胞外ATP对AlCl3诱导的细胞死亡过程中胞内H2O2和Ca2+水平的影响及其生理机制分析

该实验以烟草悬浮细胞 BY 2 为材料,在烟草悬浮细胞中分别加入0.05、0.10、0.15、0.20 mmol·L^-1AlCl₃,以等体积去离子水处理的悬浮细胞液为对照,并依据前述实验结果选择0.15 mmol·L^-1 AlCl₃,分别添加5 mmol·L^-1 DMTU(H₂O₂ 抑制剂)、20 μmol·L^-1CaCl₂、15 μmol·L^-1 LaCl₃(Ca²⁺通道抑制剂)和50 μmol·L^-1 ATP设计多项处理,分析胞外ATP(eATP)对铝离子(Al³⁺)胁迫引起的植物细胞死亡及其胞内H₂O₂、Ca²⁺的影响,以揭示Al³⁺胁迫下植物调节细胞死亡的可能机制,进一步扩展对eATP功能的认知。结果显示：(1)随着 AlCl₃ 胁迫浓度的提高,细胞死亡水平和胞内H₂O₂水平上升,而胞内Ca²⁺和eATP水平则逐渐降低。(2)外援施加H₂O₂抑制剂 DMTU(二甲基硫脲)和Ca²⁺能够有效缓解AlCl₃诱导的细胞死亡水平的上升;而Ca²⁺通道抑制剂LaCl₃(三氯化镧)则加剧了AlCl₃胁迫下的细胞死亡。(3)在AlCl₃胁迫下对细胞添加外源ATP,能够缓解AlCl₃胁迫下胞内H₂O₂水平上升和Ca²⁺水平下降的同时,并显著降低AlCl₃胁迫导致的细胞死亡。研究表明, Al³⁺以剂量依赖的模式提升细胞死亡和细胞内H₂O₂的水平并降低胞内Ca²⁺和eATP水平,AlCl₃诱导的细胞死亡受到H₂O₂和Ca²⁺水平变化的调节,eATP可以通过调节H₂O₂与Ca²⁺水平缓解AlCl₃诱导的细胞死亡。推测Al³⁺胁迫可能通过抑制钙离子通道而破坏了细胞内H₂O₂和Ca²⁺之间的协同关系,外源ATP对Al³⁺诱导H₂O₂上升的缓解作用可能是由于其提升了细胞的抗氧化能力。     

测定OH·产生与清除的化学发光体系

一种产生和检测OH^·的化学发光体系;用抗坏血酸-Cu²⁺-H₂O₂产生OH^·,加酵母扩增化学发光,并通过对测定条件的研究,得到测定的最佳方案。所做结果证明,其体系灵敏度高、稳定性好、特异性强、操作简便、测量快速,值得推广。     

Cr3+和Cd2+对普通小球藻生长及抗氧化酶活性的影响

[目的] 为探究重金属对淡水绿藻生长的影响。[方法] 选取对水质检测具有明显指示作用的普通小球藻（Chlorella vulgaris）为实验材料,CdCl₂·2H₂O和CrCl₃·7H₂O提供重金属离子,探究不同浓度Cr³⁺和Cd²⁺在单一和复合胁迫下对藻细胞浓度、叶绿素a及相关抗氧化酶活性的影响。[结果] 随着Cr³⁺和Cd²⁺浓度不断增加,藻细胞浓度呈先增长后下降趋势;叶绿素a含量呈现先下降后升高再下降的现象,浓度为1 mg/L的单一和复合胁迫下有最大值,且毒性作用表现为Cr³⁺ < Cd²⁺ < Cr³⁺+Cd²⁺;与藻细胞膜相关的丙二醛（MDA）和过氧化氢（H₂O₂）含量随着重金属离子浓度的增大而增长;重金属离子浓度低于10 mg/L时对藻细胞内抗氧化酶系统中的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）表现为促进作用,而大于10 mg/L时具有抑制作用。[结论] 结果表明在单一或复合重金属胁迫下,普通小球藻会充分调动与抗逆性相关的酶来维持自身的正常生长。     

