用国产微孔玻璃珠初步纯化重组人尿激酶原

用国产微孔玻璃珠从CD-1工程细胞株培养上清中纯化尿激酶原,探索了微孔玻璃珠结合尿激酶原的条件和洗脱方法,比较了硫酸铵线性梯度洗脱或25％乙二醇脱尿激酶原活性蛋白的结果,最后确定洗脱条件为0.25mol/L Tris、1～2mol/L(NH_4)_2SO_4、pH9.3。经此一步纯化,尿激酶原比活性达到15329IU/mg,回收率为78％,还原条件下SDS-PAGE分析分子量为52×10~3的单链尿激酶原占74％。     

重组人尿激酶原的分离纯化及性质研究

本文报道从人尿激酶原（ｐｒｏ－ｕｒｏｋｉｎａｓｅ,ｐｒｏ－ＵＫ）基因重组工程菌Ｅ．ｃｏｌｉＪＡ２２１表达产物的复性液中纯化尿激酶原的方法。复性产物经Ｚｎ＾２＋选择性沉淀,尿激酶抗体亲和柱层析,ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ ４Ｂ亲和吸附,即得比活达１１００００ＩＵ／ｍｇ的纯化产品。样品经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ鉴定,在还原及非还原条件下,均表现为分子量为４３ｋｄ的单一条带。动力学研究测得     

重组人尿激酶原在CHO细胞中的高效表达及其纯化

用鸡β- globin的MAR序列和人看家基因延伸因子1α(hEF-1α)的调控序列以及旱獭RNA稳定与输出序列,构建了重组人尿激酶原(recombinant human pro-urokinase,rhPro - UK)的高效表达载体,在CHO细胞中获得了rhPro - UK的高效稳定表达,rhPro - UK的表达水平达到1299 IU(以百万细胞1d的表达量计).采用阳离子交换层析、疏水层析和凝胶排阻层析的三步工艺纯化表达rhPro - UK的CHO细胞培养上清液,rhPro - UK的纯度达到98％、回收率为60％ ～70％.     

重组人尿激酶原的体外变复性研究

重组人尿激酶原在大肠杆菌中过量表达时形成不溶物包涵体,需经体外变复性后才能获得生物活性。本文旨在提高包涵体中变性尿激酶原的复性效率,通过对pH,温度,变性剂种类及浓度,蛋白浓度,以及巯基氧化还原对的比率等的定性定量分析,研究重组人尿激酶原体外变复性的基本条件,并比较了添加某些非特异有效成分,脉冲稀释,梯度透析等方法对提高重组人尿激酶原体外变复性效率的作用。确定了重组人尿激酶原体外变复性的适宜方法,复性效率可达20%～30%。     

重组人尿激酶原半成品的稳定性观察

对干燥前尿激酶原半成品的稳定性进行了观察。将半成品分装为数管 (1 40 μl/管 ) ,分别放在 4℃ ,- 2 0℃和 - 70℃ ,用纤维蛋白平板溶解圈法和 SDS- PAGE扫描法观察其 3个月内的活性及纯度变化。结果表明在 4℃条件下 ,处于溶液中的尿激酶原稳定性最差 ,一周后活性由 5× 1 0 4IU/ml降至 2 .3 8× 1 0 4IU/ml,单链比例由 97.7%降至 88.3 %,二周后单链比例进一步下降至 43 .8%。贮存在 - 2 0℃和 - 70℃条件下活性稳定 ,但单链也要缓慢裂解 ,一周后单链比例由 97.7%分别下降到 93 .9%和 93 .5 %,3个月后分别为 83 .7%和 86 .2 %,两者无明显差别     

重组人白细胞介素-6的纯化

重组人白细胞介素－６（ｒｈＩＬ－６）在工程菌ｐＢＶ２２０／ｒｈＩＬ－６／ＤＨ５ａ中以包涵体形式高效表达。ｒｈＩＬ－６经过工程菌体破碎、包涵体分离及抽提、复性、色谱分离后得到高度纯化。纯化产物纯度９５％,具有良好的生物学活性     

