紫杉醇合成关键酶BAPT基因的克隆及原核表达

目的:克隆曼地亚红豆杉紫杉醇生物合成途径中的关键酶3-氨基-3-苯基丙酰转移酶(3-amino-3-phenylpropanoyltrans-ferase,BAPT)基因,并在大肠杆菌中表达.方法:首先提取曼地亚红豆杉细胞的总RNA,反转录获得其sscDNA,并以其为模板扩增BAPT酶的基因,然后将其与原核表达载体pET32a(+)连接,构建重组质粒pET32a(+)-BAPT,并将重组质粒转入E.coli BL21宿主中诱导表达.结果:扩增获得1338 bp的BAPT基因序列,成功构建了原核表达质粒pET32a(+)-BAPT,并在E.coli BL21中实现高效表达.结论:BAPT基因表达产物的分子量约为51 kDa,与预期大小一致.该研究为进一步分析曼地亚红豆杉BAPT酶的酶学特性奠定了基础.     

APOBEC3G蛋白的原核表达及纯化

目的：原核表达重组APOBEC3G蛋白,为其功能及免疫原性研究奠定基础。方法：提取H9细胞全细胞基因组RNA,通过RT-PCR获得目的基因,经纯化、酶切后克隆到原核表达载体pET32a中,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株获得表达工程菌株,并对表达条件和纯化条件进行优化;利用Western Blot分析鉴定目的蛋白。结果：构建了APOBEC3G蛋白的原核表达载体Apo-His-pET32a,并在大肠杆菌中获得高表达,目的蛋白以可溶性蛋白形式存在;经Ni-NTA亲和层析柱一步纯化,获得了高纯度的重组APOBEC3G蛋白,蛋白浓度可达1．2mg／mL;Westem Blot显示获得了目的蛋白。结论：在原核表达系统中表达、纯化了可溶性APOBEC3G蛋白,为进一步对其进行免疫原性和功能研究奠定了基础。     

炭疽芽孢杆菌EA1蛋白的融合表达和纯化

目的：原核表达重组炭疽芽孢杆菌EA1蛋白。方法：用PCR方法从炭疽芽孢杆菌A16R疫苗株染色体中扩增编码EA1蛋白的eag基因序列,经过纯化、酶切后克隆到含有GST标签的原核表达载体pGEX-6P-2中,构建重组载体pGEX-EA1;将空载体（作为对照）、重组载体转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株获得表达工程菌株,对其表达和纯化条件进行优化;利用Western印迹检测融合蛋白的表达。结果：构建了EA1蛋白的融合表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达;经Glutathione Sepharose 4B纯化获得了EA1蛋白;Western印迹表明,此蛋白可与GST标签抗体反应。结论：在原核表达系统中表达并纯化得到EA1融合蛋白,为进一步对其进行功能研究奠定了基础。     

人Hepassocin的原核可溶性表达与纯化

目的：构建人Hepassocin的原核表达载体,可溶性表达并纯化得到高纯度的重组人Hepassocino方法：将人Hepassocin基因克隆到原核表达载体pET40b（＋）,转化大肠杆菌BL21（DE3）,于28℃经0．1mmol／LIPTG诱导6h,表达Ds-bC-Hepassocin融合蛋白,经镍柱纯化可溶性融合蛋白,用肠激酶切除融合蛋白的DsbC-His标签,再用镍柱纯化分离酶切后的Hepassocin,通过超滤进一步纯化并浓缩,用Western blot验证纯化后的Hepassocin。结果：构建了pET40b-Hepassocin原核表达载体,经诱导表达、亲和层析和肠激酶切除融合标签,获得了相对分子质量约32000的可溶性高纯度蛋白,Western blot鉴定证实该蛋白为不含融合标签的重组人Hepassocin。结论：实现了人Hepassocin的原核可溶性表达,通过纯化获得了较高纯度的重组人Hepassocin,为制备其单克隆抗体,进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