外源H2O2对盐胁迫下小白菜种子萌发和幼苗生理特性的影响

以小白菜"甜脆青"为试材,研究不同浓度（5、10、25、50和100 mmol/L）过氧化氢（H₂O₂）浸种处理对100 mmol/L NaCl胁迫下小白菜（Brassica chinensis L.）种子萌发、幼苗生长及生理特性的影响。结果表明：100 mmol/L NaCl胁迫明显抑制小白菜种子的萌发状况和幼苗生长,发芽势、发芽指数、活力指数及幼苗根和芽长度和鲜重均明显降低,根和芽中CAT的活性及K⁺含量明显受到抑制,渗透调节物质、活性氧和MDA含量显著增加。不同浓度H₂O₂浸种处理提高了NaCl胁迫下小白菜种子发芽势、发芽指数和活力指数,促进小白菜根和芽的生长,增强了NaCl胁迫下根和芽中SOD、CAT和APX的活性及K⁺含量,降低O₂^-·产生速率及H₂O₂和MDA含量,进一步促进脯氨酸和可溶性糖含量的增加,降低体内Na⁺含量。其中以10 mmol/L H₂O₂处理缓解盐胁迫效果最好,明显缓解NaCl胁迫对小白菜种子萌发和幼苗生长的抑制。     

不同浓度Fe2+与Zn2+对羊草幼苗生长和生理特性的影响

以羊草幼苗为研究对象,通过调整全营养培养基(CK,0.05 mmol/L Fe²⁺、0.015 mmol/L Zn²⁺)中铁或者锌含量设置0、10倍、20倍Fe²⁺(Zn²⁺)浓度处理Fe₀(Zn₀)、Fe₁₀(Zn₁₀)、Fe₂₀(Zn₂₀),以及在高铁培养基中单独添加0.15 mmol/L Zn²⁺或同时添加10 mmol/L Ca²⁺、5 mmol/L Mg²⁺、20 mmol/L K⁺处理,测定培养6 d后幼苗生长指标和矿质元素含量、以及高铁(Fe₂₀)处理下幼苗根中抗氧化指标和相关基因表达量,探究不同浓度Fe²⁺、Zn²⁺对羊草幼苗生长、矿质元素吸收积累及抗氧化指标、基因表达的影响。结果表明：(1)缺锌(Zn₀)显著抑制羊草幼苗鲜重的增加和Zn元素的积累,但促进Fe、Mg元素的积累;高浓度锌(Zn₁₀、Zn₂₀)显著促进幼苗叶片生长和Zn元素的积累;缺铁(Fe₀)显著抑制幼苗的根长、鲜重和Fe元素的积累,促进Mg、Zn元素的积累;高浓度铁(Fe₁₀、Fe₂₀)显著抑制羊草幼苗根叶生长、根毛发育和Ca、Zn、Mg、K元素的积累。(2)增加Zn²⁺和Ca²⁺、Mg²⁺、K⁺浓度无法恢复高铁胁迫对幼苗生长的抑制作用。(3)高浓度铁(Fe₂₀)处理羊草幼苗48 h后,根部过氧化物酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、抗坏血酸过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶活性和丙二醛、抗坏血酸、还原型谷胱甘肽含量显著升高;烟酰胺合成酶基因、过氧化物酶基因表达量显著下调,植物类萌发素蛋白基因表达量显著上调。研究发现,羊草幼苗生长发育和矿质元素积累对环境中Zn²⁺浓度变化不敏感,却受到环境中高浓度Fe²⁺的显著抑制,并造成严重的氧化胁迫伤害,这种伤害无法在添加Zn²⁺或同时添加Ca²⁺、Mg²⁺、K⁺的条件下恢复。     

邻二氮菲－Fe2＋氧化法检测H2O2／Fe2＋产生的羟自由基

报告检测H₂O₂/Fe^2＋所产生羟自由基的新方法. 羟自由基氧化反应后, 邻二氮菲-Fe^2＋的A₅₃₆明显下降, 且△A₅₃₆与邻二氮菲, FeSO₄及H₂O₂呈量效关系, 随反应时间延长, △A₅₃₆依幂函数规律上升. 此法试验结果表明, 甘露醇, 抗坏血酸及硫肥清除羟自由基作用呈明显的量效关系.     

O -·2增强谷氨酸与其受体的结合力及EBSELEN的保护作用

用放射配体测定受体法研究了黄嘌呤(X)/黄嘌呤氧化酶(XO)体系产生的超氧阴离子自由基(O -·2)对［3H］DL-谷氨酸与大鼠大脑皮层突触膜谷氨酸受体结合的影响,结果表明O -·2明显增强谷氨酸与其受体的结合力,此作用能被2-苯基-1,2-苯并异硒唑-3(2H)酮(EBSELEN)(1 μmol/L)所抑制.     