Sepharose 4B一步法对金环蛇蛇毒磷脂酶A2的分离纯化

利用经酸处理的Sepharose 4B为层析介质,以含0.2mol/L半乳糖,pH7.4台氏液作为洗脱液,从广西产金环蛇(Bungarus fasciatus)蛇毒中一步分离得到一种磷脂酶A2.用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定其分子量为14 kDa.N端部分序列测定表明,所分离得到的磷脂酶A2其N端16个氨基酸残基序列与已报道的金环蛇蛇毒磷脂酶A2同功酶Ⅵ(Lu & Lo,1978)一致.该酶糖含量较高,为13.4%;具有弱的磷脂酶A2活性,无毒,也无溶血和出血毒活性.     

重组人尿激酶原冻干产品的稳定性

目的：探讨重组人尿激酶原（rhPro-UK）冻干产品的稳定性。方法：采用S-2444发色底物法测定贮存在4℃和-20℃的rhPro-UK冻干产品的活性、单链比例随时间的变化规律;用SDS-PAGE及RP-HPLC肽图分析贮存在-20℃的rhPro-UK冻干产品的结构与组成的变化。结果：4℃保存3年后的rhPro-UK冻干产品的总活性和单链比例基本没有变化,但随着贮存时间的延长,有部分产品降解,如贮存78个月的样品,总活性可降低13％～15％;-20℃保存78个月后,rhPro-UK冻干产品的总活性和单链比例未见明显变化。SDS-PAGE及RP-HPLC肽图图谱显示,-20℃贮存78个月后的rhPro-UK冻干产品的组成和结构没有变化。结论：rhPro-UK冻干产品在4℃的贮存寿命可达3年;长期贮存于-20℃的rhPro-UK冻干产品,其总活性、单链比例及结构组成非常稳定。     

PRGDWR-尿激酶原双功能嵌合分子的性质研究

为赋予单链尿激酶型纤溶酶原激活剂(single chain urokinase-type plasminogen activator, scu-PA, 尿激酶原)以抗血小板聚集的功能,在scu-PA的kringle区118位Gly与119位Leu之间插入PRGDWR序列（insert mutant B,InB）.利用甲醇酵母（Pichia pastoris）进行分泌表达,经金属离子螯合亲和层析与S强阳离子交换层析,得到纯蛋白.实验测定InB对人工合成底物S-2444的酰胺解活性为5 900 IU/mg,动力学常数为：K_m,S-2444^InB=56.8 μmol·L^-1,k_cat,S-2444^InB=0.33 s^-1;水解天然底物plasminogen的动力学常数为：K_m,plg^InB=0.397 μmol·L^-1,k_cat,plg^InB=0.0164 s^-1.InB激活plasminogen的反应在有fibrin存在条件下InB的活性为无fibrin条件下的46.3％.该突变体在体外激活plasminogen的活性与同一系统表达的野生型scu-PA基本相同.该突变体表现出较强的抗血小板聚集活性,IC₅₀＝12.7 μmol·L^-1,而野生型scu-PA无此功能.实验表明scu-PA的K区插入突变体InB是一种极具潜力的双功能溶栓分子.     

T7 启动子作用下人尿激酶原 cDNA 在大肠杆菌中的高效表达及分离纯化

化学合成的人尿激酶原ｃＤＮＡ克隆在表达质粒ｐＥＴ１１ｄ中,在Ｔ７启动子的作用下,经０.１ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ诱导,在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ中获得表达。其表达量占菌体总蛋白的１５％,表达产物以无活性的包涵体形式存在。经体外变复性,Ｚｎ^２＋选择性沉淀,抗体亲和柱层析,及Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ亲和吸附,所表达的人尿激酶原被纯化为单一条带,其比活约１１００００ＩＵ／ｍｇ。     