人vasorin蛋白的基因克隆、表达及纯化简

目的：克隆、表达人vasorin（VASN）蛋白。方法：利用PCR方法从HepG2细胞的cDNA中扩增获得目的基因,并插入带有6xHis标签的原核高效可溶性表达载体pET28a中,构建重组表达质粒pET28a-VASN,将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导后目的基因获得表达,对融合目的蛋白进行Ni^2＋金属螯合柱纯化。结果：内切酶鉴定及基因序列测定证实重组表达质粒构建成功;对目的蛋白进行了原核表达,SDS-PAGE显示相对分子质量为61x10^3的特异表达条带;Western印迹证实目的蛋白为VASN,且主要以包涵体形式存在;对经尿素变性的表达产物进行了亲和层析纯化,有利于以后的变性、复性过程。结论：获得了人VASN融合蛋白,为其进一步的生物学功能研究奠定了基础。     

重组斑马鱼 p8蛋白的原核表达及纯化

目的：在大肠杆菌中重组表达斑马鱼p8蛋白并纯化。方法：PCR扩增斑马鱼p8蛋白基因编码区,连接到带有6×His标签的原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-p8并转化大肠杆菌BL21（DE3）,用IPTG诱导表达;优化表达条件后用Ni^2＋柱纯化重组蛋白。结果：构建了pET-28a-p8重组质粒;目的蛋白在大肠杆菌中获得表达,亲和纯化后,SDS-PAGE显示相对分子质量为预期的12．8×10^3。结论：获得了斑马鱼p8融合蛋白,为其生物学功能研究奠定了基础。     

人VDAC2融合蛋白质粒构建及原核表达研究

目的：构建人VDAC2融合蛋白原核表达质粒并进行原核表达研究。方法：运用RT—PCR技术在培养的人HepG2．2．15细胞中钓取到目的基因VDAC2,连接至T载体上进行克隆,获得大量目的基因与原核表达载体pTrc—CKS、pMBP—P连接,构建重组融合蛋白表达质粒,转入大肠杆菌中DH5a,BL21（DE3）LySs中,IPTG诱导蛋白原核表达,表达产物经SDS—PAGE检测,分析蛋白表达情况。结果：成功构建了重组载体pTrc—CKS—VDAC2和pMBP—P-VDAC2,并在原核大肠杆菌中实现了重组融合蛋白的超量表达。结论：构建的两个人VDAC2的融合蛋白表达质粒在大肠杆菌中均得到超量表达。为进一步研究VDAC2蛋白奠定了基础。     

弗氏2a志贺氏菌2457T株YciD蛋白的融合表达和纯化

目的：原核表达重组弗氏2a志贺氏菌2457T株YciD蛋白,为其功能研究奠定基础。方法：用PCR方法从弗氏2a志贺氏菌2457T株染色体中扩增YciD蛋白编码序列,经过纯化、酶切后克隆到原核表达载体pET32a中,构建重组载体pET32a-yciD,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株获得工程菌株,对其表达和纯化条件进行优化;利用Western Blot检测融合蛋白的表达。结果：构建了YciD蛋白的融合表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达;经Ni-NTA亲和层析柱纯化获得了高纯度的YciD蛋白;Western Blot表明,此蛋白可与His标签抗体反应,表明获得了目的蛋白。结论：在原核表达系统中表达、纯化弗氏2a志贺氏菌2457T株YciD蛋白,为进一步对其进行功能研究奠定了基础。     

重组凝血酶敏感蛋白-1N端片段对CD36表达阴性的ECV304细胞增殖的抑制

目的：构建凝血酶敏感蛋白-1N端片段（TSF）的原核表达体系,测定重组蛋白的活性。方法： 从人脐静脉内皮细胞cDNA中扩增得到thbs1基因片段,克隆到pET32c(+)载体系统并转化BL21大肠杆菌,表达纯化得到TSF。MTT法体外测定目的蛋白对ECV304细胞增殖的抑制作用。免疫荧光标记流式细胞仪测定CD36的表达。结果： 获得了原核表达的重组TSF蛋白。目的蛋白对CD36阴性的ECV304细胞有增殖抑制作用。结论： 低剂量重组TSF蛋白是一个具有临床应用前景的抗肿瘤治疗的辅助方法。     

