不结球白菜Ty1-copia类逆转座子序列的克隆及表达

参照Ty1-copia类逆转座子逆转录酶的保守区设计简并引物,分别从10个不结球白菜(Brassica campestris ssp.chinensis)品种的全基因组中均扩增出260 bp左右的目标条带. 将目的条带回收、克隆和测序后进行分析,DNAstar分析发现,这些序列存在高度的异质性,28个核苷酸序列变化范围为224～278 bp,同源性范围为16.7%～83.0%.28条序列通过核苷酸聚类分为8个家族.推导氨基酸序列有移框突变、终止子突变或二者兼有;与已登录的不同物种同一类型逆转录酶氨基酸系统进化树分析表明,不结球白菜Ty1-copia类逆转座子与芥菜型油菜、拟南芥、芜菁、甜菜可能有共同的起源.半定量和实时定量PCR检测表明,水杨酸(salicylic acid)和Peronospora parasitica均能激活不结球白菜Ty1-copia类逆转座子,逆转座子在不结球白菜叶片中的表达特征说明它可能参与寄主对病原菌的抗性.     

节瓜Ty1-copia类逆转座子逆转录酶序列的克隆及比对

对8个节瓜（Benincasa hispida var.chieh-qua How）品系基因组DNA中的Ty1-copia类逆转座子逆转录酶核苷酸序列进行扩增,并对品系A39FA的29个克隆产物的核苷酸序列及翻译的氨基酸序列的系统进化和同源性进行了分析,还对29条氨基酸序列进行了比对。扩增结果表明：8个节瓜品系的基因组DNA中均包含长度约260 bp的逆转录酶核苷酸片段;从品系A39FA中获得的29条Ty1-copia类逆转座子逆转录酶核苷酸序列（CqRt1至CqRt29）的长度为247~267 bp,同源率为46.2%~98.1%,而它们的氨基酸序列同源率为26.7%~98.8%。序列分析结果表明：节瓜Ty1-copia类逆转座子逆转录酶核苷酸序列中碱基A、T、G和C的数量分别为65~96、47~92、45~74和32~49,所有序列均富含碱基A和T,AT/GC比为1.35~2.33;缺失突变是造成节瓜Ty1-copia类逆转座子逆转录酶核苷酸序列长度差异的主要因素,在序列长度和碱基组成方面的明显差异表明节瓜Ty1-copia类逆转座子逆转录酶核苷酸序列具有高度异质性。翻译后的氨基酸序列中有21条序列存在终止密码子突变、12条序列存在移框突变,表明Ty1-copia类逆转座子是节瓜基因组内序列重组的热点。通过聚类分析可将29个逆转录酶核苷酸序列分为5个家族（Family）,分别包括16、4、4、4和1条序列,其中Family 1可能是具有转座活性的逆转座子家族,但存在转录活性的逆转录酶序列仅占全部序列数量的20.69%。将每一家族中的1~2条序列与其他15种植物的Ty1-copia类逆转座子逆转录酶的氨基酸序列进行比对,显示出较高的同源性。研究结果表明：节瓜与其他植物的Ty1-copia类逆转座子可能有相同起源,而且Ty1-copia类逆转座子可在不同类群间横向传递。     

不结球白菜热激蛋白基因克隆及表达

从不结球白菜'暑绿'中克隆到一个受热激诱导的小分子量热激蛋白(sHSP)基因,命名为BcHSP(DDBJ登录号为AB367955),该基因核苷酸序列全长722 bp,编码157个氨基酸,与芜菁、芥蓝、拟南芥等有90%以上的相似性.实时定量检测表明,不结球白菜BcHSP转录表达受热激诱导,以叶片中表达量最高,BcHSP在不结球白菜叶片中表达特征说明它可能与植物叶片的耐热性关系更为密切.     