无标签重组人硫氧还蛋白的大规模表达、纯化及活性检测

目的:利用基因工程的方法原核表达无标签的重组人硫氧还蛋白(rhTrx)并对其进行大规模表达、纯化和鉴定.方法:从人胚胎肾HEK293细胞中提取总RNA,反转录合成cDNA,经PCR扩增、酶切后连入pET-22b(+)载体构建重组质粒,重组质粒转化大肠杆菌BL21( DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,经两步离子交换层析纯化重组蛋白,采用SDS-PAGE、Western blotting、HPLC、MALDI-TOF-MS及经典的胰岛素二硫键还原法对重组蛋白进行鉴定.结果:构建成功了rhTrx基因表达载体;实现了rhTrx在原核细胞中的可溶性表达;纯化出的蛋白经SDS-PAGE和Western blotting分析证实为rhTrx;HPLC和MALDI-TOF-MS分析表明,纯化出的目的蛋白纯度大于95％;胰岛素二硫键还原法证实纯化出的rhTrx具有生物学活性.结论:成功构建了rhTrx的原核表达体系,建立了rhTrx的纯化和鉴定方法,为其进一步的理论研究和生产开发提供了有效基础数据.     

抗甲肝病毒基因工程单抗分离纯化与鉴定

为克服血源免疫球蛋白制品的不足,开发了抗甲肝病毒基因工程单克隆抗体anti-HAV IgG。用无血清培养基培养rCHO工程细胞株,上清液经过rProtein A SFF亲和层析→脱盐→离子交换层析→超滤换液纯化后,所得anti-HAV IgG纯度达99%以上,比活性约100IU/mg,anti-HAV IgG活性回收率40%。所纯化的anti-HAV IgG分子量150kD,等电点8.4～9.3。免疫印迹实验证实anti-HAV IgG为人源全抗体分子。亲和层析介质rProtein A SFF确实存在亲和配基脱落问题,但通过后续纯化步骤可有效除去。在亲和层析过程中加入高盐清洗步骤,可有效降低宿主DNA残留量水平。对样品中自由巯基含量进行了测定,认为非还原电泳图谱中低分子量条带是由于抗体分子内存在自由巯基引起。用该工艺制备的anti-HAV IgG各项纯度检测指标均达到我国对基因工程产品的质量要求。     

重组点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶的纯化和鉴定

报道重组点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶(简称apPEP)的基因工程下游工艺研究。工程菌株E.coli BL21/pKKH\|PEP表达产物apPEP为可溶性蛋白,在NBS BioFlo 3000型5L自控发酵罐中经14h培养每升发酵液可达到22.5g干重菌体,含apPEP 3.0g左右。发酵菌体经超声破碎、硫酸铵沉淀后,依次经Sephadex G-25、High performance Q sepharose FF(HP\|Q)、Phenyl separose 6 FF柱层析分离纯化,每升发酵产物最终可得0.86g纯度达96%的重组apPEP,比活力达到65.5u/mg,整个纯化工艺的蛋白回收率为8.2%,活力回收率为24.4%。纯化的apPEP经电喷雾质谱测定分子量为76464±30D,N端氨基酸序列与基因序列推导的一致。等电点为pI6.0左右。与Aeromonas hydrophila来源的PEP(pI=5.5)相近。     

工程菌噬菌体T7溶菌酶的纯化和性质

用崔道珊等构建的噬菌体T7溶菌酶工程菌株,培养物经超声破碎和DE52,CM52柱层析纯化,我们得到电泳纯的T7溶菌酶,分子量为17000,最适反应pH为8.0.其热稳定性欠佳,保温37℃,5min即丧失酶活21%.     

