2-卤代酸脱卤酶研究进展

2-卤代酸脱卤酶(EC 3.8.1.X)催化2-卤代酸脱卤水解形成相应的2-羟基酸。该类酶不仅能够降解环境中的卤代污染物,而且具有宽广底物谱和高效手性拆分特性,因而在环保和手性中间体的绿色合成中具有广阔应用前景。目前已经对多种2-卤代酸脱卤酶进行生化特性表征,并对酶分子三维结构及催化机制进行了深入研究。文中从2-卤代酸脱卤酶的来源、蛋白质结构与催化反应机制、催化特性及应用方面等研究取得的新进展进行综述,并展望了2-卤代酸脱卤酶的进一步研究方向。     

蛋白质水解酶和样品预处理优化技术在蛋白质组学研究中的应用

蛋白质组学是全景式鉴定、定量蛋白质,并研究蛋白质功能的学科。基于高分辨质谱的鸟枪法蛋白组学研究技术首先利用不同的位点特异性蛋白酶对复杂蛋白质样品进行酶解,进而利用质谱获得蛋白质相关的定性和定量信息。为了获得高质量的质谱信息,前期的样品处理和质谱数据采集同样重要。本文对蛋白组学中常用的Trypsin、Lys-C、Glu-C等位点特异性蛋白酶的酶切特点进行了总结,并综述了目前常用的几种酶切组合策略和样本预处理技术在提高蛋白质组学研究效率中的作用。     

牦牛骨蛋白的酶解条件研究

以蛋白质水解度为评价指标,辅以固形物溶出率,比较了中性蛋白酶、菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶对牦牛骨蛋白的水解效果,研究了酶用量、料液比(底物浓度)、酶解时间对水解度的影响,采用正交试验对酶解条件进行了优化。结果显示,木瓜蛋白酶是牦牛骨蛋白水解的适宜催化剂。在一定条件下,样品水解度随酶用量和酶解时间的增加而增大,底物浓度过低或过高均不利于原料中蛋白质的酶解。木瓜蛋白酶水解牦牛骨蛋白最佳条件为:酶解温度60℃,酶解时间8 h,酶用量3500 U/g蛋白质,料液比1:25(g:m l)。     

辐射过程中耐辐射奇球菌蛋白酶变化的检测与分析

采用明胶和酪蛋白底物酶谱法以及荧光酪蛋白底物对紫外线以及γ射线辐射后恢复期耐辐射奇球菌R1(Deinococcus radiodurans R1,DRR1)的蛋白酶变化进行了检测。结果发现,DRR1存在高活性大分子量组成性表达蛋白酶,与Karlin等［16］提出的DRR1蛋白酶为预测高表达蛋白(PHX)的设想一致。DRR1包含大量分子量大于140kD 的明胶降解酶和分子量大于120kD的酪蛋白降解酶,其中活性最高的174kD明胶酶在经SDS变性处理后仍有较高活性,该蛋白酶在DRR1受紫外线辐射和电离辐射后恢复期的表达模式存在差异,在γ射线电离辐射过程中以及电离辐射后恢复的晚期活性较高。此外,还发现一些蛋白酶特异性由辐射所诱导,表明这些蛋白酶可能参与细胞信号通路中蛋白的顺序降解,也提示DRR1损伤修复过程中细胞内存在一个精确的蛋白酶系统。这些蛋白酶的表达与细胞的营养状态相关。同时对一株由本实验室从北京地区土壤中分离到的杆状耐辐射菌RR533.2的明胶和酪蛋白蛋白酶谱进行了测定,结果发现其蛋白酶谱与DRR1相类似。     

鲜鹿茸酶降解过程的研究

研究了胰蛋白酶、Alcalase 碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶对鲜鹿茸的降解过程,确定了优化降解工艺条件,具有一定的理论意义和实践价值。确定了Alcalase 碱性蛋白酶的降解效率最高,通过单因素实验确定了降解过程中底物浓度、酶解温度、pH值和酶解时间为影响鲜鹿茸降解率的主要因素。正交试验确定最佳的酶解条件为:底物浓度0.08 g/ml、酶解温度65 ℃、pH 9.0、酶解时间6.0 h。在此条件下,鲜鹿茸降解率高达92.6%,氨基酸产品收率达12.1%。     

yapsin蛋白酶家族研究进展

yapsin蛋白酶是一类糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定的天冬氨酸蛋白酶,能特异性地切割底物中的单或双碱性氨基酸残基位点,起着加工前肽的作用。近年来研究发现,工程菌表达某些外源蛋白时发生的降解现象与yapsin蛋白酶有紧密的关系。概述了yapsin蛋白酶家族的命名、结构、定位、酶原激活、基因表达及底物特异性和功能。     