不结球白菜BcTuR1基因的克隆及表达

从不结球白菜抗芜菁花叶病毒(TuMV)品种‘短白梗'中克隆到一个抗TuMV相关基因,命名为BcTuR1(GenBank登录号FJ600374).该基因核苷酸序列全长1 019 bp,编码162个氨基酸.BcTuR1基因与芥菜抗病毒基因相似性最高为96%,其它没有与该基因相似性高于50%的序列.基因组DNA杂交表明,BcTuR1可能属于一个较小的多基因家族.实时定量PCR检测表明,芜菁花叶病毒能够诱导不结球白菜BcTuR1基因的转录表达,其在不结球白菜叶片中的表达特征说明它可能参与寄主对病毒的抗性.     

不结球白菜BcTuRsO基因的克隆及表达

从不结球白菜抗病品种短白梗中克隆到一个抗芜菁花叶病毒(TuMV)相关基因,命名为BcTuRsO(Gen-Bank登录号FJ600376).该基因核苷酸序列全长650 bp,编码194个氨基酸,与已克隆的抗病基因有不同程度的同源性.系统进化树分析表明,该基因在不同物种之间具有保守性.基因组DNA杂交表明,BcTuRsO基因可能以单拷贝形式存在,其表达是组成型的.实时定量PCR检测表明,芜菁花叶病毒能够诱导不结球白菜BcTuRsO基因的转录表达,其在不结球白菜叶片中的表达特征说明它可能参与寄主对病毒的抗性.     

不结球白菜PR4蛋白基因的克隆与诱导表达分析

从不结球白菜抗病品种‘苏州青’中克隆到一个受SA和病原菌诱导的病程相关蛋白4(PR4)基因,命名为BcPR4(DDBJ登录号:AB325873),该基因核苷酸序列全长593 bp,编码140个氨基酸,与其它植物的PR4蛋白基因具有较高的相似性。系统进化树分析表明,该基因在不同物种之间具有保守性。基因组DNA杂交表明BcPR4属于多基因家族。实时定量PCR(qPCR)检测表明,SA和Peronospora parasitica均能诱导不结球白菜BcPR4转录表达,BcPR4在不结球白菜叶片中的表达特征说明它可能参与寄主对病原菌的抗性。     

不结球白菜BcMPK4基因的分离及表达

为了进一步探讨植物MAPKs(mitogen-activated protein kinases)在植物防卫中的作用,该研究从不结球白菜抗病品种‘苏州青’中克隆到一个抗核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)相关基因,命名为BcMPK4(DDBJ登录号AB557751)。该基因核苷酸序列全长1 334bp,编码373个氨基酸,与已克隆的MPK4基因有不同程度的相似性。系统进化树分析表明,该基因在不同物种之间具有保守性。基因组DNA杂交表明,BcMPK4可能属于一个较小的多基因家族,属组成型表达。实时定量PCR检测表明,核盘菌能够诱导不结球白菜BcMPK4基因的转录表达;BcMPK4基因在不结球白菜叶片中的表达特征说明它可能参与寄主对核盘菌的抗性。     

水稻双子房突变体中类copia逆转座子同源序列的研究

以水稻双子房突变体的总ＤＮＡ为模板,用简并引物扩增类ｃｏｐｉａ逆转座子的逆转录酶区域。从ＰＣＲ产物中分离到代表３个不同的类ｃｏｐｉａ逆转座子的片段,其中两个在水稻（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．）品种“窄叶青８号”和“京系１７”间产生的多态性杂交带分别定位于水稻７条染色体的９个位点。Ｒ３３－８含大量的终止码,Ｒ３３－１及Ｒ３３－４为连续的编码区,推测的氨基酸序列含８１个氨基酸残基。Ｒ３３－１的拷贝     

苹果Ty1-copia类逆转座子家族鉴定及特性分析

根据逆转座子RT保守序列设计引物,利用PCR方法从苹果'嘎拉'中克隆了20条RT片段,分析苹果基因组内Ty1-copia类逆转座子家族特性及进化关系.结果显示,20条逆转录酶保守序列表现出了高度的异质性.结合已报道的37条苹果Ty1-copia类逆转座子RT片段,构建了系统发育树,发现家族1、3和4中具有转座活性的逆转座子的可能性较大;序列分析表明,Ty1-copia类逆转座子是苹果基因组内序列重组的热点.用RT序列为探针进行Southern杂交,发现苹果基因组内Ty1-copia类逆转座子拷贝数高、分布广泛.研究结果为进一步分离具有转座活性的苹果Ty1-copia类逆转座子及其人工诱导芽变奠定了基础.     