人免疫缺陷病毒I型Vif蛋白的原核表达、纯化及单克隆抗体制备

目的：克隆、表达、纯化人免疫缺陷病毒I型（HIV-1）Vif蛋白,制备其单克隆抗体。方法：提取感染了HIV的细胞基因组DNA,PCR扩增vif基因,插入表达载体pET32a,转化大肠杆菌BL21（DE3）获得工程菌株,IPTG诱导蛋白表达,Western印迹鉴定目的蛋白,亲和层析纯化目的蛋白;免疫BALB／c小鼠,制备单克隆抗体。结果：构建了Vif蛋白的原核表达载体vif-pET32a,并在大肠杆菌中获得高表达,目的蛋白以包涵体形式存在;纯化获得高纯度的重组Vif蛋白,蛋白浓度可达0．56mg／mL;建立了抗Vif蛋白单克隆抗体细胞株,制备了腹水,滴度可达1：16×10^6,抗体纯化后保持了活性和特异性。结论：在原核表达系统中表达、纯化了重组Vif蛋白,制备了针对Vif蛋白的单克隆抗体,为研究Vif蛋白的功能和抗原性奠定了基础。     

Effect of bioactive peptide on ram semen cryopreservation

This present study investigated the effect of bioactive peptide (BAPT) (BAPT) on the quality of ram semen during cryopreservation. Ram ejaculates were extended with Tris buffer supplemented with no antioxidants (as control group), 20 μg/mL BAPT (as BAPT20 group), 40 μg/mL BAPT (as BAPT40 group) and 60 μg/mL BAPT (as BAPT60 group). After cryopreservation, sperm quality including motility, vitality, the percentage of hypoosmotic swelling test (HOST)-positive spermatozoa and the percentage of intact acrosomes was assessed. Furthermore, the malondialdehyde (MDA) in seminal plasma and spermatozoa were analyzed, followed by the measurement of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathione-peroxidase (GSH-Px) levels in seminal plasma. After in vitro fertilization, the embryonic cleavage rates and development rates of different groups were analyzed to compare the developmental abilities of spermatozoa. The results showed that the post-thaw sperm motility was significantly higher in the BAPT60 group compared to those in the BAPT20, BAPT40 and control groups (P < 0.05). The percentage of live sperms significantly increased from 48.12 ± 2.35% for the BAPT20 group, 55.43 ± 2.16% for the BAPT40 group to 57.53 ± 3.15% for the BAPT60 group. The percentage of HOST-positive spermatozoa was significantly higher in the BAPT60 group than those in BAPT20, BAPT40 and control groups (P < 0.05). The MDA levels in seminal plasma and spermatozoa were significantly reduced with BAPT supplement (P < 0.05). Additionally, the SOD, CAT and GSH-Px levels in the BAPT experimental groups were significantly higher than those of the control group, which further indicated that BAPT significantly inhibit the reactive oxygen species (ROS) production during the cryopreservation of ram semen. Furthermore, the embryonic cleavage rates and development rates of the BAPT40 and BAPT60 groups were significantly increased in comparison with the BAPT20 and control groups (P < 0.05).In conclusion, BAPT improved the ram sperm quality via inhibiting the ROS production during cryopreservation, and could be applied as a promising supplement for ram semen cryopreservation.     

红豆杉内生真菌产紫杉醇相关基因BAPT的鉴定及初步研究

从几种红豆杉中先后分离了30余种内生真菌,深入研究了三种能够产紫杉醇的内生真菌。形态学观察及18srDNA鉴定它们分属于Fusarium(属)和Pestalotiopsis(属),三个菌株均可以在离体培养的条件下产生紫杉醇,经两周培养产量可分别达到8.5,31.5,31.1μg/L。(其中Pestalotiopsis1分离于南方红豆杉,Fusarium1分离于东北红豆杉,Pestalotiopsis2分离于中国红豆杉)。对这些内生真菌产紫杉醇的初步机理作了研究。BAPT(C-13phenylpropanoidsidechain-CoAacyltransferase)是红豆杉中紫杉醇合成途径里支链合成的关键酶之一,我们根据其保守区序列设计了引物,首次在能产生紫杉醇的上述三种红豆杉内生真菌中克隆得到了BAPT基因片段,而分离的其它真菌并没有得到扩增。序列分析表明,来自内生真菌的BAPT基因片段序列与红豆杉BAPT基因片段序列具有非常高的相似性(98.9%)。推测红豆杉内生真菌之所以能够合成紫杉醇,相关基因可能直接源于其宿主植物,即其遗传学起源是基因转移而不是共进化。这同时也建立了一种快速经济的鉴定产紫杉醇真菌的辅助方法。内生真菌的遗传稳定性及改良在进一步研究中。     