半胱氨酸蛋白酶IdeS的原核表达、纯化及活性鉴定

酿脓链球菌来源的免疫球蛋白G降解酶 (immunoglubulin G-degrading enzyme of Streptococcus pyogenes, IdeS) 是一种典型的半胱氨酸水解酶,可以在抗体铰链区的特定位点进行酶切,使IgG水解为完整的 F(ab)₂片段和Fc片段,由于其独特的酶活特异性和高活性,IdeS可以作为工具酶应用于IgG的亚单位制备、结构分析及表征分析.利用双标签 (GST-tag及His₆-tag) 表达系统在E.coli中高效表达了可溶性重组蛋白酶GST-IdeS-His₆,并在IdeS的氨基端与GST之间加上肠激酶酶切位点,以利于标签的去除.再利用亲和层析的纯化方法对目的蛋白进行纯化.使用SDS-PAGE、HPLC-SEC、LC-MS对纯化后的IdeS进行分析和鉴定.结果表明:本系统所表达的蛋白酶IdeS得率高,每1L菌液纯化可获得约25mg纯度为90%以上的蛋白酶IdeS,将此蛋白酶与抗体IgG以1:100 (m/m) 比例混合,于37℃反应30min,即可酶切完全.能够满足蛋白质结构分析中对蛋白酶的高质量要求,并且适用于抗体类药物的表征分析.同时,蛋白酶IdeS也可以应用于生物仿制药、生物改良药和新一代抗体以及Fc-融合蛋白的研究.     

细菌体内的蛋白质降解

摘要:为了适应多变的外界环境,细菌利用蛋白降解来清除体内不需要的蛋白质。AAA+蛋白酶降解机制在细菌蛋白质质量控制系统中发挥重要作用,而在放线菌中发现的蛋白酶体揭示了原核生物体内一个崭新的蛋白质降解机制。蛋白酶只识别携带降解决定子的底物,确保了蛋白质降解的特异性,除此之外细菌还通过一些其他方式调控蛋白质的降解与否。随着真核生物体内泛素依赖的蛋白酶体降解途径的发现,蛋白质降解过程参与调控机体生理活动的功能也逐渐为人所知。研究发现,蛋白质降解参与调控细菌的生长、分化,并与细菌的应激反应以及毒力等相关。本文将对细菌中存在的AAA + 蛋白质降解机制,包括其结构、对底物的降解过程及其生理功能等进行阐述。     

猪血红蛋白的酶解及氨基酸含量的研究

猪血是一种营养价值高而价格低廉的蛋白质资源.猪血中含有丰富的蛋白质,其中血红蛋白占主要部分.因此,对血红蛋白及其水解产物的研究受到了国内外众多学者的关注.为选出适合于水解猪血红蛋白的蛋白酶,笔者采用碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶对猪血进行单酶和复合酶水解试验,确定碱性蛋白酶为水解猪血的适用酶.通过质谱仪测定,碱性蛋白酶酶解产物分子量集中在800～2400道尔顿,而800～1260道尔顿区间占主要部分;经全自动氨基酸分析仪测出其产物含有17种氨基酸,其中含8种必需氨基酸,必需氨基酸占总氨基酸量的50.93%,说明碱性蛋白酶酶解产物是制作食品和饲料添加剂的理想资源.     