不结球白菜晚抽薹BcFLC3基因的克隆及表达分析

根据大白菜BcFLC3基因(GenBank登录号AY036890.1)保守域序列设计引物,扩增不结球白菜晚抽薹BcFLC3基因的核心片段,结合RACE技术获得该基因1 017 bp的全长cDNA序列.序列分析结果表明,该cDNA包含完整开放阅读框,编码197个氨基酸的蛋白质,其分子量为21.62 kD,等电点9.36.荧光定量 PCR分析表明,不结球白菜经4℃低温处理后,BcFLC3基因在叶片中的表达量抽薹前明显高于抽薹后;低温处理后BcFLC3基因在不同部位的表达量存在明显差异,表达量由高到低依次为叶、茎、花蕾、花和根.Southern杂交结果表明,BcFLC3基因在不结球白菜基因组中为多拷贝.     

东乡野生稻基因渐渗系中逆转座子逆转录酶序列的克隆及表达分析

以东乡野生稻(Oryza rufipogon)耐冷渐渗系IL5335、IL5243及其双亲为试材, 克隆到75条存在高度异质性的Ty1-copia类逆转座子逆转录酶序列, 经聚类分析将这些逆转录酶序列分为7个家族; 家族6和7含有65条逆转录酶序列, 序列间的相似性为44.9%–99.3%; 家族1–5仅含10条逆转录酶序列, 其中8条来源于耐冷渐渗系, 它们与亲本的序列相似性为29.2%–52.8%, 分析发现这些序列曾发生缺失或插入突变。实时荧光定量PCR检测结果显示, IL5335和IL5243中的houba、osr15及osr17逆转录酶的表达量均远高于受体亲本(表达量增加1.50–5.07倍), 表明渐渗杂交诱发改变了IL5335和IL5243中逆转录酶序列的结构及其表达活性。该结果为今后水稻表观遗传学研究及外源优异基因利用奠定了基础。     

两个猪瘟病毒野毒株gp55基因抗原编码区序列的分析及比较

利用反转录－PCR方法扩增了吉林省猪瘟病毒（HCV）两个野毒株gp55基因的主要保护性抗原编码区,并将其克隆到pGEM－T载体中,然后用Sanger双脱氧法测定了其核苷酸序列,并推导了其氨基酸序列。将测定的这两个HCV野毒株的部分序列（350bp）与国内外已知的HCV序列进行比较,结果表明：这两个野毒株的核苷酸序列的同源性为94．9％,氨基酸序列同源性为97．4％,与1985～1992年意大利中部分离4个野毒株的同源性明显高于其它HCV毒株,核苷酸同源性分别为97．2％～98．3％和94.0％～949％,氨基酸同源性分别为98．3％～991％和97.4％～98.3％,而与我国的HCV标准强毒株即石门株的核苷酸同源性仅分别为83.1％和83.1％,氨基酸同源性仅分别为90.6％和91.4％。因此认为吉林省这两个野毒株与意大利中部的4个野毒株具有密切的关系,而与石门株很可能来源不同。     

BB染色体组野生种花生LTR反转录转座子RT基因的多样性分析

利用简并PCR技术从野生花生种(Arachis ipaensis Krapov. et W. C. Greg.)的基因组中扩增分离Ty1-copia类(1类)和Ty3-gypsy类(2类)反转录转座子RT基因,并对其序列特征、多样性、系统进化关系及转录活性进行分析。结果显示:对于1和2类RT基因,目的条带分别约为260和430 bp;分离获得了23和32条序列,长度范围分别为262～266、395～435 bp;AT所占比例分别为61.60%～69.17%和55.79%～61.34%;核苷酸序列间相似性分别为52.5%～98.9%和45.0%～98.8%,氨基酸序列间相似性分别为39.8%～100%和9.0%～97.2%。其中2类基因的异质性高于1类;1类和2类基因分别有3条和15条发生了无义突变,2类的无义突变发生率远高于1类。1类基因的保守基序保守性较高,2类的保守基序呈一定程度的变异。代表序列的蛋白质三级结构基本类似。聚类分析结果显示,1类和2类基因可被分为5个和6个家族。1类和2类基因都有部分序列与其他物种的RT基因序列亲缘关系较近,表明它们之间可能存在两类反转录转座子的横向传...     

