抗体水平之间的相关性并不高。     

Formation of virus-like particles from O-type foot-and-mouth disease virus in insect cells using codon-optimized synthetic genes

A recombinant baculovirus was constructed to simultaneously express codon-optimized virus-like particles (VLP), A VP1-2A-VP3 and VP0 of serotype O foot-and-mouth disease virus (FMDV), from individual promoters. The target proteins were expressed in insect cells at high level, as shown by indirect sandwich ELISA; and the expressed VP1-2A-VP3 could autocatalytically be cleaved into the individual proteins, VP1-2A and VP3, as shown by Western-blot analyses. In addition, in the insect cells, the structural proteins, VP0, VP3 and VP1-2A, self-assembled into virus-like particles resembling the authentic FMDV particles. This information should prove useful for the development of more efficient VLP assembly using shorter genes.     

Detection of foot-and-mouth virus antibodies using a purified protein from the high-level expression of codon-optimized, foot-and-mouth disease virus complex epitopes in Escherichia coli

A codon optimized DNA sequence coding for foot-and-mouth disease virus (FMDV) capsid protein complex epitopes of VP1 amino acid residues 21-40, 135-160, and 200-213 was genetically fused to the C-terminal end of a glutathione-S-transferase (GST) gene in pGEX-6P-1 vector with the synonymous codons preferred by Escherichia coli . The gene was synthesized using PCR and subsequently expressed in E. coli producing an intracellular, soluble fusion protein that retained antigenicity associated with FMDV antibodies by western blot analysis. The chimera was purified from bacterial lysates by affinity chromatography and could be used in ELISA tests for antibodies against FMDV.     

FMDV VP1基因与HSP70基因在毕赤酵母中的融合表达及免疫特性

利用毕赤酵母系统对O型口蹄疫病毒VP1基因与结核杆菌HSP70基因进行融合表达,并检测此融合蛋白对小鼠细胞免疫和体液免疫的影响。将人工合成的O型口蹄疫病毒VP1基因与结核杆菌HSP70基因克隆入酵母表达载体pPICZαA中,以电穿孔法转化酵母菌X-33,用Zeocin YPDS平板筛选重组子,经甲醇诱导表达后,SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物。以皮下接种的方式给小鼠进行3次免疫,同时设两组对照,分别免疫PBS和常规灭活疫苗,然后通过MTT法和ELISA分别检测淋巴细胞的增殖情况和抗体水平。结果表明融合蛋白既能诱导细胞免疫应答又能诱导体液免疫应答,其诱导产生的抗体水平略低于常规灭活疫苗,而细胞免疫水平则高于后者。