NO和H2O2诱导大豆根尖和边缘细胞耐铝反应的作用

 NO和H₂O₂是参与植物抗非生物胁迫反应的重要信号分子, 为了确定NO和H₂O₂在大豆(Glycine max)根尖和根边缘细胞(root border cells, RBCs)耐铝反应中的作用及其相互关系, 以‘浙春3号’大豆为材料, 研究了铝毒胁迫下大豆根尖内源NO和H₂O₂的变化, 以及外源NO和H₂O₂诱导大豆根尖和RBCs的耐铝反应。结果表明, 50 μmol·L^–1 Al处理48 h显著抑制大豆根的伸长, 提高Al在根尖的积累, 同时显著增加根尖内源NO和H₂O₂含量。施加0.25 mmol·L^–1外源NO供体亚硝基铁氰化钠(Na₂[Fe(CN)₅NO]·2H₂O, sodium nitroprusside, SNP)和0.1 mmol·L^–1H₂O₂, 能有效地缓解Al对大豆根伸长的抑制、根尖Al积累和RBCs 的死亡, 该缓解作用可以被0.05 mmol·L^–1 NO清除剂2-(4- 羧基苯)-4,4,5,5- 四甲基咪唑-1- 氧-3- 氧化物, 钾盐(C₁₄H₁₆N₂O₄·K, carboxy-PTIO, cPTIO)和150 U·mL^–1 H₂O₂清除酶(catalase, CAT)逆转。并且外源NO能够显著促进根尖H₂O₂的积累, 而外源H₂O₂对根尖NO的含量无显著影响。这表明NO和H₂O₂是诱导大豆根尖及RBCs耐铝反应的两种信号分子, NO可能通过调控H₂O₂的形成, 进而诱导大豆根尖及RBCs的耐铝反应。     

氧化苦参碱对H2O2诱导的L6成肌细胞凋亡的影响

研究氧化苦参碱对L₆大鼠成肌细胞H<>sub>2O₂凋亡的影响．采用过氧化氢损伤L₆大鼠成肌细胞的方法,建立L₆大鼠成肌细胞H₂O₂凋亡模型．使用剂量为0.3,0.15,0.75 g/L的氧化苦参碱处理细胞．应用MTT法统计存活率和流式细胞仪检测细胞周期及凋亡率,用DAPI荧光染色、HE染色以及Bax和Bcl-2抗体鉴定损伤程度,Western blot检测蛋白质差异．结果表明,H₂O₂损伤的成肌细胞存活率降低,凋亡率增加．各种剂量氧化苦参碱能提高成肌细胞的存活率,促使Bcl-2增高,Bax降低．对成肌细胞的保护程度随氧化苦参碱剂量增加而增强,在剂量为0.3 g/L时,效果显著,其次是0.15、0.75 g/L的氧化苦参碱．其生理生化机制是氧化苦参碱保护₂O₂通过NFκB信号通路造成的大鼠成肌细胞凋亡模型．结果显示,氧化苦参碱具有作为新的抗氧化药物的潜力．     

甲2巨球蛋白对电离辐射引起人血中O2-·自由基释放的影响

本实验用 ⁶⁰Coγ线照射正常人新鲜全血,观察电离辐射对多形核白细胞(PMN)释放超氧化物阴离子自由基(O₂^-_·)的影响,以及人血甲2巨球蛋白(α₂M)制剂对辐射引起的PMN释放O₂^-_·的作用。结果表明:正常人新鲜全血照射(5-20Gy)后1h,PMN释放O₂^-_·的量较不照射组增高(P<0.01),红细胞中超氧化物歧化酶(SOD)的活力较不照射组降低(P<0.01)。照前1h加入人血α₂M制剂(每ml全血中加入138.5单位)能有效地降低PMN的O₂^-_·释放量,提高红细胞中SOD的活力。离体实验结果提示α₂M治疗辐射损伤作用可能与其抑制过多的O₂^-_·产生有关。     

H2O2对红细胞抗原性与LPO影响的FCM研究

用流式细胞计（flow cytometry,FCM）测定H₂O₂损伤后的红细胞（RBC）与IgG的结合能力,并直接检测细胞自发荧光的变化,以研究H₂O₂对RBC抗原性和脂质过氧化（LPO）荧光产物生成的影响.结果表明RBC抗原性和自发荧光变化与H₂O₂浓度和作用时间有关,抗原性变化对H₂O₂更敏感,比引起自发荧光明显增强所需H₂O₂浓度低两个数量级;还发现了RBC抗原性和自发荧光的变化与细胞的散射光有相关性.     