不结球白菜BcDF1.2基因克隆与诱导表达

利用RACE技术,获得了不结球白菜防卫素基因全长序列,命名为BcDF1.2(DDBJ登录号AB302891).序列分析发现,BcDF1.2全长532 bp包含1个长度为96 bp的内含子区域,该基因编码79个氨基酸残基组成的蛋白质,与其他植物的防卫素基因和抗真菌蛋白基因有较高的同源性.系统进化树分析表明,该基因在不同植物间具有高度保守性.基因组DNA杂交表明BcDF1.2属于较小的多基因家族.水杨酸和霜霉病原菌诱导后,该mRNA不仅在诱导的叶片中转录表达增加,而且在未诱导的系统叶片中表达增加.BcDF1.2在不结球白菜叶片中的转录表达特点表明可能参与对霜霉病的抗性反应.     

不结球白菜乙烯响应因子基因的克隆与表达分析

采用cDNA-AFLP技术,以不结球白菜雄蕊突变系‘苏白2号’及其保持系花蕾为实验材料,分离出1条编码乙烯响应转录因子的基因,命名为NhccERF1。结果显示:(1)序列分析表明,NhccERF1基因长807bp,编码268个氨基酸。(2)RT-PCR分析发现,花期NhccERF1基因在花瓣、雄蕊及花柱中表达量均显著高于保持系。(3)实时定量荧光PCR(qPCR)发现,蕾期喷施乙烯(ET)能促进NhccERF1基因的表达,外施AgNO3抑制该基因表达。研究推测NhccERF1基因可能在雄蕊变异中发挥重要作用。     

不结球白菜细胞质雄性不育相关基因的克隆及表达

从不结球白菜CMS新种质中分离得到的一个cDNA-AFLP差异片段,采用RT-PCR和RACE技术成功克隆了一个α-微管基因的cDNA全长序列,命名为TUBA2(DDBJ登录号为AB445012)。序列分析结果表明,该基因全长1 709 bp,最大开放阅读框为1 353 bp,编码450个氨基酸序列,与已公布的α-微管基因有较高的同源性。系统进化树分析发现,该基因在不同植物间具有高度保守性。Southern杂交表明TUBA2属于不结球白菜多基因家族的一个单一克隆基因。实时定量RT-PCR检测表明,该基因在不育系中的表达量显著低于保持系,同时在不同组织和细胞减数分裂不同时期该基因的表达量也存在明显差异。     

22株猪圆环病毒2型安徽分离株全基因组遗传进化分析

为了解安徽地区猪圆环病毒2型(PCV2)的分子流行病学及流行毒株遗传变异情况,本研究应用DNA Star软件,针对22株PCV2安徽分离株和26株GenBank登录的PCV2参考毒株,进行全基因组核苷酸序列、ORF1和ORF2核苷酸序列及其推导的氨基酸序列的同源性分析,并运用MEGA 6.0软件构建系统进化树.结果显示,22株PCV2安徽分离株基因组全长均为1 767 bp,相互之间的核苷酸序列相似度为94.6％～99.8％,与GenBank登录的26株PCV2参考毒株之间的核苷酸序列相似度为92.4％～99.8％.PCV2安徽分离株的ORF1核苷酸序列及其推导的氨基酸序列与参考毒株之间的相似度分别为94.3％～100％和85.4％～100％,ORF2核苷酸序列及其推导的氨基酸序列相似度分别为85.9％～99.9％和76.9％～100％.ORF2编码的Cap蛋白氨基酸序列在8～30、44～91、121～140及190～224几个区域存在突变,且有部分变异位点位于抗原表位区.22株PCV2安徽分离株分布于两个基因亚型,8株属于PCV2b,14株属于PCV2d.结果表明,PCV2安徽分离株的全基因组核苷酸序列较稳定且彼此间亲缘关系密切.ORF2的变异程度远高于ORF1,PCV2d基因亚型己经逐渐过渡成为安徽地区的主要流行毒株.Cap蛋白氨基酸序列在免疫反应区域内的变异可能影响PCV2的免疫原性.本研究结果丰富了安徽地区猪圆环病毒病的分子流行病学资料,同时也为有效防控该病提供了一定的参考依据.     