棉花病菌Xanthomonas campestris pv.malvacearum的一种具特异肽键专一性的胞外蛋白酶的纯化与鉴定

棉花病原体Xanthomonas campestris pv.malvacearum在酪蛋白(脱脂奶)存在下生长时产生胞外蛋白酶活性,其中至少包含3种蛋白酶,表观分子量分别为29(蛋白酶-1)、38和43kD。 蛋白酶-1被纯化,其最适pH在5.5～7.5之间。抑制研究表明蛋白酶-1可被Phosphoramidone、EDTA及1,10-邻二氮杂菲抑制,然后用锌离子温育重新激活,说明这是一个金属蛋白酶。发现蛋白酶-1特异地裂解肽链的天冬氨酸残基或半胱氯酸残基的氨基端侧,这种高度的肽键专一性预示这个酶在蛋白质链顺序分析中及由较大蛋白质制备特定多肽方面可能十分有用。     

微嗜酸寡养单胞菌中的漆酶对黄曲霉毒素B1降解脱毒的生物活性（英文）

【目的】探究微嗜酸寡养单胞菌中的漆酶对AFB1的降解活性,并确定漆酶在菌株CW117降解代谢AFB1过程中的贡献。【方法】从微嗜酸寡养单胞菌基因组中,共筛选到两个漆酶基因lc1和lc2,并用大肠杆菌BL21外源表达蛋白r LC1和r LC2,在体外检测其对AFB1的降解活性。同时参考前人报道,研究了氧化性辅剂对漆酶AFB1降解的促进作用。在体外实验基础上,利用自杀质粒p K18mobsac B,以同源重组方法构建了两株漆酶缺失株CW117~(?lc1)和CW117~(?lc1-lc2),验证了漆酶基因(lc1和lc2)对AFB1体内降解作用。【结果】体外实验显示,重组酶r LC1具有AFB1降解活性,氧化性辅剂ABTS、AS或SA可显著地提高r LC1降解活性,但r LC2未显示降解活性。突变株CW117~(?lc1)和CW117~(?lc1-lc2)对AFB1仍显示了较高的降解活性,且在大多数降解时间点与野生株CW117无显著差异。【结论】微嗜酸寡养单胞菌CW117菌株中,LC1在体外显示了AFB1的降解活性,且降解活性可以被氧化性辅助因子增强,LC2未显示体外降解活性;体内试验发现,漆酶基因lc1和lc2对菌株CW117降解AFB1的贡献较小,该菌株还存在其他降解途径。     

扇贝边蛋白资源酶法水解条件的优化

以扇贝边为原料,首先分析了其营养成分,结果表明,扇贝边干物质中蛋白质的含量为67.6%。然后用ASI,398枯草杆菌中性蛋白酶通过液体发酵对扇贝边蛋白资源进行了酶解条件优化,实验了酶解温度、酶的用量、酶水解时间和底物浓度等4因素对酶解效率的影响,确定了扇贝边的最佳水解条件:即酶解温度为50℃,蛋白酶的加入量为0.5%,即250U·ml^-1,底物浓度为6%,酶解时间为3h。     

鼠源胰岛素降解酶的原核表达及活性检测

胰岛素降解酶是维持体内糖代谢平衡和蛋白质稳态的关键蛋白质,也是2型糖尿病及阿尔茨海默病临床药物的重要靶点.本研究构建了野生型鼠源胰岛素降解酶的大肠杆菌ppSUMO表达系统,并完成了鼠源胰岛素降解酶的表达纯化及功能测定.采用ppSUMO表达系统得到的融合蛋白具有组蛋白标签和ULP1酶切位点,通过ULP1酶对亲和纯化得到的...     

组织蛋白酶B在水生动物中的研究进展

组织蛋白酶B(cathepsin B,CB;EC 3.4.22.1)是组织蛋白酶超家族中特殊的一员,为同时具有肽链内切酶和羧基二肽酶活性的半胱氨酸蛋白水解酶。虽然组织蛋白酶B广泛存在于各种动植物及细菌病毒中,但对水生动物的研究表明,不同物种组织特异性并不完全相同。现综述水生动物中CB基因及蛋白结构特性、表达及功能和CB与其他酶类的相互作用。水生动物中的CB行使多方面的功能,如参与卵巢卵母细胞的发生、胚胎形成及发育、水生软体动物幼虫发育、肠道中蛋白质的降解以及免疫过程等等。     