一株产紫杉醇内生真菌YN6的分离及鉴定

从云南红豆杉（Taxus yunnanensis）树皮内表皮中分离得到75株内生真菌,采用基于紫杉醇合成关键酶10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10-O-乙酰基转移酶（10-deacetylbaccatin Ⅲ-10-O-acetyl transferase,DBAT）和C-13苯丙氨基侧链CoA乙酰基转移酶（C-13-phenylpropanoid side chain-CoA acyltransferase,BAPT）基因为标志分子的快速筛选方法获得一株可产紫杉醇的内生真菌YN6,并通过高效液相色谱法和质谱法对其紫杉醇进行分析.同时,通过对内生真菌YN6的形态特征分析以及18S rDNA序列分析将其初步鉴定为拟盘多毛孢属（Pestalotiopsis sp.）真菌. 拟盘多毛孢YN6的紫杉醇产量约为120~140 μg/L,是目前已报道的紫杉醇产量较高的野生菌株之一. 拟盘多毛孢YN6的发现为微生物发酵生产紫杉醇提供了潜在的优良种质资源.     

过表达Bapt基因提高中国红豆杉细胞的紫杉醇产量

过表达紫杉醇合成关键酶基因是提高红豆杉细胞紫杉醇产量的有效方法.本文通过构建C-l3苯丙素侧链CoA-乙酰转移酶 (C-13 phenylpropanoid side chain CoA acetyltransferase,BAPT) 基因Bapt的表达载体p1303-SbaptN, 采用根癌农杆菌介导法转化中国红豆杉细胞,经潮霉素抗性筛选获得转基因细胞系.转基因细胞的PCR和Southern印迹分析结果表明,T-DNA及其包含的基因与宿主细胞染色体成功整合;Western印迹结果表明,转基因细胞中报告基因GusA-mgfp5正常表达;QRT PCR结果显示,转基因细胞的Bapt mRNA表达量是未转化细胞的1.26 倍;HPLC检测结果显示,转基因细胞的紫杉醇产量为37.4 μg/g,是未转化细胞的1.87倍. 本研究结果表明,过表达Bapt基因提高了中国红豆杉细胞的紫杉醇产量     

降钙素原的原核表达及单克隆抗体制备

目的:高效表达与纯化可溶性重组人PCT蛋白,制备高灵敏度和高特异性的抗人PCT医用诊断单克隆抗体。方法:大肠杆菌表达重组人PCT蛋白后,利用饱和硫酸铵沉淀和亲和层析方法纯化PCT蛋白后,经质谱、Western blot和间接ELISA法进行性质鉴定和分析重组蛋白的表达与免疫反应性;重组蛋白免疫小鼠,经细胞融合及筛选制备抗PCT单克隆抗体(m Ab)。结果:在大肠杆菌中高效表达了人PCT蛋白;重组人PCT蛋白具有良好的免疫反应性与免疫原性;经筛选获得7株抗PCT单克隆抗体细胞株,经ELISA鉴定,筛选抗体可与PCT抗原有良好的特异性反应。结论:利用重组人PCT蛋白免疫制备了抗人PCT单克隆抗体,为进一步研发PCT快速诊断试剂提供了原料。     

A组人轮状病毒NSP3基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的:获得轮状病毒NSP3基因的表达产物及其抗血清。方法:将TB-Chen株轮状病毒NSP3基因插入质粒pETL,构建重组表达质粒pET-NSP3,并转化大肠杆菌BL21(DE3)表达重组蛋白NSP3;用凝胶分离回收的方法纯化该蛋白,免疫豚鼠制备该蛋白的抗血清。结果:构建了重组表达质粒pET-NSP3,并在大肠杆菌中高效表达了重组蛋白NSP3,目的蛋白表达量占菌体总蛋白量的28.6%;有效地纯化了目的蛋白并制备了该蛋白的抗血清,Western印迹表明该抗血清能与重组蛋白NSP3发生特异性免疫反应。结论:通过质粒pETL能高效表达轮状病毒NSP3蛋白,该重组蛋白具有较好的免疫反应性,为进一步研究其结构、功能及免疫学性质奠定了基础。     