Xenorhabdus nematophila BP杀虫毒素基因的序列分析及其杀虫活性

XnBP83是从Xenorhabdus nematophila BP基因组粘粒文库中筛选出的一个对棉铃虫有较强口服杀虫活性的克隆．采用亚克隆结合primer-walking DNA测序技术对粘粒XnBP83的插入片段进行序列测定．该插入片段全长38939bp,其中包括5个与杀虫活性相关的tc类基因xptA1、xptB1、xptC1、xptA2、xptD1．序列分析显示：a．插入片段中的xptD1不完整,与X．nematophila PMFI296 XptD1相应氨基酸序列有99％的相似性．b．BP xptA1读码框全长7569bp,编码2520个氨基酸,与PMFI296的XptA1氨基酸序列有98％的相似性,两者在第2200-2223氨基酸区域连续有23个氨基酸不同．c．BP xptB1读码框全长3051bp,编码1016个氨基酸,与PMFI296 XptB1氨基酸序列有98％的相似性,在第620-650氨基酸之间有28个氨基酸差异．d．BP xptC1读码框全长4225bp,编码1408个氨基酸,与PMFI296的XptC1氨基酸序列有96％的相似性．在BP的第232氨基酸后插入了一个TAQRYLAK的氨基酸序列,在第627-646氨基酸区域内,有18个氨基酸不同．e．BP xptA2读码框全长7574bp,编码2524个氨基酸,与PMFI296的XptA2氨基酸序列有90％的相似性,在BP品系XptA2的第788-855氨基酸和第1630～1784氨基酸有两个明显变异区．将XnBP83培养物上清和沉淀饲喂棉铃虫、甜菜夜蛾、斜纹夜蛾和粉纹夜蛾,结果表明XnBP83对所测昆虫有广谱杀虫活性．     

不结球白菜BcLRK01基因对芜菁花叶病毒及胁迫诱导的响应

通过cDNA-AFLP技术,从芜菁花叶病毒(TuMV)侵染的不结球白菜幼叶中分离到一条差异表达的基因片段,克隆获得其cDNA全长为2 124bp,编码707个氨基酸的富亮氨酸重复类受体激酶,命名为BcLRK01。利用实时定量PCR研究了该基因在TuMV侵染及高盐、冷胁迫、水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)、乙烯(ET)等处理下的表达情况,结果显示,TuMV侵染、高盐、冷胁迫、SA、JA和ET等均能诱导BcLRK01不同程度的表达,说明该基因可能是不结球白菜病毒病的病程相关基因,同时也参与高盐和冷胁迫以及SA、JA、ET等的信号途径。     

UK114基因的克隆和表达载体的构建

山西农业大学生命科学学院常泓、中国农业大学食品学院南庆贤、山西农业大学动物科技学院岳文斌三位科学工作者采用PCR法扩增得到重组UK114cDNA序列将其克隆于T-easy载体并进行了序列测定与分析．结果表明：该序列全长1017bp,有一个开放的阅读框（40nt-450nt）,可编码137个氨基酸（14．2KDa）,与UK114的序列比较,同源性为91％,突变的86个核苷酸中都为无义突变,开放阅读框中仅有一个核苷酸突变。他们在实验中构建了pBV114表达载体,选择阳性克隆提取质粒进行酶切,用琼脂糖检测获得的1kb和3．7kb的两个片段。[第一段]