1株枯草芽胞杆菌的鉴定及其弹性蛋白酶结构研究

鉴定弹性蛋白酶产生菌株EL32,确定该酶的基本结构。采用分子生物学、形态学及生理生化性质对菌株EL32进行鉴定;用硫酸铵沉淀、离子交换层析和分子筛层析纯化酶蛋白;借助肽指纹图谱及酶基因克隆技术研究该酶的一级结构;利用同源建模的方法研究该酶的空间结构。菌株EL32的16S rDNA与枯草芽胞杆菌16S rDNA的同源性达到99%,其菌落呈乳白色,其细胞革兰染色阳性,具有芽胞;发酵葡萄糖试验产酸不产气,明胶水解试验呈阳性,能够水解淀粉,V-P反应呈阳性,鉴定为枯草芽胞杆菌。从菌株BL32发酵液中纯化得到了弹性蛋白酶,SDS-PAGE分析显示其分子量为31 ku。用LTQ-MS测定肽指纹图谱表明该弹性蛋白酶是枯草芽胞杆菌蛋白酶subtilisin,该酶的基因和蛋白质序列与枯草芽胞杆菌蛋白酶subtilisin的同源性都高达99%。菌株EL32弹性蛋白酶的三维结构含有6个α-螺旋,7个扭曲的平行β-折叠以及2个反平行的β-折叠,His、Asp和Ser是其活性中心的关键基团。鉴定了1株产弹性蛋白酶的枯草芽胞杆菌,确定了其弹性蛋白酶是蛋白酶subtilisin,为该枯草芽胞杆菌蛋白酶的应用提供了基础。     

产业纵横

表面活性剂改善蛋白质鉴定 ProteasMAX表面活性剂增强了在制备质谱或液相色谱分析用的胰蛋白酶和其它蛋白酶的酶促性能。该表面活性剂使科学家能够在蛋白质分析以前获得更完全的消化,在更短的时间内获得更精确的数据,并且降低样品降解的风险。通过暴露由于二级或三级结构一般接触不到的酶切位点,该产品改善了蛋白质的消化作用;     

一株能降解牛奶中过敏原αs1-酪蛋白的蛋白酶产生菌的筛选、鉴定及免疫学研究

从牛奶场附近土壤中筛选得到1株能降解牛奶过敏原蛋白（αs1-酪蛋白）的菌株ExiguobacteriumBBE201110,能产分子量约为55kDa的蛋白酶,酶活达到346．48U／mL,对该酶降解牛奶过敏原（asl．酪蛋白）效果进行免疫学研究（Westernblot）表明,在牛奶中添加4％的酶溶液进行降解20min,酪蛋白特异性清除显著,过敏原蛋白αs1酪蛋白浓度明显的降低。本实验筛得降解牛奶过敏原蛋白（αs1-酪蛋白）的菌株并成功纯化出蛋白酶,具有一定的食品工业开发价值及商业应用潜力。     

胰蛋白酶镜像酶LysargiNase的开发及其在蛋白质组学研究中的应用

蛋白质组学是系统鉴定、定量蛋白质及其翻译后修饰形式,并研究这些蛋白质生物学功能的学科。目前,基于质谱的鸟枪法蛋白质组学技术是蛋白质组学研究的主要手段之一,其技术流程是先将蛋白质组样品经位点特异性蛋白酶消化形成肽组,再进行高效液相色谱分离和质谱检测。而位点特异性蛋白酶对蛋白质样品的消化是质谱检测的前提和基础。随着蛋白质组学研究的深入,多种位点特异性蛋白酶被先后开发利用;而切割发生在相应氨基酸的N端,与传统的C端蛋白酶互为镜像的蛋白酶的鉴定、开发、特性研究和广泛使用更是为蛋白质组学研究提供了新的工具。文中对最近发现的胰蛋白酶的镜像酶——赖氨酸精氨酸N端蛋白酶(LysargiNase)的特点及其应用进行综述,为国内外学者更加广泛的使用创造条件。     

枯草杆菌蛋白酶基因工程的研究进展

本文介绍了枯草杆菌蛋白酶(Subtilisin)的研究现状,即利用定位诱变和体外重组等技术改变酶的性质,包括催化活性、底物特异性、稳定性、低温适应性以及酶在有机相中的性能等。对枯草杆菌蛋白酶的成功改造不仅有可观的商业价值,而且为蛋白质工程的发展作出了重要的贡献 。     

蛋白质聚集的形成与调控机制

大肠杆菌是外源蛋白质的首选表达系统,但蛋白质易被宿主细胞蛋白酶降解或聚集形成包含体。包含体与淀粉样蛋白纤维的形成过程相似,都依赖于特异性氨基酸序列的分子间相互作用。因此,淀粉样蛋白质抗聚集的方法也可用于防止细菌表达蛋白质的聚集。另外,基于序列的新型方法也能调节蛋白质聚集。