免疫A型呼吸道合胞病毒G75-225蛋白的小鼠对病毒感染的抗性

目的:评价A型呼吸道合胞病毒(RSV)G75-225蛋白(G151)与二硫键异构酶(DsbA)的重组蛋白抗原DsbA-G151的免疫活性。方法:采用PCR方法从A型RSVG蛋白扩增G151基因片段,插入表达载体pET-DsbA,经E.coli表达、亲和层析纯化制备DsbA-G151蛋白;将其免疫BALB/c小鼠后获得相应的抗血清,利用ELISA方法、保护性实验检测蛋白免疫活性。结果:构建了表达载体pET-DsbA-G151,表达、纯化获得了重组蛋白DsbA-G151。ELISA检测表明,DsbA-G151能在小鼠体内产生高滴度的特异性IgG;保护性实验显示该蛋白能有效保护BALB/c小鼠不被RSV感染。结论:经ELISA检测、保护性实验,表明DsbA-G151具有良好的免疫原性。     

表达重组人骨形态发生蛋白-7工程菌的发酵及表达产物的纯化

目的:研究表达重组人骨形态发生蛋白-7工程菌的发酵和表达产物的纯化工艺。方法:利用16L发酵罐发酵培养工程菌,设定了溶氧、搅拌速度、诱导时机、补料和培养基pH值等发酵条件;通过包涵体洗涤、离子交换层析法纯化目的蛋白。结果:工程菌目的蛋白质表达量占菌体总蛋白质的30%以上,纯化后目的蛋白的纯度可达98%。结论:建立了大肠杆菌高效表达人骨形态发生蛋白-7的发酵及纯化工艺。     

甲型H1N1流感病毒HA基因在昆虫细胞中的截短表达

目的:利用Bac-to-Bac Baculovirus Expression System表达重组HA蛋白,Western blot及IFA方法鉴定其表达。方法:采用PCR方法扩增A/California/04/2009(H1N1)HA基因,将其克隆到pFastBacHT A载体上,重组质粒pFastBacHT-HA经双酶切及测序鉴定正确后,转化阳性重组载体进入E.coli DH10Bac感受态细胞中,通过Bluo-gal蓝白斑筛选、PCR鉴定获得重组转座子rBacmid-HA。从重组转座子中提取rBacmid-HA质粒DNA转染sf 9昆虫细胞,制备重组杆状病毒。重组杆状病毒感染sf 9细胞表达重组蛋白,Western blot及IFA鉴定重组蛋白表达情况。结论:成功构建了甲型H1N1流感病毒HA基因的昆虫杆状病毒表达载体,该表达载体转染昆虫细胞后制备的重组杆状病毒病毒滴度较高,重组杆状病毒表达的重组蛋白经Western blot 及IFA 鉴定后具有良好的免疫反应原性。     

人心型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)的原核表达、纯化和冻干品的制备

目的：获得重组人心型脂肪酸结合蛋白,分析其活性及制备冻干品。方法：从GenBank中检索人源H-FABP CDs 序列,合成基因后构建原核表达载体pET-28a（+）-H-FABP。将表达载体转入E.coli BL21（DE3）,摸索pET-28a（+）-H-FABP最佳诱导条件,表达并纯化重组蛋白。使用检测试剂检测纯化后的重组H-FABP活性,研究最佳冻干方案并考察冻干品的稳定性。结果：经过优化诱导条件,重组H-FABP在BL21（DE3）中以可溶性蛋白形式表达。诱导条件为OD₆₀₀≈0.6,IPTG终浓度0.4mmol/L,30℃诱导4h。通过Ni²⁺亲和层析纯化可得到纯度大于95%的重组H-FABP蛋白。重组H-FABP冻干品可以在37℃稳定保存12d,25℃、4℃稳定保存至少4个月。结论：本项研究中的重组H-FABP表达体系成熟、蛋白活性高,冻干品稳定性好,为后续研究提供了稳定高效的生物原材料。