呼吸链电子漏在细胞凋亡中的作用

实验证明细胞色素c具有很强的抗氧化功能,在线粒体中氧化态的细胞色素c直接清除O2·-,还原态的细胞色素c清除H2O2.由于呼吸链传递电子合成ATP的同时,总有少部分电子从呼吸链底物端的复合物Ⅰ和Ⅲ漏出,而且漏出的电子首先使氧分子还原成O2·- ,然后O2·-歧化成H2O2,所以细胞色素c清除O2·-和H2O2的功能使呼吸链出现了两条电子漏旁路.细胞色素c通过这两条电子漏路径实现其控制线粒体中O2·-和H2O2水平的功能.根据两条电子漏旁路都是O2·-代谢路径的事实,引进了线粒体自由基代谢的概念,并从自由基代谢失调的角度探讨了呼吸链电子漏在细胞凋亡中的作用.     

Smac/DIABLO在过氧化氢所致C2C12肌原细胞凋亡中的作用

为探讨Smac/DIABLO在过氧化氢(H₂O₂）所致C₂C₁₂肌原细胞凋亡中的作用,采用Hoechst 33258染色,观察H₂O₂ (0.5 mmol/L)处理C₂C₁₂肌原细胞不同时间后,细胞核形态学改变并计算凋亡核百分率,DNA抽提及琼脂糖电泳观察凋亡特征性梯状带,利用细胞成分分离后蛋白质印迹分析H₂O₂是否导致Smac/DIABLO从线粒体释放,采用Caspase检测试剂盒及蛋白质印迹分析Caspase-3和Caspase-9的活化,转染Smac/DIABLO基因,观察Smac/DIABLO过表达对H₂O₂所致的C₂C₁₂肌原细胞凋亡的影响.结果表明:H₂O₂处理1 h后,Smac/DIABLO从C₂C₁₂肌原细胞线粒体释放入胞浆,2 h更明显;H₂O₂处理4 h后,Caspase-3和Caspase-9活化,12 h达高峰;H₂O₂处理24 h后,C₂C₁₂肌原细胞显示特征性的凋亡形态改变,凋亡核百分率明显升高,DNA电泳出现明显“梯状”条带.与单纯过氧化氢损伤组相比,Smac/DIABLO高表达的C₂C₁₂肌原细胞经过氧化氢损伤组的Caspase-3和Caspase-9的活化、凋亡核百分率的升高、“梯状”条带的出现均更明显.结果表明,H₂O₂可导致Smac/DIABLO从C₂C₁₂肌原细胞线粒体释放,促进Caspase-9和Caspase-3的活化而促进细胞凋亡的发生.     

植物叶片中过氧化氢含量测定方法的改进

Ti（Ⅳ）-H₂O₂比色法因背景物质干扰而测得的植物叶片内H₂O₂含量偏高，5％三氯乙酸抽提，活性炭脱色，Ti（Ⅳ）-4-(2-吡啶偶氮)间苯二酚(PAR)比色法测得的H₂O₂含量偏低.萃取法有效地脱去丙酮提液中的色素，且H₂O₂的回收率在95％以上.用过氧化氢酶(CAT）处理作空白对照，利用H₂O₂与Ti（Ⅳ）-PAR的显色反应，建立了一种简便、快速、准确的植物叶片内的H₂O₂含量测定方法，H₂O₂的最低检测浓度为0.25 μmol·L^－1.用该方法测得多种植物叶片中H₂O₂的含量在0.1～0.8 μmol·g^－1.     

黄芪总黄酮对DNA损伤防护作用的研究

用DNA解旋荧光检测法(FADU)研究了黄芪总黄酮(TFA)对γ射线和H₂O₂所致V79细胞DNA链断裂的防护作用. 结果表明TFA对这两种损伤因子所致的DNA损伤均有不同程度的防护作用, 当TFA浓度达到0.4g/L和0.6g/L时, 分别对H₂O₂和γ射线所致的损伤有保护作用(P<0.05), 而浓度增至0.8g/L和1.2g/L时, 分别对两种因素所致的DNA链断裂损伤有非常显著的防护效果(P<0.01), 对H₂O₂的防护效果优于对γ射线.     

异养微生物还原氧化铁的研究

所试的民养微生物能在静止状态含蔗糖和氧化铁的培养液中生长。它们在氧化蔗糖到CO₂时,伴随着Fe³⁺还原到Fe²⁺、Fe²⁺移动到基质表面与O₂接触后,又会氧化为Fe³⁺培养液Fe³⁺被还原的适宜pH和温度分别为7.0、25℃。若培养液中加入0．1％硝酸盐时,还原Fe³⁺的过程会停滞或减慢。     

细胞氧化损伤时8-羟基鸟嘌呤的测定

利用H₂O₂易通过细胞膜而到达核这一特点,初步探讨了不同浓度H₂O₂对HL-60细胞DNA的氧化损伤程度.发现H₂O₂浓度在0.4 mmol/L以上时,作用8～24 h可以用气相色谱/火焰离子检测器(GC/FID)检测到氧化损伤标志产物——8-羟基鸟嘌呤(8-oh-G),并观测到在0.4～0.8 mmol/L H₂O₂作用一定时间时,8-羟基鸟嘌呤含量随H₂O₂浓度升高而升高.     