重组炭疽保护性抗原的表达、纯化与生物活性分析

构建分泌型表达质粒 ,在大肠杆菌中实现了重组炭疽保护性抗原 (rPA)的分泌型表达。重组蛋白位于细菌外周质 ,表达量约占菌体总蛋白的 10 %。以离子交换、疏水层析和凝胶过滤为基础 ,建立了rPA的纯化工艺 ,每升培养物可获得约 15mgrPA ,纯度可达 95 %以上。体外细胞毒性试验显示rPA具有较好的生物学活性。用rPA免疫家兔产生的抗血清在体外可抑制炭疽致死毒素的活性 ,表明rPA可诱导机体产生保护性免疫。以上结果为今后发展新一代炭疽疫苗打下基础     

重组内肽酶AspN的原核表达纯化和活性鉴定

蛋白内肽酶AspN是一种锌金属内切肽酶,能选择性切割天冬氨酸的N端肽键,广泛应用于蛋白的多肽制备及质量肽图谱鉴定。目前内肽酶AspN来源于细菌分泌,产量低,制备困难,成本高,极大地限制了该酶的应用。将脑膜脓毒性黄杆菌分泌的蛋白内肽酶Asp N所对应的基因克隆入表达载体p ET32a,导入E.coli BL21(DE3),首次运用原核表达系统进行可溶性融合表达,亲和层析对重组蛋白进行纯化。用HPLC、SDS-PAGE和荧光底物Anthranilyl-Ala-Phe-Ala-Phe-Asp-Val-Phe(NO2)-Tyr-Asp对重组酶进行酶活鉴定。结果表明重组的内肽酶Asp N具有与标准品基本一致的酶切活性,能够较好地应用于生物和制药领域。     

重组酿酒酵母腺苷激酶的表达、纯化和鉴定

腺苷激酶 (adenosinekinase ,AK)是控制细胞中腺苷浓度的一种关键酶 ,在许多细胞和组织中发挥着重要的生理效应子作用。从酿酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)中克隆了腺苷激酶基因 (ak) ,并将其接入大肠杆菌pET16b表达质粒中进行表达。重组蛋白质经部分纯化后 ,测定其酶动力学常数 ,结果表明该酶对腺苷的Km 值为 (3.5± 0 .2 ) μmol L ,对ATP的Km 值为(10 0 .0± 11.0 ) μmol L ,对腺苷的kcat值为 (15 30± 2 0 )min- 1 ,对ATP的kcat值为 (14 4 8± 2 5 )min- 1 。该酶对其他核苷和脱氧核苷的Km 值测定数据表明 ,从酵母中克隆得到的该重组腺苷激酶具有较高的底物特异性。     

Expression,Purification and Characterization of Recombinant Human Angiogenin in Pichia pastoris

The potential of angiogenin (Ang) for clinical use has been highlighted in view of its important roles in inducing angiogenesis, facilitating cell proliferation, and inhibiting cell apoptosis. To produce soluble, correctly folded recombinant protein with a high yield, a DNA fragment encoding human Ang was inserted into eukaryotic expression vector pPIC9 and transformed into Pichia pastoris. The expression of recombinant human Ang (rhAng) accounted for about 70% of total secreted proteins. Purifying the Ang from the culture supernatant yielded 30 mg/L at 90% purity by chromatography with a SP Sepharose FF column. Biological assays indicated that rhAng can induce new blood-vessel formation, promote HeLa cell proliferation, increase Erk1/2 phosphorylation, and upregulate c-myc expression. Preparation of bioactive rhAng might lay the basis for further functional study, and might provide an effective strategy for large-scale production of soluble human Ang.     

毕赤酵母表达重组人白细胞介素11的纯化与鉴定

报道了毕赤酵母表达人白细胞介素11的下游工艺研究,并对其产物进行了分析鉴定。所用工艺流程为离心收集上清、超滤浓缩脱盐、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤。所得产物经SDSPAGE电泳、RPHPLC分析、N端和C端序列分析、质谱、等电点分析和生物学活性分析,结果表明：产品纯度大于97%,结构和性质与E.coli融合表达的Neumega完全一致。