氧合血红蛋白Fe-O2键合态 ab initio 研究

本文报道用自旋非限制Hartree-Fock方法(spin unrestricted Hartree-Fock method简写UHF)对氧合血红蛋白的Fe-O₂键合态进行ab initio研究。结果表明Fe^(Ⅱ)、Oc和Or的Mulliken布居值分别为24.18、8.19和7.64。这说明氧合血红蛋白的Fe-O₂键合态不发生电子转移。研究模型所得到的频率与实验频率基本一致。研究结果不支持Weiss提出的Fe³⁺O₂^-模型,为解释血红蛋白传输氧的作用机理提供了新的理论依据。     

SelS高表达保护人脐静脉内皮细胞免于H2O2诱导的细胞损伤

采用以下方法探讨SelS在内皮细胞中的表达和作用：将SelS基因克隆到真核表达载体pLNCX2，RT-PCR、XhoⅠ/ClaⅠ双酶切以及DNA序列分析验证目的基因；利用脂质体转染技术将pLNCX2-SelS或pLNCX2转染至人脐静脉内皮细胞(ECV₃₀₄细胞)，RT-PCR检测重组基因SelS的表达；MTT方法检测转染后过氧化氢(H₂O₂)对内皮细胞增殖能力的影响；硫代巴比妥酸法测定暴露于H₂O₂中不同转染组细胞脂质过氧化产物丙二醛含量. 结果表明：成功构建真核表达载体pLNCX2-SelS；转染后重组SelS mRNA表达水平是内源性水平的1.76倍；H₂O₂对ECV₃₀₄细胞损伤后，高表达SelS组细胞活性增强、H₂O₂诱导产生的丙二醛减少. 上述结果表明，高表达SelS可保护内皮细胞免于H₂O₂诱导的细胞损伤，其作用机制与抗氧化有关.     

外源CaCl2对NaCl胁迫下酸枣幼苗氮代谢的影响

为了研究CaCl₂对NaCl胁迫下酸枣幼苗根、茎、叶的氮代谢影响,探索钙缓解幼苗NaCl胁迫的作用途径。该研究以酸枣幼苗为试验材料,检测不同浓度CaCl₂(0、5、10、20 mmol/L)对NaCl(150 mmol/L)胁迫下幼苗叶片H₂O₂、O^-·₂含量,根、茎、叶中硝酸还原酶(NR)、谷氨酰胺合成酶(GS)、谷氨酸合酶(GOGAT)活性及游离氨基酸、可溶性蛋白、硝态氮含量的影响,并采用主成分分析法筛选出评价CaCl₂缓解NaCl胁迫效应的生理指标。结果表明：与NaCl胁迫相比,盐胁迫幼苗叶片的H2O₂、O^-·₂积累量在5、10 mmol/L CaCl₂处理下显著减少;GOGAT活性在5、10 mmol/L CaCl₂处理下的植株根和茎内以及各浓度 CaCl₂处理的叶内均显著升高, GS、NR活性在10、20 mmol/L CaCl₂处理的根内和10 mmol/L CaCl₂处理的茎内以及5、10、20 mmol/L CaCl₂处理的叶内均显著升高;可溶性蛋白含量在5、10、20 mmol/L CaCl₂处理的根、茎、叶内均显著升高,游离氨基酸含量在10、20 mmol/L CaCl₂处理的根和茎内以及10 mmol/L CaCl₂处理的叶内均显著升高,硝态氮含量在10 mmol/L CaCl₂处理的根和茎内以及5、10、20 mmol/L CaCl₂处理的叶内均显著升高。研究发现,150 mmol/L NaCl胁迫对酸枣幼苗造成明显过氧化伤害,抑制了体内氮代谢;外源CaCl₂可通过促进幼苗根和茎内GS/GOGAT循环对NH₄⁺的同化作用,提高叶片NR活性,加快硝态氮的转化速率,从而增强幼苗对NaCl胁迫的适应性,并以10 mmol/L CaCl₂处理缓解效果最佳;游离氨基酸、GOGAT、NR可以作为CaCl₂缓解幼苗NaCl胁迫伤害的评价指标。